高溫大曲中一株產淀粉酶酵母的分離鑒定及其特性研究

周陽子，邊名鴻，劉文藝，蔣佳靜，許文靜

(四川輕化工大學 生物工程學院，四川 自貢， 643000)

醬香型白酒生產歷史悠久，是我國的著名白酒，香氣幽雅、細膩、酒體醇厚豐滿、回味悠長[1]。高溫制曲是醬香型白酒特殊工藝之一，制曲溫度最高達65 ℃，高溫環境下形成了特殊的微生物區系，產生多種熱穩定性好的酶類，這些酶不僅有利于原料的利用，對醬香型白酒的風格和質量也起著決定性作用[2]。

淀粉酶是一類能夠催化α-D-吡喃葡糖基之間 1-4 糖苷鍵水解的酶類，使淀粉絕大部分轉化為可發酵性糖從而提高淀粉利用率，是衡量大曲質量的重要指標[3-5]。醬香型白酒產酒率低，其主要原因是高溫大曲中微生物所產生的淀粉酶活力不高、糖化發酵不徹底所致[6]。因此，高溫大曲中淀粉酶活力高的土著菌株的篩選及應用具有較大的研究價值。目前對于高溫大曲中淀粉酶產生菌的研究主要集中于細菌、霉菌，對產淀粉酶酵母研究較少，然而大曲中酵母對于淀粉分解也有一定的貢獻，有研究發現生產之前的高溫大曲中存在大量的酵母，這些酵母不僅有產酒產香的能力，有的還具有較強的淀粉分解能力[7]。在白酒固態發酵中后期，隨著氧氣耗盡，霉菌迅速死亡，這類產淀粉酶的酵母對于中后期的雙邊發酵就凸顯其優勢。

本研究對醬香高溫大曲中的1株產淀粉酶酵母進行了分離鑒定，并研究該菌株在不同溫度、pH值、酒精條件下的生長情況，對比分析了該菌利用不同原料的發酵產物，以期對該菌在白酒釀造中的應用提供一定的數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料

曲樣,取自赤水河畔的名優酒廠。大米、小麥、麩皮,均為市售。

1.2 培養基

YPD培養基(g/L)：酵母浸膏10、蛋白胨20、葡萄糖20、瓊脂20，pH自然。

篩選培養基(g/L):酵母浸膏10、蛋白胨20、可溶性淀粉20、瓊脂20，pH自然。

發酵培養基(g/L):酵母膏2、蛋白胨8、可溶性淀粉12、 MgSO4·H2O 0.5、K2HPO41、pH 7.0。

液態培養基：分別加入200 g小麥、大米、麩皮粉碎后加水800 mL，調節pH 5.5～6.0，加入2 000個單位的酶，煮沸10 min，過程中注意適當補水。待冷卻后，加入堿性蛋白酶100 000個單位，55 ℃水浴保溫30 min，結束后取上清液，使用前加葡萄糖至終質量濃度為10 g/L。

1.3 實驗方法

1.3.1 菌種篩選

稱取曲樣10 g，加入生理鹽水90 mL，搖床振蕩30 min制備成菌懸液。逐次稀釋到10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7倍，分別取0.2 mL分別均勻涂布于篩選分離培養基中， 28 ℃恒溫培養2～3 d。觀察菌落周圍出現的透明圈大小，挑選透明圈直徑與菌落直徑比最大的菌落進行純化，觀察菌落形態和顯微形態。

1.3.2 菌株的鑒定

通過顯微鏡進行形態鑒定[8-9]。采用酵母基因組DNA 提取試劑盒提取該酵母基因組DNA，根據參考文獻[10-11]，采用引物ITS1(5′-TCCGTAGGTGAAC-CTGCGG-3′)和ITS4(5′-TCCTCCGCTTATTGATAT-GC-3′)參照WHITE[12]的方法擴增 ITS 區基因。將擴增產物送北京擎科新業生物技術有限公司測序，將最終測序結果在NCBI 中進行BLAST 比對，并對近似序列進行系統發育學分析。

1.3.3 菌株生長和產酶曲線的測定

將純化好的酵母菌株制成菌懸液(菌液OD600=0.266)，按接種量4%接種于發酵培養基中，于28 ℃、160 r/min條件下振蕩培養。每隔2 h取樣，離心收集上清液測定酶活力，同時收集菌體、測定菌體干重，繪制生長曲線和產淀粉酶曲線。

1.3.4 耐受特性分析

以OD600為指標，在原有細菌液體培養基的基礎上，分別考察溫度(31、34、37、40、43、46、49 ℃)，pH值(1、1.5、2、2.5、3、3.5、4、4.5、5)，酒精體積分數(10%、12%、14%、16%、18%、20%)，NaCl質量分數(10%、12%、14%、16%、18%、20%)、葡萄糖質量分數(10%、15%、20%、25%、30%、35%、40%)5個因素對細菌生長情況的影響，恒溫搖床培養24 h測定數據。

1.3.5 分析方法

淀粉酶的測定方法：比色法[13]；總酸測定方法[14]：酸堿滴定法；總酯測定方法[15]：指示劑法；揮發性物質測定方法：準確稱取樣品2 g，裝入5 mL頂空樣品瓶中，加入質量濃度為200 mg/L 的乙酸丁酯內標50 μL。SPME 條件：溫度設為70 ℃，平衡時間為15 min，萃取時間為50 min。GC-MS 進樣口解吸4 min，GC-MS 分析條件參考吉彩婷[16]的方法。將檢測結果與數據庫中質譜信息進行比對，確定揮發性風味成分。

2 結果與分析

2.1 產淀粉酶酵母篩選

將樣品稀釋涂布于淀粉培養基，28 ℃恒溫培養24 h，篩選出1株酵母有較大的透明圈，命名為酵母JM，其菌落直徑與透明圈直徑及其比值見表1，透明圈、菌落、顯微形態圖見圖1。淀粉水解圈較大，菌落為乳白色，圓形，表面干燥，不易挑起。放大10倍的菌落圖可以觀察到菌落表面為絨毛狀。

圖1 透明圈、顯微形態及菌落(右一為放大10倍菌落形態)

表1 菌落直徑與透明圈直徑及其比值

2.2 菌種鑒定

采用MEGA軟件進行系統發育樹分析，結果如圖2所示。菌株JM與2株扣囊復膜酵母聚在一起，且相似度為100%。結合顯微形態，初步將該菌株歸屬于扣囊復膜酵母屬。

圖2 產淀粉酶酵母JM的系統發育學分析

2.3 生長曲線及產淀粉酶曲線

酵母JM生長及產酶情況如圖3所示，該菌株在12 h之前生長較快，12 h后菌體濃度趨于穩定。該菌株在4 h前，菌體處于遲滯期，酶活較低，10 h后進入快速產酶期，12 h左右酶活最高達1 452 U/mL。由圖3可以看出產酶和菌體生長偶聯。

圖3 酵母JM的生長及產酶曲線

2.4 耐受性研究

2.4.1 溫度耐受性

發酵溫度升高有利于酶促反應的進行，但是高溫可導致細胞膜破壞、酶失活，代謝活動減弱[17]。因此確定菌株對溫度的耐受能力很有必要。由圖4可知，該菌在37 ℃時生長最好，比一般酵母最適生長溫度高，當溫度達到40 ℃后，菌株生長受到一定抑制，說明其耐溫性良好。在糖化及發酵過程中升溫幅度較大，耐溫性好的微生物更有利于酒類釀造。

圖4 不同溫度對酵母JM生長的影響

2.4.2 pH值耐受性

pH能改變微生物細胞中的電解質，從而對微生物的生長代謝造成一定影響[18]。由于發酵環境為酸性環境，發酵產酸快，pH較低，因此對釀酒微生物耐酸性要求較高。由圖5可知，pH 4.0是酵母JM最適生長pH值，隨著pH值下降，菌體生長逐漸受到抑制， 在pH 2.0的強酸性環境中仍能生長，表現出較強的耐酸能力。

圖5 不同pH值對酵母JM生長的影響

2.4.3 高糖耐受性

糖不僅是發酵生產乙醇的主要基質，也是酵母賴以生存的能源物質。但是高濃度的糖對酵母生長有抑制作用，高滲透壓會導致酵母細胞水分流失。由圖6可知，葡萄糖質量分數在20%時菌體干重最大，當含糖質量分數達到40%時，菌株仍繼續生長，表現出良好的耐高糖特性。

圖6 不同糖度對酵母JM生長的影響

2.4.4 滲透壓耐受性

由圖7中可知，酵母JM對于滲透壓表現出較高的耐受性，在NaCl質量分數為14%中生長菌絲干重最大，在NaCl質量分數為20%時依然正常生長。在NaCl質量分數為17%時酵母JM生長受到抑制，在NaCl質量分數為20%時酵母JM仍能繼續生長。

圖7 不同鹽濃度對酵母JM生長的影響

2.4.5 酒精耐受性

酒精是大曲中酵母菌厭氧發酵產物，霉菌和酵母在高濃度酒精環境中都受到一定的抑制，酒精對細胞的抑制作用很復雜，主要表現在抑制酵母的增殖速度、存活性和發酵力3個方面[19-22]。因此在白酒發酵過程中，酵母菌酒精的耐受能力對出酒率有較大影響。由圖8可知，酵母JM的生長隨著酒精含量(體積分數)的增加而減弱，在含量(體積分數)酒精為20%時仍然能夠生長，表現出了良好的酒精耐受性。

圖8 不同酒精濃度對酵母JM生長的影響

2.5 液態發酵試驗

2.5.1 不同原料液態發酵產物理化指標分析

利用該酵母分別在大米、麩皮、小麥3種不同培養基進行液態發酵，如圖9所示，小麥培養基發酵產生的酒精、總酸、總酯含量分別為9.3%(體積分數)、3.4 g/L、2.2 g/L，均高于麩皮培養基和大米培養基。

圖9 不同原料液態發酵發酵理化分析

2.5.2 不同原料液態發酵產物揮發性成分分析

由表2所示，酵母JM在小麥、麩皮、大米發酵液中發酵產生的香味成分差別較大，分別鑒定出38、15、29種揮發性成分。檢出種類最多的是酯類化合物，這類化合物是飲料酒中重要的呈香呈味物質。大米發酵液中相對含量最高的是帶有愉快果香的乙酸丁酯；小麥發酵液中辛酸乙酯、乙酸丁酯相對含量都較高，這類物質呈舒適的水果果香；麩皮培養基中含量最高的是具有椰子樣香氣的十一酸乙酯，感官嗅聞也呈類似結果。酵母JM在3種培養基中均檢出較高含量具有清甜的玫瑰樣花香的苯乙醇，在大米培養基中相對含量最高。在小麥培養基中除乙醇和苯乙醇外其他醇類物質含量均為少量。大米培養基除乙醇外，還含6種醇類其中含量較高的是3-丁炔-1-醇、環丁醇、異戊醇、苯乙醇。除此之外，在麩皮培養基中檢出較高含量具有玫瑰、柑橘等香氣的壬醛，小麥培養基中也檢測出含量較少的醛酮類物質，分別是壬醛、椰子醛、甲基壬基甲酮，濃度低時呈類似柑橘、杏仁的香味[23-25]。

表2 不同原料液態發酵的風味物質 單位：%(相對含量)

續表2

分類物質名稱物揮發性風味成分小麥麩皮大米壬醛0.0417.63醛酮類椰子醛0.07甲基壬基甲酮0.031,2,3,4-四氫萘0.071,3-二甲氧基苯1.1715-冠醚-50.0818-冠醚-60.05其他物質2,4-二叔丁基苯酚0.120.114-乙基愈創木酚0.151.80苯酚0.68蝶呤-6-羧酸3.32氯苯0.561.20茚滿0.080.06

3 結論

采用淀粉平板透明光圈法從高溫大曲中篩選得到1株產淀粉酶菌株JM，結合顯微形態及分子生物學鑒定為扣囊復膜酵母。通過產淀粉酶能力、耐受性、液體發酵試驗，發現酵母JM具有較好的產淀粉酶能力及產香能力，且對于溫度、pH、酒精度的耐受性好，初步說明該菌株在酒類釀造方面具有很好的應用潛質，后續研究可圍繞該菌株的綜合性能及與釀酒酵母協同發酵等方面展開。