溶膠-凝膠包埋法提高丙酮酸氧化酶穩定性

劉冰，姚兵莉，張夢君，楊曄，周逸純，張建國

(上海理工大學 醫療器械與食品學院，食品科學與工程研究所，上海，200093)

丙酮酸氧化酶(pyrvate oxidase，POD)是一種主要用于食品、生物發酵制品檢測的重要用酶。食品和生物發酵系統中的丙酮酸、無機磷酸、尿素、丙酮酸激酶、3-巰基丙酮酸硫轉移酶、丙氨酸氨基轉移酶等物質都可以利用POD檢測[1]。POD最早發現于大腸桿菌中，之后又在植物乳桿菌、綠色氣球菌、變形桿菌、人細胞等多種生物中被發現。不同來源的POD具有不同的生理功能。根據POD所需的輔基或輔酶因子不同，POD可分為二類。一類是轉移2個電子到氧分子中，產生過H2O2。如來自德氏乳桿菌的POD、綠色氣球菌的POD[2]。另一類是不以氧分子為直接受體，不產生過氧化氫。如來自大腸桿菌的POD。由于第一類POD可以產生H2O2，所以常與過氧化氫酶聯合用于物質的檢測。KEHR等首先制備基于POD的電化學生物傳感器測定丙酮酸含量[3]。MIZUTZNI等制備的多離子絡合物膜固定POD傳感器展現了高靈敏度的優點[4]。目前，POD可以快速測定發酵液中丙酮酸含量[5]。POD試劑盒測定丙酮酸激酶具有時間短，準確性高，誤差小等優點[6]。但是，來自野生型綠色氣球菌的POD產量較低，為120 U/L[7]。近年來，采用基因工程技術分別將POD的產量陸續提高到670[8]、1 078[9]、3 307[10]、 4 106.9[11]、17 194.9[12]、 21 243.3 U/L[13]。由于pH和溫度對POD性質的影響較大，所以提高POD穩定性將更有利于POD應用。由于POD是一個四聚體，所以保持POD的四聚體結構將有利于提高POD穩定性。近年來，溶膠-凝膠包埋法(sol-gel encapsulation)已成為環境友好，高效固定化生物催化劑的方法[14-15]。它將酶分子相對固定在一個有限空間內，避免酶結構大幅度改變而喪失活力[16]。而且，溶膠-凝膠包埋法可以制備納米級別的固定化酶，有利于高效發揮催化作用[17]。溶膠-凝膠包埋法已經成功用于多種單亞基的酶分子穩定性研究中。例如，HONG等利用溶膠-凝膠包埋法對脂肪酶和胰凝乳蛋白酶的單個酶分子進行包埋而顯著提高穩定性[17]。這種包埋方法也被稱為金屬有機框架固定化酶。DU等優化溶膠-凝膠包埋法的工藝，顯著提高了過氧化氫酶的穩定性[18]。本研究利用溶膠-凝膠包埋法將POD的4個亞基限制在SiO2的網絡結構內，提高POD穩定性。本研究的結果將為制備穩定性好的多亞基酶分子提供思路，也為POD的應用提供幫助。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

丙酮酸氧化酶，來自重組大腸桿菌pET28a-pod[19]。四甲氧基硅烷(tetramethyloxysilane,TMOS)、二辛基琥珀酸鈉(aeroslol-OT,AOT)、二辛基丙烷(decyl maltose neopentyl glycol,BTP)、正己烷,國藥集團化學試劑有限公司。

BTP緩沖液(100 mmol/L)：稱取2.824 g BTP、0.222 g CaCl2，加入10 mL異丙醇和70 mL去離子水，混合均勻，用20 mmol/L HCl調pH至6.0，定容至100 mL，備用。

AOT溶液(40 mmol/L):稱取0.9 g AOT，加入50 mL正己烷，混合均勻，備用。

工作液1：取1 mL 4-氨基安替比林溶液、2 mL 1.0 mol/L KH2PO4-NaOH溶液(pH 6.0)、100 μL黃素腺嘌呤二核苷酸二鈉溶液、200 μL焦磷酸硫胺素溶液、1 mL辣根過氧化物酶溶液、1.7 mL水混合，混合均勻后，于4oC保存，備用。

工作液2：取2 mL苯酚溶液、2 mL MgCl2溶液混合，混合均勻后，于4oC保存，備用。

1.2 溶膠-凝膠法包埋POD的過程

溶膠-凝膠法包埋POD是通過“離子配對”的形式實現的。POD以離子對的形式溶于含有陰離子型表面活性劑(AOT)的有機溶劑中， TMOS水解產生的SiO2在POD周圍形成硅膠網絡，再利用反膠束萃取技術將包埋后的POD萃取出來。具體操作步驟如下：(1)取9 mL POD溶液與1 mL BTP緩沖液混合均勻；(2)取8 mL混合液于50 mL離心管，加入2 mL AOT溶液，在20℃、200 r/min的搖床中振蕩10 min；(3) 取出加入1 μL TMOS溶液混合均勻，4℃靜置5 h；(4)加入2.5 mL 1.0 mol/L KH2PO4-NaOH緩沖液(pH 6.0)，振蕩10 min；于離心機中在4℃，8 000×g條件下離心10 min，溶液出現分層現象，棄有機相，將水相在4℃保存24 h。

1.3 TMOS濃度的優化

在上述步驟3中分別采用不同濃度TMOS溶液(0.336、0.672、3.36、6.72、33.6和67.2 mmol/L)。其他步驟如上述所示，測定加入不同濃度TMOS后POD相對剩余活力。以未包埋POD的初始活力為100%。

1.4 TMOS吸附時間的優化

以TMOS最佳濃度包埋POD后，于4℃分別靜置2、5、8、12、16 h。其他步驟如1.2所述，測定POD相對剩余活力。以未包埋POD的初始活力為100%。

1.5 TMOS包埋時間的優化

根據TMOS的最佳濃度和吸附時間，將1.2中步驟4的水相分別在4℃中保存0、24、48、72、96 h。其他步驟如1.2所述，測定POD相對剩余活力。以未包埋POD的初始活力為100%。

1.6 AOT濃度的優化

AOT作為一種弱陰離子表面活性劑，在正己烷中形成反膠束。當其濃度超過臨界值時形成反膠束；但當其濃度過高時形成聚集體，增加了萃取的難度，也不易測定溶液中POD活力，故最后優化AOT的濃度。

根據確定的TMOS最佳濃度、最佳吸附和包埋時間，在上述步驟(2)中分別加入不同濃度的AOT溶液，分別為0.5、1、2、5、10和 20 mmol/L。其他步驟如上述所示，測定POD的相對剩余活力。以未包埋POD的初始活力為100%。

1.7 正交實驗優化溶膠-凝膠法包埋POD

根據TMOS最佳濃度、最佳吸附時間、最佳包埋時間和AOT溶液最佳濃度進行4因素3水平的正交實驗。TMOS最佳濃度、最佳吸附時間和最佳吸附時間的中間水平分別為0.672 mmol/L、5 h、24 h。AOT溶液最佳濃度的中間水平為5 mmol/L。以未包埋POD的初始活力為100%。

1.8 POD活力的測定

取100 μL POD，加入600 μL工作液1、300 μL工作液2、100 μL 1 mol/L 丙酮酸鈉溶液，在37oC條件下水浴10 min后，取200 μL反應液測定OD510。POD的活力定義為37oC、pH 6.8條件下，每分鐘消耗底物產生1 μmol 的H2O2所需要的酶量。

1.9 POD穩定性測定

分別取2 mL POD與8 mL KH2PO4-NaOH緩沖液(pH 6.0)混合均勻，在 30oC保溫3 h后測定相對活力。

1.10 溶膠-凝膠包埋法制備的POD熱穩定性

取2 mL包埋后的POD與8 mL KH2PO4-NaOH緩沖液(pH 6.0)混合均勻，分別在20，25，30和37℃保溫1～5 h，每隔1 h測1次相對活力，以剛包埋后的POD的活力定為100%。

2 結果與分析

2.1 TMOS濃度對POD活力和穩定性的影響

圖1為TMOS濃度對POD相對剩余活力和穩定性的影響。隨著TMOS濃度的增加，POD的相對剩余活力總體呈下降趨勢(圖1-a)，說明高濃度TMOS對POD產生抑制作用。當TMOS濃度為0.336～0.672 mmol/L時，POD的相對剩余活力較高，分別為71.27%、76.87%。當TMOS濃度高于3.36 mmol/L時，POD相對剩余活力降到10%～20%。TMOS濃度對剩余POD活力的影響具有顯著性(P<0.01)。當TMOS濃度為0.672 mmol/L時，POD的相對剩余活力具有最高值。所以，TMOS的最佳濃度為0.672 mmol/L。圖1-b表示加入不同濃度TMOS對POD穩定性的影響。隨著TMOS濃度增加，POD的穩定性總體呈先下降，后上升趨勢。在TMOS濃度為0.336～3.36 mmol/L時，POD的相對活力分別為39.51%、38.92%和23.36%，處于20%～40%。當TMOS濃度為6.72～67.2 mmol/L時，POD的相對活力分別為86.05%、113.97%和113.75%。TMOS濃度對剩余POD的相對活力的影響具有顯著性(P<0.01)綜上結果可知，較高濃度TMOS能使POD更加穩定。

2.2 TMOS吸附時間對POD活力和穩定性的影響

圖2為TMOS吸附時間對POD活力和穩定性的影響。TMOS的吸附時間對POD相對剩余活力的影響不顯著，呈鐘形趨勢(圖2-a)。當吸附時間從2 h增加到5 h時，POD的相對剩余活力由54.21%增加到65.59%。隨著吸附時間繼續增加，POD的相對剩余活力緩慢下降。當TMOS吸附時間為5 h，POD的相對剩余活力有最佳值。所以，TMOS的最佳吸附時間為5 h。

TMOS的吸附時間對POD穩定性的影響也不顯著(圖2-b)。在吸附時間為2～16 h，POD的相對活力在30%～40%，呈現先下降后升高的趨勢。

a-相對剩余活力;b-穩定性

2.3 TMOS的包埋時間對POD活力和穩定性的影響

圖3為TMOS的包埋時間對POD活力和穩定性的影響。圖3-a顯示包埋24 h的相對剩余活力為83.31%，這可能由于POD亞基之間的連接在包埋的過程中受到破壞。包埋48 h以上，POD的相對剩余活力逐漸下降，包埋120 h后POD剩余48.23%的活力。當TMOS的包埋時間為24 h時，POD的相對剩余活力獲得最高。所以，TMOS的最佳包埋時間為24 h。圖3-b表明了TMOS的包埋時間對POD在30℃保溫3 h穩定性的影響。TMOS的包埋時間時間越長，POD的穩定性越高。在包埋時間為0～120 h時，POD的相對活力仍然在30%～40%。綜上，TMOS的包埋時間與POD相對剩余活力成反比，與POD的穩定性成正比。

a-相對剩余活力;b-穩定性

2.4 AOT濃度對POD活力和穩定性的影響

AOT濃度對于POD相對剩余活力的影響呈現鐘形趨勢(圖4-a)。POD在AOT濃度為0.5～5 mmol/L時相對剩余活力逐漸升高。當AOT濃度繼續升高，POD的相對剩余活力緩慢降低。當AOT濃度為5 mmol/L時，POD的相對剩余活力獲得最佳值96.95%，所以，AOT的最適濃度為5 mmol/L。

AOT的濃度對POD穩定性的影響也呈現鐘形趨勢(圖4-b)。當AOT的濃度為0.5～5 mmol/L時，POD的相對活力逐漸升高，達到最佳值33.75%。而當AOT濃度高于5 mmol/L時，POD的相對活力逐漸下降。

a-相對剩余活力;b-穩定性

2.5 正交實驗優化溶膠-凝膠法包埋POD

單因素實驗表明POD在0.672 mmol/L TMOS、5 h吸附、24 h 包埋、5 mmol/L AOT的條件下具有較佳的活力。采用正交實驗的結果見表1。結果表明,TMOS濃度對POD相對剩余活力的影響最大，其次為TMOS包埋時間、吸附時間、AOT濃度。當采用TMOS濃度為0.672 mmol/L、2 h吸附、24 h 包埋、5 mmol/L AOT時， POD有最佳的剩余活力90.81%，比對照提高了14%。

表1 包埋條件對POD的相對剩余活力影響的正交試驗結果

2.6 溶膠-凝膠包埋法的POD熱穩定性

圖5-a～圖5-d分別表示SiO2包埋后POD在20、25、30和37℃保溫5 h的相對活力。包埋后POD的活力在20、25和30℃遠遠高于對照。圖5-a顯示，隨著時間的增加，對照組的POD活力逐漸下降，在20℃保溫5 h后的活力為43.92%；而包埋后POD在20℃保溫5 h的活力依然為100%，為對照組POD活力的2.28倍。圖5-b表明在25℃條件下對照組的POD活力在5 h后剩余19.67%；而包埋后POD的活力在1～4 h保持90%以上，5 h后為62.12%，為對照組POD活力的3.16倍。圖5-c表明在30℃條件下對照組和包埋POD的活力都劇烈下降，之后呈現緩慢下降趨勢，5 h后分別剩余3.79%和66.40%活力。圖5-d表明對照組和包埋POD的活力在37℃條件下都不穩定，保溫1 h后活力分別為0.79%和6.67%，5 h后活力分別為0.38%和0.88%。以上結果表明,包埋POD的熱穩定性在20～30℃時比對照組顯著提高，在37℃條件下提高不明顯，這對POD的應用具有重要的意義。

3 結論

盡管POD為四聚體結構，但經過溶膠-凝膠包埋法的SiO2網絡包埋，加強了亞基之間的連接，提高POD的穩定性。本研究首先通過單因素實驗確定最佳的條件為0.672 mmol/L TMOS、TMOS吸附5 h、TMOS包埋24 h和5 mmol/L AOT。結果表明，高濃度TMOS使POD更加穩定，抑制POD活力， TMOS的吸附時間對POD活力和包埋后POD穩定性的影響都不顯著，TMOS包埋時間越長，POD相對剩余活力越低，穩定性越好，AOT濃度對POD相對剩余活力的影響不顯著。正交實驗確定最佳包埋條件，即濃度為0.672 mmol/L TMOS、5 h的TMOS吸附、24 h的TMOS包埋和5.0 mmol/L AOT。包埋后POD的相對剩余活力比對照高14%，且包埋后POD的熱穩定性在20～30℃也顯著提高。因此，溶膠-凝膠包埋法是一種有效地提高POD穩定性的方法。溶膠-凝膠包埋法可以提高POD等多亞基酶的穩定性。但是，溶膠-凝膠包埋法的步驟還較為繁瑣，操作要求也較高，操作過程中不僅要考慮溶膠-凝膠包埋步驟中對酶活力的損失，還要考慮包埋后酶的穩定性。本研究結果表明溶膠-凝膠包埋法對POD活力的損失還較為嚴重，所以避免POD活力的損失將是一個研究的方向。

a-20℃;b-25℃;c-30℃;d-37℃