基于Illumina MiSeq測序技術不同地區辣椒醬細菌多樣性分析

寧明，趙馨馨，董蘊，倪慧，單春會，張振東，郭壯,3*

(1.湖北文理學院 食品科學技術學院 鄂西北傳統發酵食品研究所，湖北 襄陽 441053； 2.石河子大學 食品學院，新疆 石河子 832000；3.恩施市公共 檢驗檢測中心，湖北 恩施 445000)

辣椒醬因微生物的發酵作用，兼具營養豐富、味美色艷等特點廣受消費者喜愛，是我國傳統發酵食品[1]。徐廷弼等[2]采用傳統培養和16S rDNA測序的方法對存在產氣現象的辣椒醬生產設備和空氣中的細菌菌群種類和含量進行了解析，結果顯示：乳桿菌屬和芽孢桿菌屬在辣椒醬中占明顯優勢。丁文等[3]分別采用16S rDNA和ITS序列鑒定分離的細菌和真菌菌株，并運用PCR-DGGE法分析貯藏終點辣椒醬中細菌群落結構，發現貯藏終點優勢細菌為乳酸菌和蠟樣芽孢桿菌。傳統辣椒醬中具有相對較高的微生物多樣性，不僅蘊含具有潛在益生功能及影響產品品質形成的菌株，亦可能存在食源性致病菌[4]。越來越多的研究表明不同地區同一類發酵食品中微生物多樣性可能存在一定的差異[5]，而關于咸豐地區辣椒醬中細菌群落結構多樣性的研究鮮見報道。

與其他二代高通量測序技術相比，Illumina MiSeq平臺采用宏基因組學的研究策略，不僅大大降低了成本，而且增加了每個樣品的測序深度，兼具測序量大和精確度高等特點[6]，目前在發酵食品和動物腸道微生物多樣性解析領域有著廣泛的應用[7,8]，這為全面反映辣椒醬中細菌微生物群落特點提供了新的研究方法。目前對于辣椒醬的研究主要集中于品質分析或特定性能菌株的篩選等制作環境相對開放的傳統辣椒醬中[9,10]，而對于辣椒醬中微生物群落結構的分析鮮有報道。

本研究以采集的辣椒醬為研究對象，采用Illumina MiSeq高通量測序技術對其微生物多樣性進行深入解析，同時對不同地區辣椒醬的群落結構進行比較分析。在對辣椒醬中細菌群落進行全面解析的同時，探討挖掘核心細菌類群，以期為功能性菌種資源的開發及產品的產業化生產提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料與主要試劑

辣椒醬：從湖北省恩施土家族苗族自治州咸豐縣農貿市場采集10個辣椒醬樣品，分別命名為XFLJ1～XFLJ10，每個樣品200 g左右，制作時間在15～20 d。

QIAGEN DNeasy mericon Food Kit提取試劑盒：德國QIAGEN公司；dNTPs Mix、Fast Pfu Buffer、5×Trans StartTM、Fast Pfu Fly DNA Polymerase：寶生物工程(大連)有限公司；338F/806R正向及反向引物：武漢天一輝遠生物科技有限公司。

1.2 儀器與設備

5810R臺式高速冷凍離心機 德國Eppendorf公司；VeritiTM96孔梯度PCR擴增儀 美國AB公司；FluorChem FC3型化學發光凝膠成像系統 美國ProteinSimple公司；DYY-12電泳儀 北京市六一儀器廠；Illumina MiSeq高通量測序平臺 美國Illumina公司；R930機架式服務器 美國DELL公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 DNA提取

稱取10 g辣椒醬樣品加入蒸餾水40 mL后于300 r/min條件下離心10 min取上清液，再以10000 r/min離心10 min后保留沉淀，采用QIAGEN DNeasy mericon Food Kit試劑盒提取微生物宏基因組DNA。

1.3.2 PCR擴增及MiSeq高通量測序

以純化后的DNA為模板，采用包含“5′-ACTCCTACGGGAG-GCAGCA-3′”序列的正向引物和“5′-GGAC-TACHVGGGTWTCTAAT-3′”的反向引物擴增16S rDNA V4～V5區進行高通量測序分析。

聚合酶鏈式反應(polymerase chain reaction，PCR)體系[11]：擴增體系為20 μL，10 ng模板DNA，0.8 μL 5 μmol/L正反向引物，5 U/μL DNA聚合酶0.4 μL，2.5 mmol/L dNTPs mix 2 μL，5×PCR緩沖液4 μL，使用超純水補充剩余體系。PCR反應條件為95 ℃ 3 min，然后執行95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，共35 個循環，完成72 ℃ 10 min后于4 ℃保存。經瓊脂糖凝膠電泳檢測合格后的PCR產物寄往上海美吉生物醫藥科技有限公司完成測序。

1.3.3 生物信息學分析

采用QIIME軟件平臺調用UPARSE進行兩步UCLUST法聚類[12]，繼而應用Chimera Slayer去除嵌合體序列[13]，從而得到優化序列用于操作分類單位(operational taxonomic unit，OTU)分析，整合RDP和Greengenes兩個數據庫確定細菌OTU代表性序列的微生物分類水平并統計每個樣本的群落組成[14,15]，同時一方面對辣椒醬細菌微生物的超1(Chao1)和香農(Shannon)指數等α多樣性指標進行計算[16]，另一方面使用基于分類操作單元加權UniFrac距離[17]的主成分分析法(principal component analysis，PCA)和非加權組平均法(unweighted pair group method using arithmetic average，UPGMA)聚類進行β多樣性等一系列群落結構和組間差異的統計學和可視化分析。

1.3.4 數據下載及上傳

本研究首先從MG-RAST數據庫(http://www.mg-rast.org)中下載當陽地區辣椒醬細菌相關序列(ID號為mgp82587)。咸豐地區10 個辣椒醬樣品MiSeq高通量測序數據均已提交至MG-RAST數據庫(mgp89819)。

1.4 多元統計學分析及圖表繪制

應用方差分析(multivariate analysis of variance，MANOVA)手段解析2類地區辣椒醬細菌群落結構并采用Mann-Whiney檢驗對其顯著性進行分析；通過LDA算法甄別與細菌群落結構顯著差異相關的關鍵類群并通過各樣品之間的歐式距離矩陣計算組間差異。系統發育樹由Mega 6.0軟件繪制，其他圖均在Origin 8.6軟件中完成繪制。

2 結果與分析

2.1 樣品16S rRNA基因序列測序深度及質量評估

經質控合格后，本研究共獲得379918條高質量序列，平均每個樣品序列為37992條。序列按照97%相似性進行操作分類單元劃分后，共得到25453個OTU。辣椒醬樣品16S rRNA測序結果及各分類水平數量見表1。

表1 辣椒醬樣品測序結果及各分類地位數量Table 1 Sequencing results and number at different taxonomical levels of chili sauce samples

注：“*”表示細菌超1指數和香農指數均在測序量為22010條序列時計算所得。

由表1可知，在10個辣椒醬樣品中XFLJ9的超1指數最大，而樣品XFLJ1的香農指數最大，這說明XFLJ9樣品具有最高的細菌物種多樣性，而XFLJ1樣品細菌物種豐度最大。在OTU劃分的基礎上，所有序列劃分為133個門、316個綱、488個目、851個科和1342個屬，其中有0.09%和7.18%的序列不能鑒定到門和屬水平。

2.2 基于各分類學地位辣椒醬中細菌相對含量的組成分析

為得到每個OTU對應的物種分類信息，本研究在序列豐富度和多樣性分析的基礎上，采用97%相似水平的OTU代表序列進行分類學分析，并在門水平統計每個樣品的群落組成。根據各個樣品不同門的細菌所占比例作圖，將相對豐度低于1.0%的門合并為其他，不同樣品中細菌在分類門水平上的分布情況見圖1。

圖1 細菌在門水平的組成及相對含量Fig.1 The composition and relative content of bacteria at the phylum level

由圖1可知，在辣椒醬10個樣品中(XFLJ1～XFLJ10)共鑒定出33個門，平均豐度大于1.0%的有4 個門，分別隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)67.46%、變形桿菌(Proteobacteria)24.71%、放線菌(Actinobacteria)4.75%和擬桿菌(Bacteroidetes)1.83%，其中僅有0.09%的序列不能鑒定到門水平。從門的水平上講，細菌的種類大致相同，但豐度差別較大。

10個辣椒醬樣品中細菌在分類屬水平上的分布情況見圖2。

圖2 細菌在屬水平的組成及相對含量Fig.2 The composition and relative content of bacteria at the genus level

由圖2可知，樣品中相對含量大于1.0%的細菌屬有8個，分別為隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus，57.66%)、芽孢桿菌(Bacillus，12.25%)、明串珠菌(Leuconostoc，4.29%)、片球菌(Pediococcus，2.29%)和魏斯氏菌(Weissella，1.97%)；隸屬于變形桿菌(Proteobacteria)的假單胞菌(Pseudomonas，1.90%)、鹽單胞菌(Halomonas，1.44%)和隸屬于放線菌(Actinobacteria)的棒狀桿菌(Corynebacterium，1.30%)。

結果顯示：在屬水平上，不同樣品中所含細菌種類的多樣性及其豐度存在較大差異。對于樣品XFLJ3而言，乳桿菌(Lactobacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)和魏斯氏菌(Weissella)是主要的菌屬，其平均豐度在31.11%左右，未知屬的豐度達到3.60%，其他種類的屬的含量所占比例都較低。隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus)和魏斯氏菌(Weissella)能夠產生多種風味物質，改善發酵食品的風味缺點，使其兼具益生和味美的雙重功能[18]，其可作為豐富和完善乳酸菌資源庫和基因庫的菌種來源。相對而言，樣品XFLJ10中物種多樣性最為豐富，其中棒狀桿菌(豐度為42.44%)和鹽單胞菌(豐度為22.54%)是主要的微生物，其含量遠高于辣椒醬中其他樣品；乳酸桿菌(Lactobacillus)和片球菌(Pediococcus)的豐度分別為12.17%和4.87%。此外，在研究中發現辣椒醬XFLJ1中含有17.60%的芽孢桿菌(Bacillus)，這可能與其具有較高濃度的食鹽耐受性有關，同時芽孢桿菌亦作為影響濃香型大曲等發酵食品的關鍵微生物類群[19]，對其風味品質的工藝優化具有積極的影響。本研究結果表明，辣椒醬中細菌的構成較為復雜，菌群的種類和數量也不盡相同。

2.3 基于多元統計學分析不同地區辣椒醬細菌群落結構

為確定影響辣椒醬中細菌群落結構的因素，根據前期對湖北省當陽地區辣椒醬的研究[20]，本研究進一步在分類操作單元非加權歐式距離的PCA主坐標分析及UPGMA的基礎上對16個辣椒醬(10個咸豐地區辣椒醬和6個當陽地區辣椒醬)樣品的β多樣性進行進一步的比較分析，基于OTU水平非加權UniFrac距離顯著性檢驗的主坐標分析見圖3。

圖3 基于非加權UniFrac距離的細菌主坐標分析Fig.3 Principal coordinate analysis of bacteria based on unweighted UniFrac distance

由圖3可知，以權重最高的PC1(26.45%)和PC2(18.25%)兩個主成分繪制PCA，當陽地區辣椒醬樣品主要分布在第一象限，而咸豐地區辣椒醬樣品分布在第二、第三象限。由此可知，雖然辣椒醬樣品中存在大量的核心細菌菌群，但2類地區辣椒醬距離相差較遠，這說明2個樣本間可能存在較大的差異。為了能夠更加清晰地反映樣品菌群結構存在的差異，本研究進一步采用UPGMA顯著性檢驗對2類辣椒醬樣品間的差異性進行層次聚類分析，基于OTU的16個辣椒醬樣本的聚類分析見圖4。

圖4 基于OTU水平非加權UniFrac距離的 UPGMA聚類分析Fig.4 UPGMA cluster analysis of OTU level based on unweighted UniFrac distance

由圖4可知，用于比較的16個辣椒醬樣品大致可分為3個大類，其中咸豐地區辣椒醬樣品XFLJ1～XFLJ9和當陽地區辣椒醬樣品DYLJ1～DYLJ6各為一類，而XFLJ10樣品被聚為一類，這與主成分分析結果基本一致。整體從16個樣品來看，相似度差別較大，這可能與地域差異性導致的辣椒醬核心類群的不同有關。結合圖3可知，造成這種現象的原因可能是辣椒醬樣品XFLJ10相較于其他9個樣品來說，有相對含量遠高于其他樣品的鹽單胞菌(Halomonas)和棒狀桿菌(Corynebacterium)等優勢細菌屬的存在。

在非加權UniFrac水平上，分支的長度能夠較好地反映群落的相對豐度差異，由圖4結果還可知，咸豐地區辣椒醬樣品各分支長度整體上要大于當陽地區辣椒醬樣品各分支，為探究其顯著差異性，本研究進一步使用歐氏距離對辣椒醬樣品細菌群落結構組間差異進行解析，結果見圖5。

由圖5可知，通過采用歐式距離對當陽地區(0.522±0.025)和咸豐地區(0.659±0.0743)辣椒醬微生物群落結構組間差異進行分析的基礎上，由Mann-Whiney檢驗得出2組樣本間差異非常顯著(p<0.01)，說明咸豐地區細菌群落結構組間差異要顯著高于當陽地區。

圖5 基于非加權歐氏距離的細菌群落結構組間差異分析Fig.5 Differences in the bacterial community structure based on unweighted UniFrac distances

注：“**”表示差異非常顯著，p<0.01。

2.4 基于分類水平的關鍵細菌類群的甄別

根據上述研究結果分析發現，咸豐地區和當陽地區的辣椒醬微生物群落結構差異極顯著(p<0.01)。本研究以辣椒醬分組(咸豐地區/當陽地區)為起非監督作用的解釋變量，以LDA分數(LDA Score)取對數(log10)之后相對值大于3的分類操作單元為響應變量，甄別了影響2類地區辣椒醬微生物群落結構在豐度上差異顯著的關鍵細菌。

圖6 LDA值分布柱狀圖Fig.6 The distribution histogram of LDA values

由圖6可知，2組樣品具有統計學差異，從宏觀上描述了所有類群和總體之間的離散冗余程度，2類辣椒醬在該空間中具有最佳的可分離性。由此可見，12個主要細菌類群代表了2類辣椒醬微生物群落結構差異顯著相關的關鍵細菌類群。隸屬于Firmicutes(厚壁菌門)的Bacillaceae(芽孢桿菌)科和Bacillus；隸屬于Actinobacteria(放線菌)的Actinomycetales，Brevibacteriaceae，Brevibacterium(短桿菌)和Kocuria；隸屬于Proteobacteria(變形菌門)的Aeromonadaceae，Rhodobacterales，Rhodobacterceae及Massilia(位于圖的左側，即咸豐地區辣椒醬)，這說明該10個類群在咸豐地區辣椒醬中的相對含量可能較高；隸屬于Proteobacteria(變形菌門)的Ramlibacter和Hafniaceae(位于圖的右側，即當陽地區辣椒醬)，這說明該2個細菌類群在當陽地區辣椒醬中的相對含量可能較高。整體上看，咸豐地區辣椒醬細菌群落結構種類多樣性及豐度要顯著高于當陽地區，這與圖6的結果一致。

3 結論

MiSeq高通量測序結果表明，咸豐地區10個辣椒醬樣品中的優勢細菌類群主要是由隸屬于厚壁菌門(Firmicutes)的乳酸桿菌(Lactobacillus)、芽孢桿菌(Bacillus)、明串珠菌(Leuconostoc)、片球菌(Pediococcus)和魏斯氏菌(Weissella)；隸屬于變形桿菌(Proteobacteria)的假單胞菌(Pseudomonas)和鹽單胞菌(Halomonas)及隸屬于放線菌(Actinobacteria)的棒狀桿菌(Corynebacterium)構成。通過對比當陽地區辣椒醬細菌類群，對辣椒醬樣品中細菌群落結構中關鍵細菌類群進行評價，發現咸豐地區辣椒醬細菌群落結構種類多樣性及豐度要顯著高于當陽地區辣椒醬。