超細化豆渣作為皮克林乳液穩定劑的特性研究

譚天儀，李璟，夏銳，李夢颯，葉發銀,2*，趙國華，朱海妮

1(西南大學 食品科學學院，重慶，400715)2(食品科學與工程國家級實驗教學示范中心(西南大學)，重慶，400715)

乳液是食品中常見的分散體系，其對食品品質形成、風味改善、營養素消化吸收控制，以及活性成分生物利用度提升等方面具有重要作用[1-2]。乳液是動力學不穩定體系，需要依賴乳化劑防止破乳或乳析。與磷脂、吐溫等水溶性乳化劑制備的常規乳液不同，皮克林乳液是依靠固體粒子穩定的分散體系[3]。這些固體粒子的尺寸一般在微米級或納米級，能在油-水界面上形成不可逆粒子吸附層，并借助粒子間強毛細管作用使皮克林乳液保持穩定[4-5]。構建食品級皮克林乳液的關鍵是開發新型顆粒乳化劑并探究對其乳液的穩定機理。2001年，ANTON等[6]率先報道了蛋黃顆粒穩定的皮克林乳液(油相分數φ=0.3)，并采用透射電子顯微鏡觀測到蛋黃顆粒在油滴上形成的吸附層。隨后食品級皮克林乳液研究十分活躍，已報道的食品級皮克林顆粒可分為四類：多糖類顆粒(淀粉顆粒[5]、納米纖維素[7]、幾丁質納米晶體[8]、殼聚糖納米顆粒[9]等)，蛋白質類顆粒(玉米醇溶蛋白[10]、小麥醇溶蛋白[11]、大豆蛋白[12]、鐵蛋白等[13])、脂質顆粒[14]以及其他納/微顆粒[15-16]。有些皮克林乳液已經應用于風味包埋[17]、活性成分遞送[7, 18]、功能性食品設計[19-20]等領域。

當前，果蔬加工殘渣資源化利用度低，向食品中直接添加會造成口感粗糙，降低食品品質[21]。常通過改性將其轉化為水溶性組分，或采用超微粉碎技術得到超細化粉體來提升加工特性[22-23]。NUSHTAEVA研究發現肉桂粉(添加量5%)可制備穩定的皮克林乳液(平均粒徑78 μm)，且兼具抗氧化和抗菌特性[24]。JOSEPH等采用高能磨、高壓微射流處理得到微米級可可粉顆粒，其添加量2.5%，油含量20%時，制備的皮克林乳液靜置存放90 d液滴尺寸無顯著變化[25]。LU等報道了研磨對市售纖維素水不溶性顆粒Sigmacell Cellulose Type 20的乳化能力的影響，超細化處理后，纖維素水不溶性顆粒的粒度從10～90 μm下降到38～671 nm，可制備得到粒徑40～60 μm的皮克林乳液，存放30 d未發生顯著失穩現象[26]。上述研究對加工殘渣為起始材料的顆粒乳化劑開發起到了借鑒作用。本文采用高能磨處理豆渣得到超細化顆粒，研究其作為皮克林乳液穩定劑的特性，并探討pH、離子強度等環境因素對乳液穩定性的影響。

1 材料與方法

1.1 原料及試劑

濕豆渣，實驗室自制，反復水洗去除可溶性組分后，60 ℃熱風干燥，粉碎過120目鋼篩備用；玉米油(福臨門非轉基因壓榨)，中糧集團有限公司；NaCl，NaOH，濃HCl，均為分析純，重慶川東化工(集團)有限公司。

1.2 儀器與設備

Labstar實驗室砂磨機，德國Netzsch-Geratebau GmbH公司；JEM 1200EX透射電子顯微鏡，日本電子株式會社；PHS-3C型pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；T25數顯型高速分散機，德國IKA集團；Sartorius電子天平，北京賽多利斯儀器系統有限公司；BX53生物顯微鏡，日本OLYMPUS株式會社；5810型臺式高速離心機，德國艾本德股份公司；Mastersize2000激光粒度分析儀，英國馬爾文公司；MCR302高級流變儀，奧地利安東帕公司。

1.3 方法

1.3.1 超細化豆渣制備

采用Labstar型實驗室砂磨機對豆渣進行濕磨。條件為：研磨介質ZetaBeads(0.4 mm)，研磨功率3 kW，研磨速度34 00 r/min，理論循環指數18/h，研磨溶劑為去離子水，料液比1∶10，研磨腔體溫度通過水循環保持在25 ℃以下。分別在120、240、480、720 min時取出料液，備用。

1.3.2 超細化豆渣基本組成分析

超細化豆渣中蛋白質含量按照GB 5009.5—2016《食品中蛋白質的測定》中的凱氏定氮法測定；脂肪含量按照GB 5009.6—2016《食品中脂肪的測定》中的索氏抽提法測定；灰分含量按照GB 5009.4—2016《食品中灰分的測定》的方法測定；總膳食纖維、可溶性膳食纖維和不溶性膳食纖維含量參考GB 5009.88—2014《食品中膳食纖維的測定》測定。

1.3.3 超細化豆渣結構及懸浮性質表征

將超細化濕豆渣加去離子水稀釋10倍，在超聲波清洗器中分散10 min，得到質量分數為1%的漿液，倒入量筒中靜置，考察其懸浮穩定性；另吸取少許滴加在銅網上，空氣中自然干燥，用JEM 1200EX透射電子顯微鏡觀測豆渣顆粒的顯微結構；吸取1 mL稀釋后的漿液放入樣品池中，采用Mastersize2000型激光粒度分析儀測定粒度及ζ-電位[27]。

1.3.4 皮克林乳液制備

將超細化豆渣漿液加去離子水稀釋、超聲分散調整為不同質量分數(0.2%～1.2%)，加入玉米油，采用T25數顯型高速分散機12 000 r/min高速分散2 min，得到超細化豆渣穩定的皮克林乳液[24-25]。并考察水/油、pH及離子強度(NaCl)對皮克林乳液穩定性的影響。

1.3.5 皮克林乳液表征及分析

皮克林乳液液滴形貌采用生物顯微鏡觀測：乳液制備完畢后，取中間層乳液1～2滴置于潔凈的載玻片上，不蓋蓋玻片，觀測模式BF，于4倍生物顯微鏡下觀測，獲取乳液的顯微鏡照片；通過Nano Measurer軟件統計分析液滴粒徑。

皮克林乳液的乳析指數計算[13]：將20 mL新鮮乳液移至直徑為2 cm的平底試管中，加入0.02%(m/V)的NaN3防止微生物生長，試管口包上2層保鮮膜以防止乳液中的水分揮發。室溫靜置，定期測量乳液分層的樣品底部清液層的高度(HS)，根據公式(1)計算乳液的乳析指數(creaming index，CI)，HT為乳液總高度。

(1)

皮克林乳液流變學分析[27]：采用MCR302型流變儀，測量溫度恒定在25 ℃，平板間距1 mm，剪切速率0～500 s-1，記錄乳液表觀黏度(Pa·s)、剪切應力(Pa)隨剪切速率變化情況。

1.3.6 數據計算及統計分析

所有數據至少重復測定3 次，結果以平均值±標準偏差表示，采用Origin 8.0作圖，采用SPSS 18.0進行單因素方差分析，設置P<0.05為具有顯著性差異。

2 結果與分析

2.1 超細化豆渣的結構及物性

2.1.1 超細化豆渣的顯微結構

由圖1可知，濕磨后豆渣呈不規則形狀，其尺寸隨著濕磨時間延長(120～480 min)而減小，但480 min和720 min兩個研磨時間的樣品的粒度無顯著差異，說明Labstar型實驗室砂磨機存在粉碎極限，超細化豆渣的粒度為0.5～3 μm。豆渣質地堅硬，對其粉碎程度與所采用的設備及能量輸入有關[21-28]。ULLAH等[27]采用德國Netsch-Geratebau公司的MINI ZETA 03E型高速濕磨機結合熱處理，可使豆渣不溶性膳食纖維顆粒的粒徑減小到298.12 nm。

A-濕磨120 min；B-濕磨240min；C-濕磨480min；D-濕磨720min

2.1.2 超細化豆渣的基本組成

由表1可知，濕磨對豆渣中蛋白質、脂肪、灰分、總膳食纖維的含量無顯著影響；但是超細化豆渣中可溶性膳食纖維的比例顯著增加(P<0.05)，表明豆渣在濕磨過程中，一些親水性組分從顆粒中解聚出來，或者由于濕磨剪切產生高壓的機械化學作用使得不溶性組分發生降解，轉化為可溶性組分[21, 27]。

表1 常規粉碎豆渣及超細化豆渣化學組成比較 單位：g/100g干重

注：表中數據為平均值±標準差，同一列不同小寫字母表示不同樣品之間差異顯著(P<0.05)。

2.1.3 超細化豆渣的懸浮特性

由圖2可見，超細化豆渣懸液均勻細膩，具有良好的分散穩定性；而常規粉碎的豆渣顆粒呈淡黃色，在水相中容易沉降。原因在于超細化處理大幅度降低了豆渣顆粒的粒度，且在豆渣顆粒周圍包裹著親水性物質(圖1)，這種結構增加了豆渣顆粒的水力學尺寸[29]，賦予體系更高的黏度[21]。

超細化豆渣懸液采用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH調節pH值為3～8，采用Mastersize2000激光粒度分析儀測定粒度和ζ-電位(25 ℃)。由圖3-A可知，pH值對超細化豆渣的分散性指數(PDI)的影響較小，但是超細化豆渣的平均粒徑受pH值的影響較大。在pH=6時平均粒徑達最小值(1.34 μm)，之后隨著水相酸度增加而增大，pH=3時平均粒徑增加88%。中性及弱堿性條件(pH=7～8)下，平均粒徑略有增加但不顯著(P>0.05)，這一現象與大豆蛋白質在等電點處溶解性最差這一特性類似。原因在于水相pH影響著顆粒表面的電荷頻率，從而影響顆粒的水合狀態，最終影響到豆渣在水相中懸浮的水力學尺寸[11]。由圖3-B可知，豆渣顆粒的ζ-電位為負值，說明顆粒表面帶有帶負電荷的基團(如羧酸根)[27, 30]；ζ-電位隨著pH值增加而降低，絕對值增加，表明豆渣在中性及弱堿性條件下顆粒表面電荷去屏蔽化，分散性更好，更加穩定[27]。

A-超細化豆渣；B-普通粉碎豆渣

A-豆渣顆粒粒徑及分散性指數(PDI)；B-豆渣顆粒懸液ζ-電位

2.2 超細化豆渣添加量對乳液形成及穩定性的影響

皮克林的制備與傳統乳液的制備方法相似，都是借助于機械攪拌或高速剪切使分散相形成液滴，均勻分布在連續相中，乳化劑吸附或分布在界面形成穩定的乳液[3-5]。由圖4-A可知，當油相分數φ=0.6保持不變，隨著豆渣顆粒添加量增加，乳液層體積隨之增加，且乳液層的穩定性增加。水相中豆渣顆粒質量分數為0.2%時，靜置1 d乳析指數為36.11%；為0.8%時，乳析指數減小至15.00%。由圖4-B可知，豆渣顆粒質量分數為0.2%時乳液液滴平均粒徑較大，且在1～30 d存放期內平均粒徑顯著增加(P<0.05)，隨著豆渣顆粒添加量增加乳液液滴隨之減小，且乳液變得穩定。豆渣顆粒質量分數0.4%～1.2%的樣品，1～30 d未見油析出，乳析指數未發生顯著變化，表明豆渣顆粒不可逆地吸附在液滴界面上，并形成了穩固的空間壁壘，使乳液保持穩定[24, 31]。圖5為乳液液滴的顯微鏡照片，直觀反映制備乳液液滴顯微結構隨豆渣顆粒添加量的變化。值得注意的是，除了豆渣顆粒質量分數為0.2%的乳液液滴尺寸在貯藏期內增加，其他添加量下制備的乳液均具有較好的穩定性。

A-乳液外觀;B-乳液液滴平均粒徑隨時間(1 d、7 d、30 d)變化情況

圖5 三個貯藏時間(1 d、7 d、30 d)的乳液液滴粒徑與豆渣顆粒質量分數的關系圖(比例尺500 μm)

2.3 油相分數對乳液形成及穩定性的影響

水相與玉米油的總體積(20 mL)及水相中豆渣顆粒質量分數(1%)均保持不變，當水油體積比依次為8∶2、7∶3、6∶4、5∶5、4∶6、3∶7，與之對應的玉米油與豆渣顆粒的比例依次為25.0∶1、42.8∶1、66.7∶1、100∶1、150∶1、233∶1(mL∶g)。由圖6-A可知，乳液平均粒徑隨著玉米油占比的增加而增加，原因在于油相分數增加時，分散相界面總面積增加，而豆渣顆粒相對比例在減少，只得形成較大尺寸液滴以減小比表面積，以盡量覆蓋油滴表面[13]。由圖6-B可知，當水油體積比為8∶2時，體系含16 mL水相，4 mL油相，乳化后取出乳液靜置，1 d內乳析指數為46%，即乳液層和下層清液約各占一半，約1/4體積的水參與了乳液形成；隨著體系中水相比例減小，乳析指數隨之下降，主要是下層清液體積減小以及乳液層體積占比增加所致。所有實驗組在貯藏期內未觀測到乳析指數的大幅變化，表明乳液一旦形成即具有良好的穩定性[4, 7]。

2.4 水相pH對皮克林乳液穩定性的影響

為考察pH對乳液穩定性的影響，油相分數(φ=0.6)及豆渣顆粒質量分數(1%)保持不變，調節水相pH=3～8，高速分散(12 000 r/min，2 min)得到樣品，靜置7 d后的外觀照片如圖7-A所示。乳析指數在pH=3時最小，且隨著pH增加持續增加。由圖7-B可知，乳液液滴在pH=3～4時具有最小的粒度，平均粒徑為40～43 μm，乳液液滴隨pH增加而增大，pH=7時平均粒徑為145.2 μm，pH=8時平均粒徑為95.4 μm。圖8為不同pH下的乳液液滴的顯微鏡照片，直觀反映制備乳液液滴顯微結構隨pH的變化。結果表明，1～30 d，制備乳液的油滴尺寸在酸性條件(pH=3～6)變化不顯著，即油滴大小在乳液制備時就已確定，乳液在靜置時能保持較好的穩定性。原因在于水相中豆渣顆粒ζ-電位隨pH升高越來越負，通過靜電斥力作用使吸附界面具有較高的電荷頻率，從而有助于乳液穩定[32]。另一方面，豆渣顆粒懸液中存在的可溶性膳食纖維能增加體系黏度并與吸附層相互作用形成網絡結構，該結構有助于固定液滴[26, 33]。值得指出，pH=7時乳液的油滴尺寸最大，這可能是該條件下豆渣顆粒表面的親水親油平衡值不利于乳液形成[24-25]。

圖6 不同水油體積比下制備乳液的液滴尺寸變化情況(靜置7d)和乳析指數與水/油比關系圖

圖7 不同pH下制備乳液外觀照片(靜置7 d)和不同pH下制備乳液平均粒徑與pH關系圖

圖8 不同pH下制備乳液的顯微鏡照片(比例尺500 μm)

2.5 離子強度對皮克林乳液穩定性的影響

為考察離子強度對乳液穩定性的影響，油相分數(φ=0.6)、豆渣顆粒質量分數(1%)及水相pH=5保持不變，水相中NaCl濃度為50～350 mmol/L。由圖9-A可見，乳液在靜置存放1～30 d乳析指數變化不顯著，均在10%以內。由圖9-B可知，NaCl濃度在100～350 mmol/L對乳液液滴粒度無顯著影響(P>0.05)，但在50 mmol/L時乳液液滴較大。原因可能在于稀濃度的中性鹽(NaCl)解離的正負離子阻斷了豆渣中蛋白質分子鏈上正負電荷間的相互作用，增加了顆粒表面的電荷頻率，顆粒更容易水合，改變了豆渣顆粒的親水親油平衡值，降低了在油滴表面的吸附性能[34]。

2.6 超細化豆渣穩定的皮克林乳液流變學分析

為理解超細化豆渣穩定的皮克林乳液的受應力作用后的流動特性，不同豆渣顆粒質量百分數及不同水相pH條件下制備的乳液進行穩態剪切流變實驗，結果分別如圖10和圖11所示。由圖10-A可知，隨著豆渣顆粒質量分數的增加，乳液的剪切應力-剪切速率曲線不斷上移，表明乳液體系中的網絡結構在逐漸增強。由圖10-B可知，乳液為剪切變稀型流體，隨剪切速率增加，表觀黏度降低。此前有大量報道皮克林乳液的剪切變稀效應[15, 34-35]。ULLAH等[27]在濕磨法制備的納米化豆渣不溶性膳食纖維的穩態剪切試驗中也觀測到了剪切變稀現象。豆渣顆粒穩定的皮克林乳液的剪切變稀效應與乳液液滴在力場中解聚集有關。靜止狀態下，乳液液滴借助顆粒吸附層形成弱的聚集態，使乳液呈現弱凝膠結構，而剪切力破壞了這種結構[15, 36]。從組間比較上看，豆渣顆粒質量分數(1.2%)的樣品體系表觀黏度最高，這是因為豆渣顆粒占比越高，液滴尺寸越小，液滴在分散相中填充越緊密，吸附層及弱凝膠結構越牢固。由圖11可知，水相pH值為3和7的乳液體系具有較高的剪切應力和表觀黏度。pH=3時，乳液液滴最小(圖8)，液滴填充緊密，乳液具有較強的凝膠結構[34, 36]；pH=7時乳液液滴最大(圖8)，且豆渣顆粒處于較充分的水合狀態，因此乳液體系的表觀黏度較大。pH=8時乳液體系的表觀黏度最低，原因在于此時豆渣顆粒粒徑較小而ζ-電位的絕對值最大(圖3)，顆粒之間靜電斥力較強，造成液滴之間相互作用力弱，在應力作用下容易流動。

A-乳液；B-平均粒徑變化

A-剪切應力隨剪切速率變化曲線；B-表觀黏度隨剪切速率變化曲線

A-剪切應力隨剪切速率變化曲線；B-表觀黏度隨剪切速率變化曲線

3 結論

普通粉碎豆渣經濕法超細化處理，可將粒徑降至0.5～3 μm，懸浮穩定性顯著增強，豆渣顆粒中可溶性膳食纖維含量顯著增加，豆渣顆粒懸液ζ-電位為負值。當油相分數φ=0.6，質量分數為0.4%～1.2%的超細化豆渣具有良好穩定皮克林乳液的能力，乳液平均粒徑80～140 μm，靜置30 d仍相當穩定。乳液液滴大小及穩定性與豆渣顆粒添加量、油相體積分數、水相pH和離子強度有關，尤其受體系中油與豆渣顆粒比例、水相pH的影響較大，受測試濃度的NaCl的影響較小。超細化豆渣穩定的皮克林乳液呈現剪切變稀效應，其流動特性受顆粒添加量及水相pH的影響，pH=3時乳液細膩且具有弱凝膠結構。結果表明，超細化豆渣具有作為食品級皮克林乳液穩定劑的應用潛力。