兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白流變學(xué)特征研究

鄒咪，郭全友，湯嘉慧，謝晨，熊澤語，包海蓉,3,4*

1(上海海洋大學(xué) 食品學(xué)院，上海，201306) 2(東海水產(chǎn)研究所，上海，200090)3(上海水產(chǎn)品加工及貯藏工程技術(shù)研究中心，上海，201306)4(農(nóng)業(yè)部水產(chǎn)品加工貯藏保鮮質(zhì)量安全風(fēng)險(xiǎn)評估實(shí)驗(yàn)室(上海)，上海，201306)

大黃魚(Pseudosciaenacrocea)隸屬鱸形目、石首魚科、黃魚屬[1],富含不飽和脂肪酸，根據(jù)現(xiàn)代人們對食品高蛋白、低脂的需求，是適合人類攝取的動物性營養(yǎng)食品[2]，是重要的海洋經(jīng)濟(jì)魚類之一，有中國海洋四大經(jīng)濟(jì)魚類之稱[3]。正是由于其肉質(zhì)鮮美、營養(yǎng)高導(dǎo)致了人們對大黃魚的過度捕撈，其野生資源迅速減少，幾近枯竭。到了20世紀(jì)80年代末，隨著育苗技術(shù)的突破，養(yǎng)殖大黃魚的成活率大大提高，人工養(yǎng)殖技術(shù)越來越成熟，出現(xiàn)了筏式網(wǎng)箱養(yǎng)殖和池池養(yǎng)殖等傳統(tǒng)模式，并出現(xiàn)了圍網(wǎng)養(yǎng)殖和深水網(wǎng)箱等新型養(yǎng)殖模式，主要分布于福建、廣東和浙江等地，大黃魚成為我國六大海產(chǎn)養(yǎng)殖品種之一[4-5]。大黃魚多通框網(wǎng)箱是筏式網(wǎng)箱的一種優(yōu)化，即將多個(gè)小網(wǎng)箱連起來形成的大網(wǎng)箱，但依然存在養(yǎng)殖密度大、水體交換不充分及大黃魚的肉質(zhì)不緊致、魚肉含有較多的脂肪，導(dǎo)致魚肉的口感差等一些品質(zhì)問題。隨著養(yǎng)殖技術(shù)的進(jìn)一步的發(fā)展，出現(xiàn)了新型的養(yǎng)殖模式—深海圍網(wǎng)，這種養(yǎng)殖模式可使養(yǎng)殖空間變大，利于圍網(wǎng)內(nèi)海水與外界海水充分交換，養(yǎng)殖的大黃魚其品質(zhì)更加接近野生大黃魚[6]。

魚肉肌原纖維蛋白很大程度決定了其組織學(xué)品質(zhì)，同時(shí)其形態(tài)特征也是肉質(zhì)的組織學(xué)基礎(chǔ)，因此魚體肌肉的品質(zhì)通常由魚肌原纖維特征來評定[7]。復(fù)雜流體的微觀結(jié)構(gòu)反映在流體的流變性質(zhì)中。在許多流變測量中，動態(tài)測試或小幅度振蕩剪切(SAOS)測試已被最廣泛使用，因?yàn)樗鼘ξ⒔Y(jié)構(gòu)敏感，易于使用，并具有良好的數(shù)學(xué)背景。大黃魚養(yǎng)殖方式和外界環(huán)境差異，其肌原纖維蛋白的組成也會有所不同，這就使得大黃魚的質(zhì)地和流變學(xué)特性上形成一定的差異。為了研發(fā)符合消費(fèi)者需求的產(chǎn)品，在微觀上應(yīng)該清楚大黃魚蛋白的差異，為后期的處理和加工優(yōu)化提供支撐。本研究選用新鮮大黃魚提取其肌原纖維蛋白，通過測試其蛋白的溫度掃描、應(yīng)變掃描、頻率掃描、表觀黏度和大振幅振蕩剪切的流變學(xué)方法探討不同的養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白質(zhì)流變學(xué)特性的差異，通過流變學(xué)特性的分析方法，從微觀角度給予品質(zhì)差異的解釋。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

通框養(yǎng)殖和圍網(wǎng)養(yǎng)殖的大黃魚分別購于福建寧德和浙江臺州養(yǎng)殖場，新鮮大黃魚捕撈后裝在鋪滿碎冰的泡沫箱中通過物流車快速送達(dá)實(shí)驗(yàn)室，取其脊背肉，除去魚鱗、魚皮及魚骨；NaCl、KCl、三羥甲基氨基甲烷(Tris)、順丁烯二酸(Maleicacid)、曲拉通(Triton-100)等均為分析純，購于國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

SG2pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；LRH-100 CL型低溫培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；D-130 電動勻漿機(jī)，維根技術(shù)(北京)有限公司；GL-20B高速冷凍離心機(jī)，上海安亭科學(xué)儀器廠；FPG12800微射流高壓均質(zhì)機(jī)，英國SFP有效公司；UV1100型紫外分光光度計(jì)，廣州罡然機(jī)電設(shè)備有限公司；MCR301流變儀，奧地利安東帕儀器(上海)有限公司。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 肌原纖維蛋白的提取

肌原纖維蛋白的提取參照KATOH等[8]的方法。準(zhǔn)確稱量5 g魚肉，加入40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內(nèi)含0.16mol/L KCl，20% TritonX-100，pH7.5)，均質(zhì)速率為12 000 r/min，每次10 s，停頓5 s，共均質(zhì)2 min，均質(zhì)后離心， 5 000 r/min，離心10 min。離心后，除去上清液，繼續(xù)添加40 mL 40 mmol/L Tris-Maleat緩沖液(內(nèi)含0.16mol/L KCl，pH 7.5)，均質(zhì)，離心，完成后再重復(fù)操作一次。除去上清液后，加入20 mL 0.1 mol/L NaCl溶液，均質(zhì)，離心。棄去上清液，加入40 mL 0.1 mol/L NaCl溶液，均質(zhì)離心，用2層紗布過濾，離心后得到沉淀，即為純凈的肌原纖維蛋白樣品，碎冰冷藏。

1.3.2 肌原纖維蛋白溶液樣品的制備

將肌原纖維蛋白用0.6 mol/L KCl溶液稀釋，通過微射流高壓均質(zhì)機(jī)進(jìn)行均質(zhì)，得到均勻黏稠，無絮狀物體的溶液，用Biuret法[9]測定溶液的蛋白濃度，將2種養(yǎng)殖模式下的魚肉樣品濃度用0.6 mol/L KCl溶液調(diào)整至5 mg/mL。

1.4 肌原纖維蛋白溶液的流變特性測定

1.4.1 溫度掃描

本測試探頭型號為DG26.7，將準(zhǔn)備好的兩種肌原纖維蛋白溶液(濃度5 mg/mL)樣品，吸取5 mL加入到圓筒間隙中。固定應(yīng)變?yōu)?%，角頻率1 rad/s，按1 ℃/min的升溫速率從20℃ 升溫到80 ℃，獲得試樣的彈性模量(G′)。

1.4.2 應(yīng)變掃描

探頭選用DG26.7，應(yīng)變掃描在20℃下測試，角頻率為1 rad/s，應(yīng)變0.01%～100%，測其彈性模量。

1.4.3 頻率掃描

探頭選用DG26.7。在溫度20 ℃，固定應(yīng)變1%，頻率范圍0.1～10 Hz進(jìn)行測試，獲得試樣的彈性模量。

1.4.4 表觀黏度測試

探頭選用DG26.7，在溫度為20 ℃，剪切速率從0.1 s-1升到100 s-1,獲其黏度值。

1.4.5 大振幅振蕩剪切測定

探頭型號為DG26.7，溫度20 ℃，角頻率0.1 rad/s，應(yīng)變1%～1 000%，獲其彈性模量，對其曲線上取點(diǎn)分析，做出Lissajous曲線。

1.5 數(shù)據(jù)分析

采用Origin 8.0，SPSS 19.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 溫度掃描測試

肌原纖維蛋白在流變學(xué)的溫度掃描測試過程中，隨著溫度的提高可較好顯示出形成凝膠的物理變化[10]。按照一般規(guī)律來說，肌原纖維蛋白的G′(彈性模量)在整個(gè)加熱過程中可以分成3個(gè)階段：低于34℃為凝膠的準(zhǔn)備階段(gel setting)；溫度為30～40 ℃，會出現(xiàn)凝膠的弱化階段(gel weakening)；溫度在40～80℃為凝膠的強(qiáng)化階段(gel strengthening)[11]，XIONG等研究雞胸肉肌球蛋白的流變學(xué)特性上得到相似的結(jié)論[12]。在中間過程中，凝膠的G′值降低可能是由于升溫將肌球蛋白尾部的螺旋結(jié)構(gòu)解開，使得蛋白的流動性增強(qiáng),對蛋白的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)產(chǎn)生一定的破壞[13]。隨著溫度的進(jìn)一步升高，凝膠逐漸增強(qiáng)主要是因?yàn)榈鞍自谀圻^程中相互交錯(cuò)的數(shù)量越來越多。因此蛋白在加熱凝聚過程中變性的程度越高, 最后形成的凝膠就有越大的強(qiáng)度。

A-表示溫度20～60℃；B-表示溫度20～80℃

如圖1所示，常規(guī)的曲線趨勢并未在通框養(yǎng)殖和圍網(wǎng)養(yǎng)殖的大黃魚樣品曲線圖中顯現(xiàn)，2種養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白G′沒有下降，只是增大的速率減緩。而其中深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖的大黃魚樣品G′上升速率較大，并且G′比通框養(yǎng)殖的樣品G′偏高，到了后期的凝膠強(qiáng)化階段，該樣品的G′比通框養(yǎng)殖的大黃魚肌原纖維蛋白G′顯著增加。由此可見，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖的大黃魚其肌原纖維蛋白組織結(jié)構(gòu)更緊密，其凝膠強(qiáng)度更強(qiáng)。

2.2 動態(tài)應(yīng)變掃描測試

動態(tài)應(yīng)變實(shí)驗(yàn)?zāi)茌^好地顯現(xiàn)肌原纖維蛋白結(jié)構(gòu)上的變化。動態(tài)應(yīng)變施加的應(yīng)力保持足夠小，產(chǎn)生的應(yīng)變與應(yīng)力呈線性比例，因此，對未知樣品的任何動態(tài)測試必須以應(yīng)力幅度掃描開始，確定了在線性黏彈區(qū)(英文全稱LVER)內(nèi)安全地保持特定樣品測試的幅度后，可以使用頻率掃描進(jìn)行進(jìn)一步的測試，以測量樣品的黏彈性行為[14]。如圖2所示，通框養(yǎng)殖大黃魚樣品G′值開始時(shí)幾乎無變動，隨著應(yīng)變的繼續(xù)增大，呈現(xiàn)下降的趨勢。深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖的大黃魚樣品其G′值開始時(shí)沒有顯著增大，之后也呈現(xiàn)下降的趨勢。可能是由于隨著應(yīng)變的加大，蛋白的緊密網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)遭到了破壞及重排，導(dǎo)致了G′的下降。而當(dāng)應(yīng)變大于2%，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品G′值高于通框養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品。

圖2 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白動態(tài)應(yīng)變掃描測試

2.3 頻率掃描測試

如圖3所示，2種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白的G′與頻率的關(guān)系。由圖3可見，2種樣品的G′隨著頻率的升高而增大。研究顯示G′在頻率掃描過程中表現(xiàn)為恒定不變的為典型凝膠，反之，隨著頻率的變化而變化則是典型的溶膠[15]。2種養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品試樣沒有表現(xiàn)出純凝膠的頻率特性，說明顯現(xiàn)出了溶膠的特性。頻率在0.1～3 Hz，深海圍網(wǎng)的大黃魚樣品其G′較通框模式下的樣品G′數(shù)值偏高，而在3～10 Hz，兩者的G′如表1可見總體上沒有顯著差異，數(shù)值接近。

圖3 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白頻率掃描測試

表1 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白在頻率4、6、8、10Hz時(shí)的G′比較

注：不同小寫字母表示差異顯著。

2.4 表觀黏度測試

樣品在20 ℃條件下黏度值隨剪切速率的變化如圖4所示。隨著剪切速率的增加，2種養(yǎng)殖模式下大黃魚樣品的黏度值都是降低的，并且當(dāng)剪切速率大于20 s-1時(shí)，曲線近似為直線。這一事實(shí)揭示了樣品溶液為非牛頓假塑性流體。剪切速率增強(qiáng)，溶液變稀是由于蛋白大分子鏈局部取向，此外觸變效應(yīng)及分子鏈出現(xiàn)斷裂也會引起假塑性現(xiàn)象[16]。2種養(yǎng)殖模式下大黃魚樣品顯現(xiàn)出了相同的現(xiàn)象，而圍網(wǎng)養(yǎng)殖的大黃魚樣品黏度值比通框模式下的大黃魚樣品黏度值偏高，表明其肌原纖維蛋白黏度更大，蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密。

圖4 兩種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白黏度測試

2.5 大振幅振蕩剪切

研究大黃魚肌原纖維蛋白的流變特性還可以使用大幅振蕩剪切(LAOS)。為了更充分地表達(dá)非線性黏彈區(qū)的流變學(xué)信息，通過應(yīng)力對應(yīng)變分析獲得Lissajous曲線描述非線性黏彈性并進(jìn)行定量分析。當(dāng)應(yīng)變位于線性黏彈區(qū)間內(nèi)，振蕩剪切應(yīng)變數(shù)值較小時(shí)，聚合物常表現(xiàn)出線性黏彈特性，隨著應(yīng)變振幅的增加，在臨界應(yīng)變振幅下其應(yīng)變數(shù)值保持不變，一旦振蕩剪切應(yīng)變超出線性黏彈區(qū)域后，聚合物表現(xiàn)出非線性流變行為，呈現(xiàn)出多重諧波。低于臨界應(yīng)變振幅的區(qū)域被定義為線性區(qū)域，高于臨界應(yīng)變振幅以上的區(qū)域被定義為非線性區(qū)域[17]。在復(fù)雜流體的微觀結(jié)構(gòu)研究中，非線性流變學(xué)能夠提供豐富的附加信息，LAOS可用于定量描述這種復(fù)雜流體。EWOLDT等[18]提出了一個(gè)新的框架來描述大幅度振蕩剪切試驗(yàn)中的復(fù)雜非線性反應(yīng)。在此框架中，區(qū)域剪應(yīng)力與應(yīng)變在Lissajous曲線中的圍成的區(qū)域表示耗散的能量，而在剪應(yīng)力與應(yīng)變率的關(guān)系曲線中則與儲能有關(guān)，可以通過Lissajous曲線所示的圖形來描述樣品在線性和非線性黏彈區(qū)域內(nèi)的流變學(xué)信息，并且進(jìn)行定量分析。若曲線呈現(xiàn)橢圓形則表明在線性黏彈區(qū)，若偏離橢圓的形狀則是在非線性黏彈區(qū)[19]。在此實(shí)驗(yàn)中，曲線所圍的面積則表示在該應(yīng)力點(diǎn)剪切一周所消耗的能量[20]。劉琴等[7]在研究NaCl濃度對金槍魚肌原纖維蛋白影響時(shí)做出的Lissajous曲線符合這一規(guī)律。而在實(shí)際生產(chǎn)中，LAOS所對應(yīng)的是操作流程中對產(chǎn)品所施加的大幅度的擠壓碰撞，借此來研究對產(chǎn)品造成的影響。

圖5是2種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白試樣在大幅振蕩剪切下的流變圖及其Lissajous圖。在應(yīng)變從0%增加到1 000%過程中，2種樣品皆表現(xiàn)出先保持不變后下降的趨勢，在應(yīng)變小于25%時(shí)，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖下的大黃魚樣品G′高于通框養(yǎng)殖下的大黃魚樣品，從Lissajous圖中同樣能看出在應(yīng)變?yōu)?%時(shí)，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖模式下的大黃魚樣品的Lissajous曲線呈現(xiàn)橢圓形，說明在線性黏彈區(qū)，并且曲線所包圍的面積更大，所消耗的能量更多，說明具備更緊密的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)。而應(yīng)變達(dá)到300 %時(shí)，曲線均偏離了橢圓形，說明蛋白體系表現(xiàn)為非線性黏彈性。以上分析得出深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更加緊密，在大應(yīng)變下不易被破壞。

A-大振幅震蕩剪切圖；B-Lissajous曲線(4%應(yīng)變)；C-Lissajous曲線(300%應(yīng)變)

3 結(jié)論

本研究主要通過動態(tài)剪切的方法，探討了2種養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白的流變學(xué)特性的差異。結(jié)果表明，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖模式下的大黃魚由于養(yǎng)殖空間大，水體交換充足等優(yōu)勢，其肌原纖維蛋白網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更致密，從溫度掃描中可明顯看出，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白樣品試樣G′值高于通框養(yǎng)殖模式下的大黃魚試樣，尤其在凝膠增強(qiáng)階段尤為明顯。在動態(tài)應(yīng)變掃描、頻率掃描和黏度測試中，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白的G′仍然比通框養(yǎng)殖模式下大黃魚肌原纖維蛋白的G′。在LAOS測試中，深海圍網(wǎng)養(yǎng)殖模式下的大黃魚肌原纖維蛋白試樣完成正弦應(yīng)變一周期所消耗的能量更大，其網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)更緊密。