微波輔助苦蕎中蛋白和黃酮的同步提取工藝

董丹，楊芙蓮，張歡

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，西安 710021)

蕎麥分為甜蕎和苦蕎，苦蕎富含人體所必需的8種氨基酸，是糧食中氨基酸含量之首[1]，高于大米、小麥、玉米和高梁中的蛋白質(zhì)，它的氨基酸含量為10.21%[2]。Tomotake等[3]研究表明蕎麥蛋白具有較強(qiáng)的降血脂效果，植物蛋白粉在醬油、雞精、雞粉、湯料等制品中具有廣泛的應(yīng)用[4]。蕎麥中也含有其他谷物中沒有的蘆丁、槲皮素等生物類黃酮，在食品加工中廣泛用于各種糕點(diǎn)、調(diào)味食品和保健食品的生產(chǎn)[5]，而且在抗病毒、抗腫瘤、抗心腦血管疾病等方面發(fā)揮著重要的作用[6]。此外，黃酮類物質(zhì)還是香辛料植物的有效成分[7]。目前，苦蕎蛋白的提取方法有：堿溶酸沉法、超聲輔助提取法、微波輔助提取法等[8,9]。黃酮類化合物的提取方法有：堿溶酸沉法、超聲輔助法、微波輔助法、酶法等[10-13]。目前，還沒有對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物同步提取的研究。本試驗(yàn)利用堿作為提取劑，對(duì)苦蕎中蛋白和黃酮進(jìn)行微波同步提取，為苦蕎蛋白和黃酮類物質(zhì)的生產(chǎn)提供了技術(shù)參考和理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 原料與試劑

苦蕎麥：橫山縣陜北大地農(nóng)業(yè)科技發(fā)展有限責(zé)任公司；蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品、考馬斯亮藍(lán)G250(分析純)：源葉生物有限公司；亞硝酸鈉(分析純)：天津市福晨化學(xué)試劑廠；氫氧化鈉、硝酸鋁、無水乙醇、磷酸、石油醚(分析純)：天津市天力化學(xué)試劑有限公司；牛血清白蛋白(生化試劑)：天津市化學(xué)試劑四廠；鹽酸(分析純)：洛陽昊華化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

儀器與設(shè)備見表1。

表1 儀器與設(shè)備Table 1 Instruments and equipments

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

苦蕎麥→烘干→粉碎→脫脂→堿水溶解→微波處理→離心→上清液→酸沉→沉淀→干燥→蛋白和黃酮提取物。

1.3.2 操作要點(diǎn)1.3.2.1 烘干

將苦蕎麥清洗后置于烘箱中于50 ℃干燥，粉碎過篩。

1.3.2.2 脫脂

將蕎麥粉與石油醚(沸程30～60 ℃)按1∶8的比例混合，于室溫下攪拌1 h，回收石油醚。

1.3.2.3 離心

以3500 r/min，離心10 min。

1.3.2.4 調(diào)pH

用0.1 mol/L的鹽酸和0.5 mol/L的氫氧化鈉調(diào)pH。

1.3.2.5 干燥

選擇40 ℃烘干，以防止高溫破壞苦蕎提取物。

1.3.3 苦蕎中蕎麥蛋白和黃酮類化合物微波同步提取條件優(yōu)化方法

1.3.3.1 粉碎粒度對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在粉碎粒度為40，60，80，100目，液料比為30∶1 (mL/g)，pH為9，微波時(shí)間為1 min，微波功率為360 W條件下進(jìn)行微波同步提取，計(jì)算得率。

1.3.3.2 液料比對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在液料比為10∶1、20∶1、30∶1、40∶1、50∶1、60∶1(mL/g)，粉碎粒度為80目，時(shí)間為1 min，pH為9，微波功率為360 W條件下進(jìn)行微波同步提取，計(jì)算得率。

1.3.3.3 pH對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別選取pH值7，8，9，10，11，粉碎粒度為80目，微波功率為360 W，液料比為30∶1 (mL/g)，時(shí)間為1 min條件下進(jìn)行微波同步提取，計(jì)算得率。

1.3.3.4 微波時(shí)間對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在微波時(shí)間0.5，1，1.5，2，2.5，3.0，3.5，4.0 min，粉碎粒度80目，微波功率為360 W，液料比為30∶1 (mL/g)條件下進(jìn)行微波同步提取，計(jì)算得率。

1.3.3.5 微波功率對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

分別在微波功率為180，360，540，720，900 W，粉碎粒度為80目，液料比為30∶1(mL/g)，微波時(shí)間為1 min條件下進(jìn)行微波同步提取，計(jì)算得率。

1.3.4 總黃酮的測(cè)定

準(zhǔn)確稱取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品20 mg，用60%的乙醇溶液溶解并定容至100 mL，配成濃度為0.20 mg/mL的蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液。分別取蘆丁標(biāo)準(zhǔn)溶液0，1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 mL置于25 mL具塞比色管中，加水至6 mL，先加入1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，混勻放置6 min，然后加入1 mL 10%的硝酸鋁溶液，混勻放置6 min，再加入10 mL 4% 的氫氧化鈉溶液，最后用蒸餾水定容至刻度，搖勻放置15 min。以60%乙醇作空白，在510 nm波長(zhǎng)下測(cè)定吸光度。以蘆丁濃度為橫坐標(biāo)，吸光度為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線[14]。

1.3.5 提取液中蕎麥蛋白的測(cè)定[15]

1.3.5.1 考馬斯亮藍(lán)G250溶液的制備

準(zhǔn)確稱取考馬斯亮藍(lán)G250標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg于燒杯中，先加入95%的乙醇50 mL，再加入85%的H3PO4溶液100 mL，最后用蒸溜水定容至1000 mL，常溫避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.2 牛血清蛋白對(duì)照品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)品100.00 mg，用適量蒸溜水溶解并定容至1000 mL，得到濃度為100 mg/L的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.5.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

取6支試管依次編號(hào)，分別向其中加入濃度為100 mg/L的牛血清蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，均用蒸溜水補(bǔ)至1.0 mL，此時(shí)6支試管內(nèi)牛血清蛋白的濃度依次為0，20，40，60，80，100 mg/L，分別加入考馬斯亮藍(lán)G250溶液5 mL，振蕩搖勻，室溫下充分反應(yīng)5 min后，在波長(zhǎng)為595 nm處測(cè)吸光度。最后，以牛血清蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光度A為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

2.1.1 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖1 黃酮類化合物標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Standard curve of flavonoids compounds

由圖1可知，蘆丁濃度與吸光度之間的回歸方程為：y=12.585x-0.006，R2=0.9992，根據(jù)回歸方程計(jì)算總黃酮得率。

2.1.2 苦蕎蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

圖2 苦蕎蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.2 Standard curve of tartary buckwheat protein

由圖2可知，牛血清蛋白濃度與吸光度之間的回歸方程為：y=5.2957x+0.004，R2=0.9993，根據(jù)回歸方程計(jì)算蛋白得率。

2.2 苦蕎中蛋白和黃酮微波同步提取條件的選擇

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

2.2.1.1 粉碎粒度對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖3 粉碎粒度對(duì)苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.3 Effect of particle size on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖3可知，隨著粉碎粒度的減小，苦蕎蛋白和黃酮類化合物呈明顯的增加趨勢(shì)，粉碎粒度為80目時(shí)達(dá)到最大值，隨著粉碎粒度的繼續(xù)減小，兩者得率逐漸降低。因此，選擇80目的粉碎粒度為最佳微波同步提取條件。

2.2.1.2 液料比對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖4 液料比對(duì)苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.4 Effect of liquid-solid ratio on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖4可知，當(dāng)液料比為30∶1(mL/g) 時(shí)，苦蕎蛋白和黃酮類化合物得率達(dá)到最大，表明提取液體積的增加有助于蛋白和黃酮類化合物的溶出。但隨著液料比的增大，得率反而下降，這是由于物料過多，使得原料易被壓實(shí)，從而減少了原料顆粒間的孔隙，不利于原料與溶劑之間的充分接觸。此外，液料比的過大會(huì)使一些其他成分慢慢地被溶解出來，導(dǎo)致可溶性蛋白的提取量急劇下降[16]。因此，選擇液料比為 30∶1 (mL/g)。

2.2.1.3 pH對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖5 pH對(duì)苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.5 Effect of pH on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖5可知，隨著pH的增大，苦蕎蛋白得率先上升后下降再上升。pH為9時(shí)達(dá)到最大值，這可能是因?yàn)檫^大的pH值導(dǎo)致蛋白質(zhì)內(nèi)部因靜電排斥而造成分子伸展，從而使蛋白質(zhì)變性沉淀，得率降低[17]。黃酮類物質(zhì)隨著pH的增大呈現(xiàn)升高的趨勢(shì)。雖然在較大pH條件下黃酮具有較高的得率，但蕎麥蛋白會(huì)發(fā)生變性，且有較多的雜質(zhì)溶出。綜合考慮，選擇pH 9為最佳微波同步提取條件。

2.2.1.4 微波時(shí)間對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物微波同步提取的影響

圖6 微波時(shí)間對(duì)苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.6 Effect of microwave time on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖6可知，在0.5～4.0 min區(qū)間，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，苦蕎蛋白和黃酮類物質(zhì)得率逐漸升高，當(dāng)時(shí)間達(dá)到 1 min 時(shí)，二者的得率同時(shí)達(dá)到最大，隨著時(shí)間的繼續(xù)延長(zhǎng)得率呈下降趨勢(shì)。這是由于溶劑和溶質(zhì)間達(dá)到相對(duì)飽和的平衡狀態(tài)需要一定的時(shí)間，在短時(shí)間內(nèi)細(xì)胞膜的破碎作用比較大，溶出物較多，得率上升較快[18]。而且適當(dāng)延長(zhǎng)微波時(shí)間有利于目標(biāo)產(chǎn)物的溶出，但當(dāng)達(dá)到平衡狀態(tài)后，繼續(xù)延長(zhǎng)時(shí)間反而會(huì)導(dǎo)致目標(biāo)產(chǎn)物降解，得率下降。故選擇最佳同步提取條件為1 min。

2.2.1.5 微波功率對(duì)苦蕎蛋白和黃酮類化合物同步提取的影響

圖7 微波功率對(duì)苦蕎蛋白和黃酮得率的影響Fig.7 Effect of microwave power on the yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

由圖7可知，在功率為180～900 W區(qū)間，隨著功率的增大，溶解能力增強(qiáng)，苦蕎蛋白和黃酮的得率逐漸升高，當(dāng)功率達(dá)到360 W時(shí)，蛋白和黃酮的得率達(dá)到最大，隨著功率的繼續(xù)增大得率有所下降?？赡苁且?yàn)槲⒉ㄌ幚頃?huì)破壞細(xì)胞壁，加快蛋白和黃酮類物質(zhì)的溶出，故得率增加，但提取過程中會(huì)產(chǎn)生較大的熱量，過高的溫度致使過多的雜質(zhì)溶出，且易造成經(jīng)濟(jì)損失。故選擇微波功率為360 W最合適。

2.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)

根據(jù)單因素試驗(yàn)，選擇粉碎粒度(A)、液料比(B)、微波時(shí)間(C)，以苦蕎蛋白和黃酮類物質(zhì)得率為考察指標(biāo)進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)同步提取苦蕎中蛋白和黃酮類物質(zhì)，其因素水平編碼表見表2，試驗(yàn)結(jié)果見表3。

表2 因素水平編碼表Table 2 Coding table of factors and levels

表3 苦蕎蛋白和黃酮得率響應(yīng)面設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 3 Response surface design and results of yield of tartary buckwheat protein and flavonoids

2.2.3 模型方程的建立與顯著性檢驗(yàn)

應(yīng)用Design-Expert 8.0.6 軟件對(duì)表4及表5中的結(jié)果進(jìn)行二次回歸分析，得到苦蕎蛋白和黃酮類化合物的二次回歸方程模型。蛋白得率=8.16-0.76A+0.60B+0.21C-0.23AB-0.26AC+0.12BC-1.32A2-0.98B2-1.12C2。黃酮得率=1.44-0.081A+0.064B+0.073C-0.045AB+0.042AC-0.057BC-0.32A2-0.34B2-0.28C2。

表4 苦蕎蛋白的回歸模型方差分析表Table 4 Regression model variance analysis of tartary buckwheat protein

續(xù) 表

注：“*”為p<0.05，差異顯著；“**”為p<0.01，差異極顯著。

表5 苦蕎黃酮的回歸模型方差分析表Table 5 Regression model analysis variance of tartary buckwheat flavonoids

注：“*”為p<0.05，差異顯著；“**”為p<0.01，差異極顯著。

二者的模型 P都小于0.01，則模型極顯著，說明預(yù)測(cè)值與試驗(yàn)值具有良好的擬合性。其模型失擬項(xiàng)的P值分別為0.0585，0.7939，均大于0.05，表明模型的失擬項(xiàng)不顯著，建立的回歸方程能較好地確定微波輔助提取的最佳工藝條件。由表4可知，對(duì)苦蕎蛋白得率影響極顯著的是A、B、A2、B2、C2，顯著的是C、AC；由表5可知，對(duì)苦蕎黃酮類化合物得率影響極顯著的是A、C、A2、B2、C2，顯著的是B。在各影響因素中，對(duì)苦蕎蛋白得率的影響順序?yàn)榉鬯榱６?液料比>微波時(shí)間；對(duì)苦蕎黃酮得率的影響順序?yàn)槲⒉〞r(shí)間>粉碎粒度>液料比。平方項(xiàng)對(duì)蛋白和黃酮的得率影響都比較大，說明影響值與試驗(yàn)因素之間并不是簡(jiǎn)單的線性關(guān)系。

2.2.4 響應(yīng)面分析

依照Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理和試驗(yàn)數(shù)據(jù)得出的各因素間的交互作用見圖8和圖9。

圖8 各因素間的交互作用對(duì)微波提取蛋白得率的影響Fig.8 Effect of the interaction of various factors on the yield of protein extracted by microwave

圖9 各因素間的交互作用對(duì)微波提取黃酮得率的影響Fig.9 Effect of the interaction of various factors on the yield of flavonoids extracted by microwave

等高線和三維曲面圖能夠更加直觀地反映各因素之間的交互作用。通過分析可以預(yù)測(cè)出微波輔助法同步提取苦蕎中蛋白和黃酮的最優(yōu)工藝參數(shù)為：粉碎粒度75.24目，液料比32.15∶1 (mL/g)，微波時(shí)間1.06 min，苦蕎蛋白得率為8.39%，黃酮得率為1.44%?？紤]到實(shí)際操作的可行性，將各因素條件修正為：粉碎粒度80目；液料比32∶1(mL/g)；微波時(shí)間63s；微波功率360W；pH9。

2.2.5 驗(yàn)證試驗(yàn)

在修正后的條件下進(jìn)行驗(yàn)證性試驗(yàn)，進(jìn)行3次試驗(yàn)后計(jì)算平均值，苦蕎蛋白和黃酮類物質(zhì)的得率分別為8.29%和1.38%，與理論預(yù)測(cè)值的吻合性比較相對(duì)良好，表明模型合理，可以進(jìn)行苦蕎蛋白和黃酮類物質(zhì)的同步提取。

3 結(jié)論

研究表明微波輔助法同步提取苦蕎中蕎麥蛋白和黃酮類化合物的最佳工藝條件為：粉碎粒度80目，液料比32∶1(mL/g)，微波時(shí)間63 s，微波功率360 W，pH 9，在此條件下苦蕎中蛋白和黃酮的得率分別達(dá)到8.29%和1.38%。為蛋白和黃酮類化合物的同步提取研究提供了一定的理論依據(jù)。