Hsa_circ_0001947對胃癌細胞增殖和凋亡的影響

陳正威，章安偉，張垚，張烜烽，袁海濤，步雪峰

(1.江蘇大學醫學院，江蘇 鎮江 212013；2.江蘇大學附屬昆山醫院普外科，江蘇 昆山 215300；3.江蘇大學附屬人民醫院普外科，江蘇 鎮江 212002)

環狀RNA是一種特殊非編碼RNA，廣泛存在于生物體內[1-2]。其不僅與多種疾病密切相關，且具有潛在的癌癥診斷與生物治療價值[3]。研究顯示，目前已在胃癌患者的胃癌組織、細胞，甚至血漿中發現多種表達失調的環狀RNA[4-6]。Hsa_circ_0001947是一種內源性環狀RNA，定位于X染色體: 147743428-147744289，廣泛表達于人體各組織器官，但其目前在胃癌發生發展過程中的作用尚不清楚。本研究擬觀察hsa_circ_0001947在胃癌細胞、組織中的表達，并分析其對胃癌細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1 研究對象

選擇2017年7月至2018年8就診于江蘇大學附屬人民醫院普外科的75例胃癌患者，行全胃或胃大部切除術后，收集胃腺癌及癌旁組織(距離癌組織>5.0 cm)標本，手術標本切除后30 min內迅速放入液氮中冷凍，然后于-80 ℃長期保存。標本采集均得到患者同意，并經江蘇大學附屬人民醫院倫理委員會批準。

1.2 細胞株和主要試劑

高通量測序(上海歐易生物醫學技術有限公司)；人胃癌MGC-803、BGC-823、SGC-7901、HGC-27細胞(中國科學院上海生科院細胞資源中心)；正常胃黏膜上皮GES-1細胞株(南京凱基生物科技發展有限公司)；胎牛血清、RPMI 1640、DMEM(以色列BI公司)；Trizol試劑(美國Ambion公司)；小干擾RNA(si-RNA，廣州銳博生物技術有限公司)；PCR引物(上海生工生物工程股份有限公司)；TaqMan反轉錄試劑盒(美國Ambion公司)；SYBR Green PCR預混試劑、熒光定量PCR試劑盒(日本TaKaRa公司)；Lipofectamine 2000轉染試劑、CCK-8試劑盒(南京厚載生物科技有限公司)；AnnexinⅤ-FITC/PI試劑盒(北京四正柏生物科技有限公司)；羊抗兔Cleaved-caspase-3抗體(美國CST公司)；羊抗兔Bax抗體、羊抗鼠Bcl-2抗體(武漢博士德生物工程有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 細胞培養與細胞轉染 用含10%胎牛血清的RPMI 1640、DMEM于37℃，5% CO2飽和濕度的培養箱中分別培養胃癌BGC-823、SGC-7901、HGC-27以及MGC-803細胞。每24 h更換1次培養基，當細胞在培養瓶中覆蓋率達80%時進行傳代培養。細胞接種于6孔板中，當細胞達到50%～70%融合點時，將其分為si-circ_0001947組和si-NC組，分別加入si-circ_0001947,si-NC以及脂質體2000，培養12 h，以備后續實驗用。

1.2.2 實時熒光定量PCR(qRT-PCR)檢測胃組織、細胞中circ_0001947的表達水平 采用Trizol法提取75例胃腺癌、癌旁組織，4種胃癌細胞及胃上皮細胞中總RNA，并按TaqMan RNA反轉錄試劑盒說明書操作，將4 ng總RNA反轉錄合成cDNA。在CFX96實時定量PCR儀中，以GAPDH為內參，量化circ_0001947的表達水平,使用SYBR Green PCR預混試劑行qRT-PCR，以2-ΔΔCt法反映circ_0001947相對表達水平。circ_0001947上游引物：5′-GTGAAACAAACAAAGGTGATGC-3′，下游引物：5′-ATTCCCACTAGGTGATTCTGA-3′，內參GAPDH上游引物：5′-CCCACTTCTCTCTAAGGAGAAT-3′,下游引物：5′-TACACGAAAGCAATGCTATCAC-3′。

1.2.3 CCK-8實驗檢測細胞活力 取si-circ_0001947組和si-NC組2組BGC-823、SGC-7901細胞，分別接種于96孔板中，5 000個/孔，每組設置3個復孔，于細胞培養箱中培養。根據細胞分裂周期分別于0、12、24、48、72 h進行CCK-8檢測[7]，每孔加入10 mL CCK-8試劑，置于細胞培養箱中孵育2 h，用酶標儀檢測450 nm處光密度值[D(450 nm)]。

1.2.4 克隆形成實驗檢測細胞增殖 將si-circ_0001947組和si-NC組2組BGC-823、SGC-7901細胞分別接種于6孔板中(500個/孔)，每組設置3個復孔，37 ℃培養箱中培養10～12 d；每2～3 d換液一次，克隆細胞長至合適大小時終止培養；PBS清洗3次；加入甲醇于4℃固定細胞15 min；PBS清洗3次；每孔加入結晶紫1 mL染色20 min；加入雙蒸水清洗至洗凈背景；計數細胞克隆數，克隆形成率(%)=(克隆數/接種細胞總數)×100%。

1.2.5 流式細胞儀檢測細胞凋亡率 將BGC-823，SGC-7901細胞分別加入si-circ_000194與si-NC培養12 h；收集并消化細胞，用預冷PBS清洗3次；按照細胞凋亡試劑盒說明書操作，先用1×結合緩沖液重新懸浮細胞，調節其密度為1×106/mL；取100 mL懸液，加入5 mL Annexin V-FITC于室溫避光孵育5 min；加入10 mL一碘化丙錠，再加入400 mL PBS，上機進行檢測。

1.2.6 蛋白印跡法檢測凋亡相關蛋白的表達

將胃癌BGC-823、SGC-7901細胞分別接種于6孔板中，分別加入si-circ_0001947，si-NC孵育12 h后提蛋白。依次行SDS-PAGE，350 mA 90 min濕轉至PVDF膜；BSA封閉1h；分別加羊抗兔Cleaved-caspase-3抗體(1 ∶300)，羊抗鼠Bcl-2抗體(1 ∶400)，羊抗兔Bax抗體(1 ∶400)，羊抗鼠β-微管蛋白(1 ∶1 000)，4℃孵育過夜；TBST洗膜3次；加羊抗鼠或羊抗兔HRP-IgG(1 ∶3 000)室溫孵育2 h；TBST洗膜3次；增強型化學發光試劑顯影。Image J對蛋白條帶吸光度進行定量分析。

1.2.7 統計學處理

2 結果

2.1 胃腺癌組織中差異環狀RNA的表達譜

通過高通量測序篩選出5例臨床胃腺癌、癌旁組織中差異表達的5種環狀RNA，分別為hsa_circ_0000033，hsa_circ_0000038，hsa_circ_0004916，hsa_circ_0058092，hsa_circ_0001947。與癌旁組織相比，胃腺癌組織中hsa_circ_0000033，hsa_circ_0000038及hsa_circ_0004916表達明顯下調(t=3.332，2.791，8.901，P均<0.05)，hsa_circ_0058092和hsa_circ_0001947表達明顯上調(t=10.631，15.360，P均<0.01)，見圖1。挑選上調最明顯的hsa_circ_0001947進行后續實驗。

a : P<0.05，b: P<0.01，與癌旁組織相比

2.2 circ_0001947在胃癌組織及胃癌細胞中的表達

由圖2可見，胃癌組織中circ_0001947相對表達量顯著高于癌旁組織(t=8.019，P<0.01)。4株胃癌細胞中circ_0001947相對表達量均明顯高于人胃上皮GES-1細胞(P<0.05或P<0.01)。circ_0001947在胃癌細胞BGC-823中相對表達量最高，在SGC-7901中最低，故挑選這兩種細胞株繼續進行后續實驗。

a : P<0.05，b : P<0.01, 與GSE-1細胞相比

2.3 si-RNA顯著下調胃癌BGC-823，SGC-7901細胞中circ_0001947表達量

胃癌BGC-823,SGC-7901細胞轉染si-RNA 12 h后，si-circ_0001947組中circ_0001947相對表達量明顯低于si-NC組(t分別為10.011，4.933，P均<0.01)，由此表明si-RNA對胃癌細胞中circ_0001947存在敲減作用。見圖3。

圖3 si-RNA干預后胃癌細胞內circ_0001947表達水平

2.4 下調circ_0001947表達明顯抑制胃癌細胞增殖

CCK-8結果顯示，si-circ_0001947組BGC-823，SGC-7901細胞各個時間點D(450 nm)值均明顯低于si-NC組(P均<0.05)；circ_0001947組克隆形成率較si-NC組明顯降低(t=9.409，11.381，P均<0.01)。見圖4。

a: P<0.05, b：P<0.01, 與si-NC組比較

2.5 下調circ_0001947表達促進BGC-823、SGC-7901細胞凋亡

流式細胞儀檢測結果表明，si-circ_0001947組BGC-823，SGC-7901細胞凋亡明顯高于si-NC組率(t=5.620，3.711，P均<0.01)。見圖5。與si-NC組相比，si-circ_0001947組BGC-823，SGC-7901細胞中Cleaved-caspase-3(t=7.991，12.309，P均<0.01)與Bax(t=8.619，3.574，P<0.01或<0.05)相對表達量明顯升高；Bcl-2相對表達量明顯降低(t=14.527，2.588，P<0.01或<0.05)。見圖6。

圖5 流式細胞術分析各組細胞凋亡情況

a: P<0.05，b: P<0.01，與si-NC組比較

3 討論

以往研究顯示，環狀RNA在多種惡性腫瘤中表達上調，通過促進腫瘤細胞增殖，抑制其凋亡影響腫瘤發生發展[8-10]。本實驗通過高通量測序挑選出一種新型環狀RNA hsa_circ_0001947進行研究，實驗結果顯示，circ_0001947在胃腺癌組織和胃癌細胞中表達水平明顯升高，說明circ_0001947在胃癌發生發展過程中可能發揮原癌基因功能。

張帥等[11]研究表明，環狀RNA hsa_ circ_0007766通過上調細胞周期相關蛋白Cyclin D1/CyclinE1/CDK4表達，從而促進肺腺癌細胞增殖，沉默hsa_circ_0007766表達后，細胞周期阻滯于G0/G1期，明顯抑制肺腺癌細胞生長。楊睿等[12]也證實，hsa_circ_0058514通過影響細胞周期蛋白CCNE1和CKD2表達，從而影響乳腺癌細胞周期。本研究通過CCK-8和克隆形成實驗發現，circ_0001947 促進胃癌細胞增殖，下調circ_0001947表達后，胃癌細胞增殖明顯受抑制，推測可能與circ_0001947影響胃癌細胞分裂周期有關。此外，本實驗發現，與正常胃上皮細胞相比，胃癌細胞早期凋亡率與晚期凋亡率均明顯上升。Bcl-2和Bax屬于Bcl家族，是調控細胞凋亡的重要蛋白，其異常表達會導致細胞凋亡過程失常，增加腫瘤發生的風險[13-16]。凋亡是影響腫瘤發生發展的重要因素[17]。本實驗結果顯示，敲減circ_0001947后，Cleaved-caspase-3、Bax的表達明顯上調，而Bcl-2表達顯著下調，由此推測circ_0001947在胃癌細胞中可能通過影響凋亡相關蛋白表達，從而抑制胃癌細胞凋亡。但circ_0001947調控胃癌細胞周期蛋白與凋亡相關蛋白表達的具體機制尚有待進一步研究。

綜上所述，hsa_circ_0001947在胃腺癌組織和細胞中呈高表達，其可能通過影響細胞周期促進胃癌細胞增殖，影響凋亡相關蛋白表達抑制胃癌細胞凋亡。