調環酸鈣協同硝酸鈣控制采后富士蘋果苦痘病

彭 勇，王君曉，馬玉榮，劉 佩，王慶國*

（山東農業大學食品科學與工程學院，國家蘋果工程技術研究中心，山東 泰安 271018）

蘋果苦痘病是發生在成熟期及其貯藏過程中的一種生理性病害，其癥狀是果實的花萼端外皮層局部凹陷，形成褐色的斑點，果肉組織死亡，造成果皮組織凹陷[1-3]。蘋果苦痘病顯著影響蘋果的貯藏品質和商品價值，造成巨大的經濟損失，制約了蘋果產業的發展[4]。

許多學者發現蘋果苦痘病與組織鈣元素失調，尤其是與缺鈣有關，其病癥的發生常伴隨果實的低鈣含量[1]。然而，近年來的研究發現，較低的總鈣含量與苦痘病的發生率不完全正相關[4-5]。而苦痘病的發生卻與果實內部水溶性鈣、果膠鈣、磷酸鈣等各種形態鈣在細胞內的分布及轉化有關。陳見暉等[3]研究發現蘋果貯藏期間，生理活性鈣（水溶性鈣和果膠鈣）向非生理活性鈣（磷酸鈣和草酸鈣等）的無效化轉變是導致果實生理失調的重要原因之一。鈣作為細胞內的重要組分及調節物質，有著重要的生理功能，細胞內調節鈣的物質都有可能與苦痘病的發生有關[6]。Falchi等[4]研究發現，脫落酸處理可降低蘋果果實苦痘病的發病率，并且能夠降低鈣反向轉運體、鈣依賴蛋白激酶、焦磷酸酶等鈣相關酶的基因表達。因此，為了預防蘋果苦痘病的發生，鈣的調控仍是當前研究的熱點之一。

外源鈣處理在改善果實抗病性方面具有重要作用。硝酸鈣是一種含有硝態氮的鈣肥，可以快速補充樹體內鈣素的缺乏，有利于提高果實的硬度、改善品質。生產上，采前施用硝酸鈣可以增加果實組織中的鈣含量，預防采后蘋果苦痘病的發生[7-8]，裴健翔等[9]研究發現，采后浸硝酸鈣處理也可以提高蘋果的硬度，抑制多聚半乳糖醛酸酶的活性和纖維素的降解，維持果實較高的品質。調環酸鈣作為一種新型植物生長調節劑，可以抑制赤霉素（gibberellin，GA）的合成，抑制GA19和GA20的活性，抑制莖和葉片的生長，并使植物具有較好的抗病害能力[10]。在對葡萄的研究中發現，調環酸鈣可以抑制葡萄樹梢的生長，縮短節間長度，并且可以抑制葡萄果實的膨大[11-12]。Freitas等[13]通過GA和調環酸鈣噴灑番茄實驗發現，噴灑GA的果實，100%患蒂腐病，質外體中的水溶性鈣含量低，膜質裂解程度高；而噴灑調環酸鈣的果實，蒂腐病的發病率降低，質外體中的水溶性鈣離子含量更高。然而，對于調環酸鈣調控蘋果苦痘病的研究較少，對于調環酸鈣復配鈣離子調控蘋果苦痘病也鮮有報道。

本研究以苦痘病發病率較高的富士蘋果為試材，利用采后水壓浸鈣方法，通過調環酸鈣、硝酸鈣等處理，探討調環酸鈣協同硝酸鈣控制蘋果苦痘病的原因。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

實驗用富士蘋果于2016年10月23日采購于山東省威海市文登區管理良好的果園，果實九成熟、全紅，達到商品采收標準。采摘后，當天晚上運回實驗室，挑選大小均勻、無機械傷、無病蟲害的果實用于實驗處理。

1.2 儀器與設備

TU-1810PC紫外-可見分光光度計 北京普析通用儀器有限責任公司；AA-7200原子吸收分光光度計 日本島津公司；DW-HL388超低溫冰柜 中科美菱低溫科技有限責任公司；PAL-1數顯折光儀 日本ATAGO公司；FDK30硬度計 美國WAGNER公司；Allegra 64R高速冷凍離心機 美國Beckman有限公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品準備

將蘋果隨機分為4 組，分別用清水（對照）、調環酸鈣（80 mg/L）、硝酸鈣（7.08 g/L）、80 mg/L調環酸鈣結合7.08 g/L硝酸鈣進行處理（質量濃度的選擇根據相關文獻及先前的水壓浸鈣結果）；為了保證鈣離子快速滲透至果實內部，實驗采用水壓浸鈣的方式，水壓裝置為直徑20 cm、高4.5 m的供水管，水深3 m，處理時間為1 min。浸鈣處理結束后用紙擦干果實表面，放置紙箱內，紙箱內附有聚乙烯保鮮袋，折口于20 ℃貯藏，于處理后0、2、6、15、25 d和40 d觀察取樣，并測定各指標。

用于統計苦痘病發病率的果實，每個處理3 個重復，每個重復30 個果實。用于硬度和可溶性固形物質量分數測定的果實，每個處理測定18 個，每個果實測定2 次。測定其他指標時，于每個取樣時間點取18 個果實，分別用削皮刀取蘋果果皮內側的外皮層1～2 mm部位，混合均勻，迅速放置液氮中冷凍，-80 ℃貯藏。

1.3.2 苦痘病發病率和患病指數的測定

發病率以苦痘病發病的數量占總數量的比例來表示。

果實患病級別：按果面的病斑個數將果實患病級數分為6 個級別，病斑個數為0、1～5、6～10、11～15、16～20 個和多于20 個時，分別對應果實的0、1、2、3、4、5 級。患病指數按公式（1）計算。

1.3.3 外皮層鈣含量的測定

總鈣含量的測定參照汪良駒等[14]的方法，稱取5 g樣品，烘干至恒質量，準確稱取0.4 g干樣，加入10 mL消化液（V（濃硝酸）∶V（高氯酸）＝4∶1）過夜消化，放置電爐上加熱使樣品消解，加入0.5 g/100 mL氧化鑭溶液，搖勻，濾液存入10 mL的離心管中，用于總鈣含量的測定。采用原子吸收分光光度計測定總Ca含量。

不同形態鈣含量的測定參照龔云池[15]和陳見暉[3]等的方法，準確稱取0.5 g凍樣于15 mL離心管中，勻漿后浸提12 h，4 ℃、10 000hg離心10 min，吸取上清液，過濾后用于水溶性鈣含量的測定。將殘渣按上述步驟用10 mL 1 mol/L NaCl、10 mL體積分數2%冰醋酸溶液、10 mL體積分數5%鹽酸溶液分別逐級浸提得到果膠鈣、磷酸鈣和草酸鈣，采用原子吸收分光光度計測定各中形態的鈣含量。

1.3.4 ABTS陽離子自由基清除能力的測定

稱取0.5 g樣品加入5 mL、體積分數95%乙醇提取，25 ℃超聲30 min，11 000hg離心10 min后取上清液備用。將30 μL樣品加入3 mL 2,2’-聯氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)（2,2-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid)，ABTS）工作液（7 mmol/L ABTS溶液與4.9 mmol/L過硫酸鉀溶液按體積比1∶1混合），再將工作液分為兩部分，一部分黑暗條件保存約12～16 h，測定其在734 nm波長處的吸光度（At）；另一部分20 ℃避光反應5 min后，測定其在734 nm波長處的吸光度（Ai），對照用乙醇代替ABTS（A0）。ABTS陽離子自由基清除率按公式（2）計算。

1.3.5 超氧化物歧化酶活力的測定

超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活力的測定參照趙曉梅[16]的方法并略有改動，取1 g樣品，加入5 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.8），冰浴提取，在4 ℃下10 000hg離心20 min，上清液即為粗酶液。反應體系：1 mL磷酸鹽緩沖液、2.5 mL混合液（包括130 mmol/L甲硫氨酸、750 μmol/L氮藍四唑、100 μmol/L EDTA-2Na）、1 mL酶液。在反應體系中加入0.5 mL 20 μmol/L核黃素，置于日光燈下反應13 min，取出后置于暗處終止反應，于560 nm波長處測定吸光度（AE）。以不照光管作為空白參比，不加酶液組為空白對照組（ACK）。定義抑制氮藍四唑光化還原50%為一個酶活力單位。SOD活力按公式（3）計算。

式中：V表示測定樣品總體積/mL；m表示樣品質量/g；V1表示測定時樣品液用量/mL。

1.3.6 過氧化物酶活力的測定

過氧化物酶（peroxidase，POD）活力的測定參照李賢宇等[17]的方法并略有改動。準確稱量1 g樣品，加入1 mmol/L磷酸鹽緩沖液（pH 7.5），混勻后4 ℃下10 000hg離心20 min，上清液即為粗酶液。反應體系為2.5 mL反應液（含28 μL愈創木酚、19 μL過氧化氫）、1 mL酶液，對照以1 mL磷酸緩沖液代替酶液，測定反應體系470 nm波長處的吸光度，以每分鐘吸光度變化0.01為一個酶活力單位。POD活力按公式（4）計算。

式中：m表示樣品鮮質量/g；VS表示測定時取用酶液體積/mL；t表示反應時間/min；VT表示樣品總體積/mL。

1.3.7 丙二醛含量的測定

丙二醛（malondialdehyde，MDA）含量參照Duan Xuewu等[18]的方法并略有改動，準確稱取1 g凍樣，加入5 mL、質量分數5%三氯乙酸（trichloroacetic acid，TCA）溶液，4 ℃、10 000hg離心10 min。取1 mL上清液加入3 mL反應液（0.5 g/100 mL硫代巴比妥酸溶液、用10 g/100 mL的TCA溶液配制），放入沸水中煮沸20 min，冷卻后分別在532 nm和600 nm波長處測定OD值，MDA含量按照公式（5）計算。

式中：V表示上清液的體積/mL；V1表示測定時所用上清液的體積/mL；m表示樣品鮮質量/g。

1.3.8 硬度和可溶性固形物質量分數的測定

將不同時期取樣的蘋果削皮后，用FDK30硬度計測定赤道面果肉硬度，單位為kg/cm3。采用PAL-1數顯折光儀測定可溶性固形物質量分數。

1.4 數據處理

用Excel統計實驗數據，SigmaPlot軟件作圖，實驗結果以平均值±標準差表示。使用SPSS 22.0統計軟件進行方差分析，P＜0.05表示差異顯著。

2 結果與分析

2.1 調環酸鈣協同硝酸鈣處理對富士蘋果苦痘病發病率和患病指數的影響

圖 1 調環酸鈣協同硝酸鈣對富士蘋果苦痘病發病率（A）和患病指數（B）的影響Fig. 1 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on bitter pit incidence (A) and index (B) of Fuji apple

由圖1A可知，隨貯藏時間的延長，苦痘病發病率呈上升趨勢。貯藏期間，單一調環酸鈣處理果實發病率與對照組果實無顯著性差異（P＞0.05）。在貯藏后期，硝酸鈣處理及其結合調環酸鈣處理能顯著降低蘋果苦痘病的發病率。貯藏25 d時，硝酸鈣處理及其結合調環酸鈣處理的蘋果果實苦痘病發生率分別比對照組低21.67%和41.67%；貯藏至40 d時，硝酸鈣處理及其結合調環酸鈣處理組的發病率比對照組分別低15.62%和50.00%。上述結果表明，單一調環酸鈣處理對富士蘋果苦痘病沒有控制效果，硝酸鈣及其結合調環酸鈣處理控制苦痘病效果顯著，且調環酸鈣協同硝酸鈣復合處理效果最好。

由圖1B可知，隨著貯藏時間的延長，不同處理組間的果實苦痘病患病指數均呈現出整體上升的趨勢。在整個貯藏期間，單一調環酸鈣處理組果實苦痘病患病指數與對照果實無顯著差異（P＞0.05）。貯藏前25 d，果實的患病指數上升較快，同對照相比，硝酸鈣和調環酸鈣結合處理能夠顯著降低貯藏后期果實的患病指數（P＜0.05）。由此可見，單一調環酸鈣處理對降低富士蘋果果實苦痘病的患病指數沒有效果，采后水壓浸硝酸鈣和與調環酸鈣結合處理能夠有效降低貯藏期間富士蘋果果實的患病指數，且調環酸鈣協同硝酸鈣處理效果更好。

2.2 調環酸鈣協同硝酸鈣處理對富士蘋果總鈣含量的影響

圖 2 調環酸鈣協同硝酸鈣對富士蘋果外皮層總鈣含量的影響Fig. 2 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on total calcium content of Fuji apple

由圖2可知，隨貯藏時間的延長，富士蘋果外皮層中的總鈣含量呈上升趨勢。在0 d時（處理后取樣），各處理組外皮層的總鈣含量顯著高于對照組（P＜0.05），結果表明，浸鈣處理對增加外皮層中總鈣含量的效果明顯。在整個貯藏期間，硝酸鈣和結合處理的外皮層總鈣含量顯著高于其他兩組，且結合處理的外皮層中總鈣含量顯著高于硝酸鈣處理，表明調環酸鈣在外皮層中能夠協同硝酸鈣作用，促進鈣離子的吸收。

2.3 調環酸鈣協同硝酸鈣處理對富士蘋果水溶性鈣、果膠鈣、磷酸鈣和草酸鈣含量的影響

由圖3A可知，貯藏期間，富士蘋果外皮層中水溶性鈣含量呈上升趨勢。貯藏0 d時，各處理組水溶性鈣含量均顯著高于對照組（P＜0.05），以結合處理組水溶性鈣含量最高。貯藏25 d時，硝酸鈣處理組和結合處理組的水溶性鈣含量達到最高值，分別比對照高8.91、9.64 μg/g。單一調環酸鈣處理對增加外皮層中鈣含量的效果有限。

由圖3B可知，隨貯藏時間的延長，外皮層中果膠鈣含量呈上升趨勢。與對照組相比，整個貯藏期間，單一調環酸鈣處理顯著降低了外皮層的果膠鈣含量，而硝酸鈣和結合處理顯著提高果膠鈣含量，并且結合處理增加果膠鈣含量的效果顯著高于硝酸鈣處理；貯藏25 d時，結合處理組的果膠鈣含量比對照組高10%（P＜0.05）。由此表明，調環酸鈣能夠有效地協同硝酸鈣增加外皮層中的果膠鈣含量，從而有效維持果實的硬度。

由圖3C可知，貯藏期間，外皮層中磷酸鈣含量變化較小，這與劉劍鋒等[19]研究發現浸鈣對磷酸鈣含量沒有顯著影響的結果是一致的。幾種處理比較來看，以結合處理的磷酸鈣含量最低，而其他處理與對照差異不顯著，尤其是在貯藏后期。由圖3D可知，外皮層中草酸鈣含量整體呈先上升后下降趨勢，貯藏2 d時，硝酸鈣和結合處理提高草酸鈣含量的效果顯著高于對照，貯藏2～25 d期間，草酸鈣含量整體呈下降趨勢，以結合處理的草酸鈣含量最高，對保持草酸鈣含量效果最好。

圖 3 調環酸鈣協同硝酸鈣對富士蘋果外皮層中水溶性鈣（A）、果膠鈣（B）、磷酸鈣（C）和草酸鈣（D）含量的影響Fig. 3 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on water soluble calcium (A), pectin calcium (B), phosphate calcium (C)and oxalate calcium (D) contents of Fuji apple

2.4 調環酸鈣協同硝酸鈣處理對富士蘋果抗氧化活性的影響

由圖4A可知，貯藏0～6 d，蘋果外皮層ABTS陽離子自由基清除率呈現上升趨勢，貯藏6～25 d期間，ABTS陽離子自由基清除率保持相對穩定。單一調環酸鈣處理的蘋果外皮層ABTS陽離子自由基清除率顯著高于對照組，說明調環酸鈣處理對提高外皮層的抗氧化活性具有一定的效果。在整個貯藏期間，硝酸鈣處理和結合處理組的外皮層ABTS陽離子自由基清除率均顯著高于對照組（P＜0.05），且結合處理組的ABTS陽離子自由基清除率最高，表明調環酸鈣能夠協同硝酸鈣提高外皮層的抗氧化活性，降低果實遭受氧化應激損傷的可能性，保持膜的完整性。

由圖4B可知，隨著貯藏時間的延長，外皮層的POD活力呈現上升趨勢。貯藏25 d時，硝酸鈣處理和結合處理組蘋果外皮層POD活力均顯著高于對照組。除了第0天外，單一調環酸鈣處理組POD活力在貯藏期間與對照組差異不顯著。

由圖4C可知，隨著貯藏時間的延長，SOD活力呈先上升后下降的趨勢，且在貯藏2 d達到最高值。硝酸鈣處理和結合處理組的外皮層中SOD活力均顯著高于對照組，并且結合處理提高SOD活力的效果明顯高于硝酸鈣處理，但單一的調環酸鈣處理對外皮層SOD活力影響不明顯。貯藏后期，SOD活力逐漸降低，可能與細胞受到損傷導致的總抗氧化能力降低有關。

由圖4D可知，貯藏前期，蘋果外皮層MDA含量呈現上升趨勢，貯藏6～15 d，MDA含量快速增加，并且對照組和調環酸鈣處理組的果實MDA含量顯著高于硝酸鈣處理組和結合處理組，結合處理組的MDA含量最低，表明結合處理組的果實膜質氧化程度低，果實受到的氧化損傷小。

圖 4 調環酸鈣協同硝酸鈣對蘋果ABTS陽離子自由基清除率（A）、POD活力（B）、SOD活力（C）、MDA含量（D）的影響Fig. 4 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on ABTS cation free radical scavenging activity (A), POD activity (B),SOD activity (C), and MDA content (D) of Fuji apple

2.5 調環酸鈣協同硝酸鈣處理對富士蘋果硬度和可溶性固形物質量分數的影響

圖 5 調環酸鈣協同硝酸鈣對富士蘋果硬度（A）和可溶性固形物質量分數（B）的影響Fig. 5 Effect of prohexadione-calcium combined with calcium nitrate on firmness (A) and soluble solids content (B) of Fuji apple

由圖5A可知，與貯藏初期相比，貯藏15 d后對照組和調環酸鈣處理組硬度明顯下降，對照組和調環酸鈣處理組硬度下降近30%，而硝酸鈣處理及結合處理組蘋果果肉硬度在15 d內變化較小。這表明，硝酸鈣及結合處理能夠有效維持果實硬度，延緩果實衰老。

由圖5B可知，貯藏0 d，各處理組蘋果可溶性固形物質量分數有所差異，調環酸鈣處理和其與硝酸鈣結合處理組的可溶性固形物質量分數高于其他處理組，表明調環酸鈣在一定程度可提高富士蘋果可溶性固形物的質量分數，單獨硝酸鈣處理對可溶性固形物質量分數的影響不大。經過15 d貯藏，各處理組果實可溶性固形物質量分數降低，但各處理組之間沒有顯著性差異（P＞0.05），表明呼吸作用加速了糖類物質的消耗，導致可溶性固形物質量分數的下降。

3 討 論

鈣離子作為一種必需營養素，在調節植物的生理功能方面起著重要的作用，本研究發現調環酸鈣結合硝酸鈣處理可以顯著降低蘋果苦痘病的發病率和患病指數，效果好于單一硝酸鈣處理。并且，調環酸鈣結合硝酸鈣處理對于提高蘋果外皮層總鈣含量的效果更好。研究表明采后鈣離子處理可以提高果實中的鈣含量，降低苦痘病的發生率，鈣離子向細胞內的滲透是鈣含量增加的直接原因[20-21]。但是，即使細胞內有充足的鈣，仍有可能發生鈣缺乏癥，鈣離子在細胞內的分配和轉移至關重要。本實驗發現鈣處理后，蘋果生理活性鈣（水溶性鈣和果膠鈣）含量明顯增加，尤其是調環酸鈣結合硝酸鈣處理組生理活性鈣含量增加最為明顯，這與其他學者研究發現鈣離子可以增加果實內水溶性鈣含量、降低鈣缺乏癥的發生[3,22]的結果是一致的。并且，調環酸鈣結合硝酸鈣處理降低了外皮層中磷酸鈣含量，維持了較高的草酸鈣含量。磷酸鈣和草酸鈣作為非生理活性鈣，起到維持鈣庫穩定、解除毒害的作用，結合處理組中較低的磷酸鈣含量表明調環酸鈣和硝酸鈣結合處理可以維持鈣庫穩定，而較高的含量草酸鈣具有解毒作用。草酸鈣含量與果實內的有機酸密切相關，蘋果中含有較多的有機酸，會溶解細胞壁的中膠層，促使細胞裂解死亡，而鈣離子會和有機酸結合形成不溶性的鈣鹽沉淀，從而防止有機酸含量過高對細胞的損害，這可能是結合處理組中苦痘病發生率較低的原因之一[3]，但不同種類果實鈣處理的效果不同，王永博等[23]發現用硝酸鈣處理梨果實能夠增加果皮中草酸鈣含量，對磷酸鈣含量并沒有顯著性影響。

此外，鈣離子的分配和轉移涉及Ca-ATPases、Ca2+/H+轉運體、Ca2+通道等的作用[24-25]，研究發現GA處理可以延長果蔬的貯藏期[26-27]，但GA誘導了較高的Ca-ATPases基因表達和活力，影響鈣的分配和轉移，增加了臍腐病的發生率[13,28]，而調環酸鈣作為GA的抑制劑，降低了番茄臍腐病的發生率，主要原因是增加了鈣離子的吸收和水溶性鈣的含量，降低了Ca-ATPases基因表達，減少了質膜損傷[13]。雖然，研究表明采前葉面噴施調環酸鈣對降低苦痘病的發生率有一定效果[29]，但本實驗的結果發現單一調環酸鈣預防富士蘋果采后苦痘病的效果并不理想，對于調環酸鈣抑制蘋果苦痘病的機理還需要進一步的研究。

研究表明，果蔬采后鈣離子處理可以維持細胞膨壓，保護膜的完整性，降低膜質的氧化代謝，從而延長果蔬的貯藏壽命[21,30]。汪良駒等[14]研究表明苦痘病蘋果果實的MDA含量比正常的高2 倍左右，患苦痘病蘋果果實細胞膜脂氧化程度明顯高于健康果實。本研究結果表明，與對照和其他處理相比，調環酸鈣協同硝酸鈣處理可以顯著提高果實ABTS陽離子自由基清除能力，降低MDA含量，維持較高的POD和SOD活力。但是，抗氧化體系與細胞內鈣含量之間的關系仍不確定，Saure[31]認為番茄臍腐病的發病不是因為缺鈣，而是氧化應激損傷導致的結果。調環酸鈣結合硝酸鈣處理能夠有效降低蘋果外皮層中的MDA含量，提高果實的抗氧化活性，說明了其有利于維持細胞功能的穩定，保證鈣離子的有效性，從而降低苦痘病的發生。

從果實品質指標來看，調環酸鈣結合硝酸鈣處理可以維持果實較高的硬度，但單獨調環酸鈣處理對硬度影響不大，這可能與鈣離子的濃度有關。調環酸鈣是否可以調節果實內可溶性固形物質量分數還需要進一步的研究。

4 結 論

采后調環酸鈣結合硝酸鈣處理可以顯著降低蘋果果實貯藏期間苦痘病的發病率和患病指數，提高果實內總鈣和生理活性鈣的含量，效果好于單一的硝酸鈣處理。并且，調環酸鈣結合硝酸鈣處理可以維持果實較高的POD和SOD活力，提高果實對氧化應激損傷的防護能力，進而降低細胞膜的脂質氧化程度，維持細胞膜的完整性。