榨菜腌制過程中變紅或產膜現象相關微生物的分離鑒定

楊吉霞，張玉禮，王學錦，賀稚非*

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400716)2(重慶市涪陵榨菜集團股份有限公司，重慶, 408000)

涪陵榨菜采用莖瘤芥(Brassicajuncea，俗稱青菜頭)腌制加工，是世界三大名腌菜之一[1-2]。榨菜加工工藝包括3次腌制和3次壓榨：第1次腌制采用菜塊質量分數2%～4%的食鹽腌制約7 d，第2次加入4%～8%食鹽腌制20～30 d，第3次以10%左右食鹽用量腌制4～6月，每次腌制結束時都將榨菜起池、壓榨去水[3]。

榨菜腌制過程中偶爾出現菜塊表面變紅，或者表面有一層膜的現象，有時引起菜塊變軟甚至腐敗。目前對引起菜塊變紅、產膜現象的原因不清楚。本研究采集變紅、產膜的菜塊樣品，分離鑒定相關的微生物，并且用Illumina Miseq測序鑒定原料表面的微生物種類，分析是否來源于青菜頭原料。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗原料

用無菌操作采集變紅的榨菜樣品4個，編號為H1～H4(圖1-A)，采集有膜的樣品5個，編號為M1～M5(圖1-B)。

A-變紅；B-產膜

1.1.2 實驗試劑

酵母與霉菌培養基(yeast maltose，YM)、MRS、營養肉湯(nutrient broth, NB)、平板計數(plate count agar,PCA)培養基，青島海博生物技術有限公司；細菌基因組DNA提取試劑盒(DP302)、酵母基因組DNA提取試劑盒(DP307)、普通瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒(DP209)，天根生化科技(北京)有限公司；DNeasy mericon Food Kit (69514)，德國Qiagen公司；瓊脂糖Regular agarose G-10，西班牙BIOWEST；1×TE緩沖液(B548106-0500)、50×TAE緩沖液(B548101)、PBS緩沖液(pH 7.3～7.5，B640435)，生工生物工程(上海)股份有限公司；Premix Taq、RNase-free water、DL2 000 DNA ladder marker，寶生物工程(大連)有限公司。

引物：本研究所用引物如表1所示，委托生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.1.3 儀器與設備

JJ1000 電子天平，常熟市雙杰測試儀器廠；303-4B電熱恒溫培養箱，上海葉拓儀器儀表有限公司；HBM-400D拍擊式均質儀，天津市恒奧科技發展有限公司；BX43F 生物顯微鏡，OLYMPUS；T100 PCR儀、Power pacbasic電泳儀，美國Bio-Rad公司；SW-CJ-2F潔凈工作臺，蘇州安泰空氣技術有限公司；G:BOXEF凝膠成像系統，美國gene公司；P100/P100+超微量分光光度計，美國Pultton公司；Mini-Q超級純水儀，法國Synergy公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 榨菜變紅或產膜相關菌株的分離純化和形態學鑒定

變紅的榨菜樣品：取變紅部位，加入無菌均質袋中，加入已滅菌50 mL PBS緩沖液，用拍擊式均質儀均質1 min，溶液用0.22 μm濾膜過濾，用接種針挑取濾膜上的微生物分別在添加80 g/L NaCl的YM、MRS、NB、PCA培養基上劃線分離，于(30±1)℃培養3 d，選出紅色菌落的菌株，經過至少連續3次劃線分離，得到純化的菌株，將菌株接種在已滅菌的榨菜中，每株菌接種3份榨菜，另設1組作為空白對照，于(30±1)℃培養，觀察是否出現變紅現象，如果變紅，再從此榨菜上分離純化得到純菌株，鑒定其性狀是否與接種的菌株相同[8]。

產膜的榨菜樣品：用接種針挑取菜塊上的膜，分別在添加80 g/L NaCl的YM、MRS、NB、PCA培養基上劃線分離，于(30±1)℃培養3 d，經過至少連續3次劃線分離，得到純化的菌株，將菌株逐一接種到適宜的液體培養基中培養48 h，如果在培養液表面形成菌膜，將菌株接種在已滅菌的榨菜中，每株菌接種3份榨菜，另設1組作為空白對照，于(30±1)℃培養，觀察是否出現產膜現象，如果產膜，再從此榨菜上分離純化得到純菌株，鑒定其性狀是否與接種的菌株相同。

將變紅和產膜菌株用適當的培養基培養，觀察菌落形態，做革蘭氏染色，觀察顯微形態并且拍照。

1.2.2 菌株的分子生物學鑒定

利用天根公司細菌或者酵母基因組DNA提取試劑盒提取分離微生物的基因組DNA。通過PCR擴增細菌16S rDNA序列、酵母菌26S rDNA序列，25 μL PCR反應體系包括2×Premix Taq buffer (TAKARA) 12.5 μL、前后引物(10 μmol/L)各0.8 μL、DNA 2 μL、ddH2O 8.9 μL；擴增程序為：94 ℃預變性3 min，30個循環(94 ℃變性40 s，適宜的溫度退火40 s，72 ℃延伸1 min)，最后72 ℃延伸10 min。其中細菌的引物為27F和1492R，退火溫度為57 ℃[4]；真菌的引物為NL1和NL4，退火溫度為54 ℃[6-7]。擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠電泳，用凝膠成像系統觀察條帶并且拍照。將PCR產物用瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒純化后，送生工生物(上海)有限公司測序，測序結果通過NCBI BLAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)比對鑒定，并用MEGA7.0軟件進行系統發育分析。

1.2.3 菌株產酶實驗

將酪蛋白或者可溶性淀粉以10 g/L的量加入培養基中，接種菌株，(30±1)℃培養48 h，采用平板水解圈法初步檢測菌株是否產生蛋白酶或者淀粉酶。

1.2.4 Illumina MiSeq法分析青菜頭原料表面微生物的種類

取原料堆中不同部位的青菜頭10顆，用滅菌的PBS溶液清洗青菜頭表面，洗液用0.22 μm濾膜過濾，用20 mL 滅菌的PBS溶液充分洗下濾膜上的微生物，用DNeasy mericon Food Kit試劑盒按照說明書的步驟提取微生物的宏基因組DNA[9]。用338F和806R引物擴增16S rDNA的V3-V4可變區，PCR反應體系和程序與“1.2.2”相同，退火溫度為55 ℃[5]。經過驗證的宏基因組DNA送上海美吉生物醫藥科技有限公司，采用Illumina MiSeq PE300平臺對16S rDNA的V3-V4可變區進行高通量測序，測序引物為338F和806R，長度為468 bp[5]。

將獲得的序列采用QIIME軟件包(quantitative insights into microbial ecology，定量分析微生物群落，version 1.7)[10]進行生物信息分析。采用UCLUST軟件在97%的相似度水平下對序列進行聚類分析，獲得分類操作單元(operational taxonomic units，OTUs)[11]，將序列基于Silva(silva128/16s_bacteria，https://www.arb-silva.de/documentation/release-128/)[12-14]細菌數據庫進行比對，分類置信度0.7，得到每個OTU對應的物種分類信息，生成不同分類水平上的物種豐度表。用R繪制樣品在屬水平下的物種構成圖。部分數據分析在上海美吉生物醫藥科技有限公司的I-Sanger云平臺中完成(https://www.i-sanger.com/)。

1.2.5 NCBI序列號

本研究中菌株的16S rDNA序列均上傳至NCBI的GenBank，變紅相關菌株的序列注冊號為MN445590至MN445593，產膜相關菌株的序列注冊號為MN445594至MN445606。青菜頭原料樣品表面微生物的16S rDNA V3-V4序列存入NCBI 的Sequence Read Archive (SRA) 數據庫(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/sra)，BioProject ID為PRJNA565341。

2 結果與分析

2.1 榨菜變紅或產膜現象相關菌株的菌落形態和顯微形態鑒定

本研究從變紅榨菜樣品中分離、純化、驗證得到4株引起變紅現象的菌株，其菌落形態和顯微形態如表2和圖2所示。從產膜榨菜樣品中鑒定出引起產膜現象的菌株有13株，其菌落形態和顯微形態如表2和圖3所示，圖4為部分菌株產膜驗證實驗照片。

表2 榨菜變紅或產膜現象相關菌株的菌落形態和顯微形態

a-h1-1;b-h2-1;c-h3-1;d-h4-1

a-m1-1;b-m1-2;c-m2-1;d-m3-1;e-m3-2；f-m3-3;g-m3-4;h-m3-5;i-m4-1;j-m4-2;k-m5-1;l-m5-2,m-m5-3

a-m1-1;b-m2-1;c-m3-1;d-m4-1

2.2 榨菜變紅或產膜現象相關菌株的分子生物學鑒定

4株變紅相關菌株和13株產膜菌株的基因組DNA均采用27F和1492R引物PCR擴增成功，用NL1和NL4引物擴增沒有條帶，所以菌株均為細菌。將菌株的16S rDNA序列輸入NCBI blast網頁中比對鑒定菌種，其結果如表3所示，菌株m4-1與參考序列的query coverage(覆蓋度)為99%，percent identity(序列相似度)為99.48%，綜合分析它與參考序列的相似度為98.49%，其余菌株與參考序列的相似度均大于99%。通常認為菌株間16S rDNA基因序列同源性大于97%很可能屬于同一個種[15-16]，根據NCBI比對結果列出了序列相似性最高的種。

圖5為用MEGA7.0軟件構建的榨菜變紅現象相關菌株16S rDNA序列的進化樹圖，待測菌株的16S rDNA序列均與相應的參考序列正確聚類，驗證了菌種鑒定的合理性。圖6為產膜現象相關菌株的系統進化樹圖，除了Bacillusamyloliquefaciens與Bacillusvelezensis的待測菌株和參考序列聚集在同一個分枝之外，其余菌種單獨聚為一個分枝，并且待測菌株的序列均與相應的參考序列正確聚類。WANG等的文獻報道Bacillusamyloliquefaciens與Bacillusvelezensis的16S rDNA序列相似度達到99.7%，在構建的系統進化樹中也聚集為一個分支[17]，與本研究結果一致。

表3 菌株在NCBI blast網頁中比對鑒定結果

圖5 榨菜變紅現象相關菌株的16S rDNA序列進化樹圖

圖6 榨菜產膜現象相關菌株的16S rDNA序列進化樹圖

2.3 菌株產酶活性

能夠產生蛋白酶(即水解酪蛋白)的菌株包括h1-1、h3-1、m1-1、m1-2、m2-1、m3-1、m3-3、m3-4、m4-1、m4-2、m5-2、m5-3。能夠產生淀粉酶(即水解可溶性淀粉)的菌株包括h1-1、h3-1、h4-1、m1-1、m2-1、m3-1、m3-2、m3-4、m3-5、m4-2、m5-2、m5-3。部分菌株的產酶實驗如圖7所示。

a～e-m3-1、m1-2、m3-1、m4-1、m5-2(產蛋白酶實驗)；f～j-h1-1、m2-1、m3-2、m4-2、m5-2(產淀粉酶實驗)

2.4 青菜頭原料表面微生物種類鑒定

采用Illumina Miseq對青菜頭原料表面微生物DNA的16S rDNA基因V3-V4區段進行高通量測序，鑒定細菌的種類構成，總共產生了53 624條raw reads, 平均序列長度為447.58 bp，Coverage 1.000，測序深度滿足生物信息學分析要求。鑒定出OTU總數為173，門、綱、目、科、屬、種數量分別為：7、12、29、52、91、132。最優勢的屬為Pseudomonas(62.54%)，其他優勢屬(相對豐度>1%的)還包括：unclassified_f_Enterobacteriaceae(6.34%), norank_c_Cyanobacteria(6.34%)，Erwinia(3.80%)，Acinetobacter(2.79%)，Janthinobacterium(2.70%)，Duganella(2.67%)，Chryseobacterium(2.61%)，Flavobacterium(2.34%)(見圖8)。從青菜頭原料中沒有鑒定出芽孢桿菌屬(Bacillus)，然而細菌群落中存在很低豐度的Rhodococcus(0.184 8%)和Staphylococcus(0.026 4%)，沒有鑒定到種的水平，如表4所示。由此可初步推測，引起變紅現象的嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivorans)和引起產膜現象的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)有可能來源于青菜頭原料。

圖8 青菜頭原料表面細菌在屬水平的種類構成圖

表4 從青菜頭原料中鑒定出的Staphylococcus和Rhodococcus屬信息統計

3 討論

本研究鑒定出引起榨菜變紅的菌種包括嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivorans)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)3種。YOON等[18]將1株降解吡啶的菌株鑒定為嗜吡啶紅球菌，革蘭氏陽性球菌，菌落為橙色，與本研究中分離鑒定的嗜吡啶紅球菌形態一致。鄭曉冬等分析得出紅球菌色素是類胡蘿卜素，非單一色素[19]。TAKAICHI等的文獻也指出紅球菌屬的色素為類胡蘿卜素[20]。由此可推測，嗜吡啶紅球菌可能因為產類胡蘿卜素而使菌落呈橙(紅)色。目前比較少文獻報道Bacillusamyloliquefaciens、Bacilluslicheniformis的菌落為紅色。

本研究鑒定出產膜菌株種類包括：解淀粉芽孢桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens)、貝萊斯芽孢桿菌 (Bacillusvelezensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌 (Bacillusaryabhattai)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。現有的文獻EP映證了這7種菌都能形成生物膜[21-27]。芽孢桿菌屬的菌體在溫度、pH值、營養、或者菌體自身產生的胞外DNA、信號肽等條件的誘導下，吸附在固體表面，繁殖形成微菌落，菌體進一步生長并分泌大量的胞外多聚物(多糖、蛋白質或者核酸)，將菌體細胞包被并聚集在一起，形成成熟的生物膜，菌體的運動功能相關基因表達下調，失去運動能力，以維持生物膜的穩定性。生物膜的形成有利于增強菌體對不良環境的耐受性[23-26]。表皮葡萄球菌形成生物膜主要經過2個階段：菌體首先在蛋白質AtIE(具有黏附玻連蛋白活性)和Fbe(可能與宿主的纖維蛋白原結合)的幫助下黏附于固體表面，然后在PIA和AAP蛋白介導下相互聚集，形成成熟的生物膜[27]。在產膜相關菌種中，蠟狀芽孢桿菌和表皮葡萄球菌是機會病原菌，蠟狀芽孢桿菌的部分菌株產生毒素，引起腹瀉或嘔吐[28]；表皮葡萄球菌是醫院感染(傷口或者血流感染)的重要菌種之一[29]。

變紅和產膜相關菌株大多產生淀粉酶或蛋白酶。涪陵青菜頭原料的蛋白質含量高達5 800 mg/500 g，總糖含量為4 300 mg/500 g，菌株可能通過產生酶降解原料中的蛋白質或糖類成分引起榨菜腐敗。

本研究采用高通量測序法分析了青菜頭表面細菌的種類構成，結果顯示葡萄球菌屬(Staphylococcus)和紅球菌屬(Rhodococcus)以很低的豐度存在，沒有發現芽孢桿菌屬。由此推測，引起變紅現象的嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivorans)和引起產膜現象的表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)有可能來源于青菜頭原料，芽孢桿菌屬菌株的來源有待進一步分析。

4 結論

本研究鑒定出與榨菜變紅現象相關的菌株有4株，包括3個菌種：嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivorans)、解淀粉芽孢桿菌(Bacillusamyloliquefaciens)、地衣芽孢桿菌(Bacilluslicheniformis)。

本研究鑒定出引起榨菜產膜的菌株有13株，包括7個菌種：解淀粉芽孢桿菌 (Bacillusamyloliquefaciens)、貝萊斯芽孢桿菌 (Bacillusvelezensis)、阿耶波多氏芽孢桿菌 (Bacillusaryabhattai)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、地衣芽胞桿菌(Bacilluslicheniformis)、蠟狀芽孢桿菌(Bacilluscereus)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)。

嗜吡啶紅球菌(Rhodococcuspyridinivorans)和表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis)有可能來源于青菜頭原料。