宜賓產區濃香型白酒釀造生境中細菌的群落結構

翟磊，于學健，馮慧軍，張彩文，周立光，邱聲強，姚粟*

1(中國食品發酵工業研究院有限公司， 中國工業微生物菌種保藏管理中心，北京，100015)2(四川省酒業集團有限責任公司川酒研究院，四川 成都，610041)

中國白酒是世界六大蒸餾酒之一，已有1 000多年的歷史，是我國最具民族文化特征的產品之一，對我國國民經濟和產業發展起到了重要的推動作用。迄今為止，中國白酒根據其風味特征已形成12種類型，包括濃香型、醬香型、清香型、鳳香型、藥香型、米香型、芝麻香型、豉香型、兼香型、老白干香型、馥郁香型、特香型。白酒釀造過程是在開放的環境下進行的，以谷物為發酵基質，大曲為糖化發酵劑，釀造過程復雜，受多種因素的影響。釀酒原料在微生物和酶的作用下產生的微量成分，構成了白酒中微量成分的主要來源，對白酒的產品質量有著重要的影響。白酒中的微量成分含量為2%～3%，是決定白酒香氣口感和風格的關鍵。根據化學性質，可以將酒中的微量成分分為醇類、醛類、酸類、酯類、酮類、內酯類化合物、硫化物、縮醛類化合物、吡嗪類化合物、呋喃類化合物、芳香族化合物[1]。

濃香型白酒是中國白酒的典型代表之一，在中國占有70 %以上的市場份額[2]。濃香型白酒是以糧谷為原料，經傳統固態法發酵、蒸餾、陳釀、勾兌而成的，未添加食用酒精及非白酒發酵產生的呈香物質，以己酸乙酯為主體復合香的白酒[3]。眾所周知，微生物在白酒釀造過程中發揮著重要的作用，處于核心地位，濃香型白酒也是不同種類微生物的多微共酵作用形成的，其中大曲、窖泥及酒醅是濃香型白酒釀造的關鍵，依賴于其中微生物的多微共酵，形成復雜的白酒成分[4]，最終形成了濃香型白酒的獨特風格。隨著釀酒工藝的改善和發展，濃香型白酒生產工藝日趨成熟，但其釀造機理和呈香味機制相關研究還處于起步階段[5]，微生物在白酒釀造過程中的作用機理尚未明確，微生物代謝與白酒風味物質形成的內在聯系還未完全清晰。

傳統的平板培養、變性梯度凝膠電泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis，PCR-DGGE)、16S rRNA基因克隆文庫等技術對于分析環境微生物生態具有很大的局限性。傳統的平板培養方法只能獲得環境中極少數微生物的信息，不能充分反映環境微生物生態功能。ZHANG等通過PCR變性梯度凝膠電泳(DGGE)檢測了窖泥中的一些不可培養的芽胞桿菌和梭菌[6]。然而，由于PCR-DGGE在很大程度上依賴于所設計的PCR引物的特異性，因此該技術不能準確反映真實的微生物群落組成。16S rRNA基因的克隆文庫分析依賴于PCR擴增產物的連接轉化效率，因此不能排除在表征細菌多樣性時產生信息遺漏的可能性[7]。而高通量測序技術具有高通量、高分辨率的優勢，已被證明是分析復雜微生物菌群的強有力手段[8]，能更可靠地定量估計微生物群落結構[9]。隨著高通量測序價格的持續走低，基于宏基因組測序的微生物生態學研究逐漸增多。宏基因組測序技術可以繞開“大部分環境微生物不可培養”的壁壘，不僅可以獲得微生物群落的多樣性和功能組成，還可以此結果為依據，發掘環境中新的功能酶或基因，可謂是將微生物分類-功能組成-應用開發結合了起來，因此在目前環境微生物學研究中占據主導地位。李斌等采用高通量測序技術分析了濃香型和芝麻香型白酒酒曲細菌群落結構，結果表明濃香型白酒中高溫酒曲的優勢類群主要包括乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、魏斯氏菌屬(Weissellasp.)和片球菌屬(Pediococcussp.)等[10]；鄧杰等[11]采用高通量測序技術發現濃香型白酒30年窖齡窖泥中古菌類群主要集中在熱原體科(Thermoplasmataceae)，甲烷桿菌科(Methanobacteriaceae)，甲烷微菌科(Methanomicrobiaceae)、甲烷八疊球菌科(Methanosarcinaceae)和甲烷粒菌科(Methanocorpusculaceae)。

本研究擬利用高通量測序技術，全面解析濃香型白酒特殊釀造生境中微生物的群落結構，在分子生物學水平上探究特征性微生物資源，為定向篩選和深度挖掘濃香型白酒特殊釀造生境中潛在新種和特征性微生物資源奠定基礎，為全面解析白酒釀造機理，提升白酒品質提供理論基礎和材料保障。

1 材料與方法

1.1 樣品采集

樣品采集于宜賓產區濃香型白酒釀造生境，包括窖泥(N)、酒醅(J)、大曲(D)和黃水(H)。采用五點采樣法，對宜賓產區的5個白酒生產企業的7個車間的濃香型白酒釀造生境進行采樣。除大曲樣品外，其他三類樣品均是從當天出池的窖池中采樣獲得，采集后的樣品密封，-80℃保存。

1.2 樣品宏基因組DNA的提取與純化[12]

準確稱取5 g樣品，加入13.5 mL DNA提取液(100 mmol/L Tris-HCl，100 mmol/L EDTA，100 mmol/L磷酸鈉緩沖液，1.5 mol/L NaCl, 1% CTAB，pH 8.0)和100 μL蛋白酶K(10 mg/mL)，37 ℃，220 r/min振蕩處理30 min。加入1.5 mL 20% SDS， 65 ℃溫育2 h。6 000 r/min離心10 min，收集上清。在沉淀中加入4.5 mL DNA提取液和0.5 mL 20% SDS，漩渦振蕩混勻，65 ℃溫育10 min，6 000 r/min離心10 min，合并上清。加入等體積酚-氯仿-異丙醇(25∶24∶1)溶液，漩渦振蕩混勻，靜置10 min后，12 000 r/min離心20 min。收集上層水相，加入0.7倍體積異丙醇，室溫沉淀1 h，12 000 r/min離心20 min，棄上清。向沉淀中加入1 mL 70 %乙醇，洗滌2次后，加入100 μL無菌蒸餾水過夜溶解，即得到樣品的粗DNA。為了滿足后續操作要求，使用Cycle-pure Kit (D6492，Omega)對提取的粗DNA進行純化，待用。

1.3 PCR擴增及測序

以純化的宏基因組DNA為模板，使用16S rRNA基因V4區通用引物338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAA T-3′)進行PCR擴增。PCR擴增體系：5×FastPfu緩沖液8 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 上、下游引物各2 μL，FastPfu酶1 μL，DNA 30 ng，ddH2O補足至40 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 45 s，共27個循環；72 ℃ 10 min[13]。對PCR 產物進行切膠純化回收，定量后進行文庫構建，具體步驟如下：使用T4 DNA Polymerase、Klenow DNA Polymerase和T4 PNK將打斷形成的黏性末端修復成平末端，再通過3′端加堿基“A”，使得DNA片段能與3′端帶有“T”堿基的特殊接頭連接，使用illumina平臺對質控合格的文庫進行測序。

1.4 測序數據分析

利用QIIME 2[14]的DADA2方法[15]對下機數據進行質控，去除低質量序列、嵌合體并得到特征表(feature table)和代表序列(feature data)，利用QIIME2中q2-phylogeny方法和iTOL[16]構建系統發育樹，利用QIIME2中q2-diversity方法進行Alpha和Beta多樣性分析，利用shannon指數，評估樣品微生物多樣性；通過Bray-Curtis距離矩陣進行主坐標軸分析(PCoA, principle coordinates analysis)，利用QIIME2 q2-feature-classifier方法對物種進行分類，統計作圖利用ggplot2[17]和STAMP軟件[18]完成。

2 結果與分析

2.1 樣品的采集

通過文獻查閱和實地調研，發現宜賓市區和南溪區是宜賓濃香型白酒的兩個主要產區。因此，本研究分別從宜賓市區的敘府酒業和川雄酒業，以及南溪區金南福酒業、今良造酒業和六尺巷酒業的7個車間進行采樣，并詳細記錄采樣信息，包括樣品名稱、采樣地區、采樣地點、樣品類型和窖池窖齡等信息，其中樣品以采樣酒廠、采樣車間和樣品類型來命名。采用五點法，采集了來自上述5家酒企的窖泥(N)、大曲(D)、出池階段的酒醅(J)和黃水(H)樣品，共計26份，其中敘府酒業的3個不同車間窖池使用的是同一批次的大曲，因此，只采集了五車間大曲樣品。

宜賓市區的白酒生產企業的窖池窖齡普遍較高，其中川雄酒業窖池使用了40年，敘府酒業的3個車間窖池的窖齡分別為15、20和30年；南溪區白酒生產企業的窖池窖齡范圍較大，既包括金南福酒業使用30年的窖池，也包括六尺巷酒業僅使用3年的新窖池，而今良造酒業窖池比較特殊，窖泥是從宜賓市區整體轉移到南溪區，繼續進行白酒生產的，在南溪區使用了5年，整體窖齡為20年。因此，本研究采集的樣品既包括了宜賓地區濃香型白酒的兩個主要產區，又包括不同窖齡的窖池中窖泥、大曲、酒醅和黃水，具有良好的代表性，具體采樣信息見表1。

表1 濃香型白酒釀造生境采樣信息表

注：*，今良造酒業的窖泥是從宜賓市區整體轉移到南溪區，在南溪區使用了5年，整體窖齡為20年。

2.2 樣品宏基因組的提取、純化與測序分析

本研究采集的窖泥、大曲、酒醅、黃水均為復雜基質的樣品，提取的宏基因組DNA含有大量的腐殖酸，會影響后續的PCR擴增與測序分析。因此，本研究使用Cycle Pure Kit(D6492，Omega)對提取的粗DNA進行純化回收，純化后的宏基因組DNA的濃度和純度均滿足PCR擴增與測序的要求。利用Illumina PE150測序平臺對宜賓產區濃香型白酒特殊釀造生境中細菌進行高通量測序，解析其微生物群落結構。測序結果表明，26個樣品共獲得674.21 Mbp數據，1 345 405條有效序列，序列平均長度為498 bp，平均每個樣品的有效序列超過51 000條，數據量超過25 Mbp，優質序列覆蓋率均高于97%，且稀釋曲線均趨于平穩，表明本研究的測序數據質量滿足微生物群落結構的分析的要求，具體測序信息見表2。

表2 樣品高通量測序信息表

2.3 濃香型白酒釀造生境細菌系統發育學分析

基于16S rRNA基因V4區對細菌種類的區分度，本研究選擇在屬水平上解析宜賓產區濃香型白酒釀造生境細菌群落結構。利用QIIME2中q2-phylogeny方法，對26個樣品中的細菌種類和豐度進行分析，共注釋到來自于201個屬的1 493個OTUs，主要分布于擬桿菌門(Bacteroidete)、變形菌門(Proteobacteria)和厚壁菌門(Firmicutes)，其中5個屬來自于古菌域的廣古菌門(Euryarchaeota)，利用iTOL構建這些物種的系統發育樹(圖1)，這表明濃香型白酒釀造生境中的細菌多樣性非常豐富，濃香型白酒的釀造是多種微生物共同作用的結果。

圖1 宜賓產區濃香型白酒釀造生境細菌系統發育樹

2.4 濃香型白酒釀造生境細菌多樣性分析

利用QIIME2中q2-diversity方法進行多樣性分析，利用shannon指數評估樣品中微生物多樣性，以評價樣品中細菌的物種豐富度(圖2)。從整體上看，濃香型白酒釀造生境中的大曲和窖泥樣品的物種豐富度顯著高于黃水和酒醅樣品，其中窖泥樣品shannon指數的平均值最高，達到5.022，其中XF_3_N樣品的shannon指數達到7.809；大曲樣品shannon指數的平均值也達到4.805，XF_5_D樣品的shannon指數達到5.513；黃水樣品shannon指數波動較大，在1.994～5.156，平均值為2.987；酒醅樣品的shannon指數最低，平均值僅為1.533，其中XF_2_J的shannon指數僅為0.930。從每家濃香型白酒生產企業來看，細菌多樣性變化趨勢與整體變化趨勢也是一致的，即大曲和窖泥樣品的物種多樣性顯著高于黃水和酒醅樣品，這表明濃香型白酒釀造是從多種微生物共同作用開始，通過環境和工藝的選擇，最終逐漸形成功能微生物為主的群落結構。

圖2 宜賓產區濃香型白酒釀造生境細菌多樣性分析

2.5 濃香型白酒釀造生境細菌種類和豐度分析

利用QIIME 2 q2-feature-classifier方法對物種進行分類，通過ggplot2繪制堆積圖來展示每個樣品的微生物類別和豐度(圖3)。生產濃香型白酒，窖泥是基礎，大曲是動力，工藝是關鍵。大曲是我國固態白酒釀造特有的糖化發酵劑，含有大量微生物和酶類，在傳統白酒釀造過程中發揮重要的作用。在本研究的大曲樣品中，未鑒定到屬水平的細菌為主要類群，占比在60%～89%。除此之外，芽胞桿菌屬(Bacillussp.)、片球菌屬(Pedicoccussp.)、乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、魏斯氏菌屬(Weissellasp.)、明串珠菌屬(Leuconostocsp.)、高溫放線菌屬(Thermoactinomycessp.)和醋桿菌屬(Acetobactersp.)為大曲中的主要微生物類群。其中芽胞桿菌能夠分泌多種水解酶，通過水解作用提高大曲原料的利用率，提升白酒的風味成分；豐富的乳酸菌資源為后續厭氧發酵提供了重要的功能菌種資源；高溫放線菌屬菌株能夠產生發達的菌絲體，疏松大曲內部結構，在維持大曲骨架方面發揮重要作用[19-20]。

窖泥的好壞直接決定著濃香型白酒酒質的優劣。細菌群落結構分析結果表明，甲烷桿菌屬(Methanobacteriumsp.)、甲烷袋狀菌(Methanoculleussp.)、甲烷粒菌屬(Methanocorpusculumsp.)和甲烷短桿菌屬(Methanobrevibactersp.)、瘤胃球菌屬(Ruminococcussp.)、梭菌屬(Clostridiumsp.)、乳桿菌屬(Lactobacillussp.)、片球菌屬(Pediococcussp.)、紫單胞菌屬(Petrimonassp.)和互養單胞菌屬(Syntrophomonassp.)是窖泥中的主要細菌菌群。其中，以甲烷菌為主的古菌在窖泥中發揮重要的作用，催化H2和CO2產生甲烷，從而解除了累積的H2對酸代謝的反饋抑制作用，提高了濃香型白酒主要香味成分己酸乙酯的含量[21-22]。紫單胞菌屬(Petrimonassp.)和互養單胞菌屬(Syntrophomonassp.)菌株主要與產甲烷菌互營共生，為甲烷菌生長提供代謝底物[21]。

黃水和酒醅中的生物物種顯著降低，整個濃香型白酒釀造過程細菌群落呈現從多種微生物共同作用到功能優勢微生物發揮主要作用的轉變過程。黃水和酒醅中主要以片球菌屬、乳桿菌屬和和瘤胃球菌屬為主，其中片球菌屬為優勢菌種，豐度在65.5%～99.7%，其中XF_2_J樣品的片球菌屬的豐度達到了99.7%。瘤胃球菌屬主要參與丁酸等有機酸的合成，增加濃香型白酒中的呈香物質。而以片球菌和乳桿菌為主的乳酸菌是白酒發酵中后期的優勢細菌，隨著發酵的進行，發酵體系內酸度和乙醇濃度的升高，氧氣含量逐漸減少，大部分的微生物不能夠耐受高酸度、高乙醇濃度、厭氧等不利條件而逐漸衰亡，來自于大曲和窖泥的乳酸菌逐漸成為優勢菌種。乳酸菌的主要產物是乳酸，能夠減少白酒的刺激感，增加酒體的醇厚感，對白酒產品風味的形成有重要影響。同時，乳酸能夠與其他微生物代謝產生的乙醇發生反應，生成乳酸乙酯，乳酸乙酯能夠增加酒體的醇甜感、醇厚度，是重要的呈香物質[23]。

圖3 細菌種類和豐度分析

2.6 濃香型白酒釀造生境不同種類樣品的聚類分析

通過Bray-Curtis距離矩陣進行主坐標軸(PCoA)分析不同樣品間的相關性(圖4)。研究結果發現，盡管樣品來源不同，但是5個大曲樣品能夠聚類在一起，且與其他樣品有明顯的差異。7個窖泥，除了窖齡最短的LCX_N(3年)外，其他6個窖齡超過15年的窖泥樣品也能夠聚類在一起，這說明窖泥微生物群落結構與窖齡的關系密切，推測六尺巷酒業的窖泥正在成熟過程，其中的細菌群落結構正在活躍變化之中。另外，由于黃水來源于酒醅，因此這兩種樣品不能很好的區分，而聚為一個大的類群，且與其他樣品有明顯的差異。

圖4 主坐標軸(PCoA)分析

通過主成分分析比較不同地區的大曲和窖泥樣品的差異。分析結果發現，宜賓市區和南溪區的大曲分別聚類在一起(圖5-a)，這表明大曲樣品微生物群落受區域環境影響較大，表現出明顯的地域性。而不同區域的窖泥樣品微生物群落結構并沒有顯示出明顯的地域性，而與窖泥窖齡的關系更為相關，推測這與窖泥在慢慢熟化的過程中微生物類群不斷變化有關。如圖5-b所示，窖齡最短的六尺巷樣品(3年)與其他樣品距離較遠，窖齡最長(40年)的川雄樣品次之，而窖齡在15～30年的樣品較好地聚類在一起，這表明窖齡對于窖泥微生物群落結構的影響高于區域環境。

a-大曲樣品;b-窖泥樣品

2.7 窖泥微生物群落結構與其窖齡的相關性研究

窖泥在濃香型白酒生產過程中發揮著重要的作用，而且窖泥的質量和窖齡息息相關，直接影響著濃香型白酒的質量。多樣性指數是反映群落結構特征的重要指標，隨著窖齡的增加，微生物繁衍交替，窖泥微生物多樣性呈增加趨勢。本研究發現，7個窖泥樣品中的shannon指數在2.933～7.809，其中XF_3_N樣品最高，表明該樣品中微生物群落結構最為豐富；而3年窖齡的LCX_N樣品shannon指數最低，推測該樣品中的微生物群落正在逐步形成過程中，物種的豐富程度有待加強。

古菌在窖泥中發揮著重要的作用，能夠利用己酸菌代謝產生H2產生甲烷，從而解除了累積的H2對己酸代謝的反饋抑制作用，提高了濃香型白酒主要香味成分含量。不同窖齡的樣品比較發現，在窖齡最短的六尺巷窖泥樣品(3年)中并未發現古菌的存在，而其他窖泥樣品中的古菌主要以甲烷桿菌屬、甲烷袋狀菌屬、甲烷粒菌屬和甲烷短桿菌屬為主，這些甲烷菌均為氫營養型產甲烷菌，能夠利用H2和CO2生成甲烷，降低窖泥中H2含量。其中窖齡較長的CX_N(40年)和XF_2_N(30年)窖泥樣品中以甲烷桿菌屬菌株為主(圖6)，推測該屬菌株可以為窖泥窖齡判斷的指示菌。

圖6 窖泥樣品中微生物豐度熱圖

2.8 敘府酒業釀造生境中細菌群落結構分析

分別從敘府酒業3個不同車間(窖齡不同)的窖池中取樣，比較其微生物群落結構的異同。分析結果表明，酒醅中主要以片球菌屬為主，在二車間和五車間樣品中分別達到99.74%和98.89%，而在三車間中片球菌占比87.01%，乳桿菌占比9.42%。而黃水樣品中，二車間和五車間主要以乳桿菌屬、片球菌屬和瘤胃球菌屬為主要類群，而三車間樣品的微生物多樣性較為豐富，豐度高于1%的細菌有10個類群之多。3個車間的窖泥樣品的微生物群落差異較大，其中窖齡最長的二車間主要以甲烷桿菌屬菌株為主，占比達到35.23%。隨著窖泥的發酵，代謝產生的H2含量不斷積累，而甲烷菌的存在能夠利用H2和CO2生成甲烷，降低窖泥中H2含量而提升窖泥質量，這表明二車間的窖泥已經處于成熟階段。窖齡最短的五車間主要以產丁酸的瘤胃球菌屬為主，占比達到43.44%，這表明五車間的窖泥處于酸代謝活躍時期。窖齡居中的三車間窖泥樣品的微生物多樣性明顯高于其他2個車間，而且占比最高的甲烷粒菌屬菌株僅為6.66%，推測該車間窖泥中的微生物類群正處于活躍的演替階段，物質和能量代謝正在從活躍階段向穩定階段轉變(表3)。

表3 敘府酒業釀造生境中細菌群落結構比較

注：*，屬水平上進行細菌群落結構分析，且只顯示豐度大于1%的物種。a，窖齡30年；b,窖齡20年；c，窖齡15年。

3 結論

本研究利用高通量測序技術全面解析宜賓產區濃香型白酒釀造生境中的微生物菌群結構，采集的樣品均呈現出從多種微生物共同作用到功能微生物主要發揮作用的趨勢，片球菌和乳桿菌為酒醅發酵結束期的優勢微生物。本研究為后續探究濃香型白酒釀造過程中優勢微生物的功能，解析白酒釀造機理，提升白酒品質提供了重要依據。