東海海參性腺丙酮提取物的體外功能活性分析

徐仰麗，蘇來金*，楊會(huì)成，李瑞雪

1(溫州市農(nóng)業(yè)科學(xué)研究院，浙江 溫州, 325006)2(浙江省海洋開發(fā)研究院，浙江 舟山, 316021)3(舟山可嘉技術(shù)服務(wù)有限公司，浙江 舟山, 316021)

東海海參是中國常見可食用海參的一種，又稱東海烏參、茄參、香參等，學(xué)名海地瓜(Acaudinamolpadioidea)，屬于芋參目，尻參科，主要分布在我國的東海海域，儲(chǔ)量大約為100萬t[1-2]，研究表明，東海海參基本營養(yǎng)成分和刺參相似[3]，且含有硫酸多糖、皂苷、腦苷脂等多種生物活性成分[4-6]，具有減肥、抑制胰島素抵抗、抗腫瘤、改善阿爾茲海默癥等功能活性[7-9]。然而由于東海海參皮質(zhì)堅(jiān)硬，難加工，外觀不如刺參等因素導(dǎo)致長期未得到有效利用，甚至導(dǎo)致了區(qū)域性的海洋生物災(zāi)害問題[10]，急需開發(fā)利用。

東海海參性腺是海參卵和精的組織部分，在海參加工過程中，大部分作為下腳料直接丟棄，造成了資源浪費(fèi)和環(huán)境污染。海參性腺與海參體壁相比，不僅含有相同的活性物質(zhì)，且部分營養(yǎng)成分含量更高，如多糖、精氨酸、蝦青素、腦苷脂及多種微量元素等[11]。目前對海參性腺的研究較少，僅停留在海參性腺的酶解工藝優(yōu)化及抗氧化活性方面[12-14]，對東海海參性腺提取液的生物活性研究尚未見有報(bào)道。本文以利用丙酮對東海海參性腺進(jìn)行提取，通過體外實(shí)驗(yàn)，研究丙酮提取物(Am-GE)對腫瘤細(xì)胞增殖和凋亡以及對巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響，以期為東海海參性腺的高值化利用和食品開發(fā)提供理論研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 海參和細(xì)胞株

東海海參由樂清市海洋生物保健品有限公司提供，捕撈于寧波至溫州近海海域，24 h內(nèi)冷藏運(yùn)至實(shí)驗(yàn)室。人肝癌細(xì)胞HepG2、人結(jié)腸癌細(xì)胞Caco-2、小鼠巨噬細(xì)胞RAW264.7，購自中山大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，分別以RPMI-1640完全培養(yǎng)基(含10%新生牛血清、100 U/mL青霉素和100 μg/mL硫酸鏈霉素)培養(yǎng)。細(xì)胞均在37℃、5% CO2孵箱中培養(yǎng)。HepG2和Caco-2細(xì)胞以0.25%的胰蛋白酶消化傳代，HepG2細(xì)胞平均2～3 d傳代1次，Caco-2細(xì)胞平均4～5 d傳代1次；RAW264.7細(xì)胞以冷PBS吹打后進(jìn)行傳代，平均2～3 d傳代1次。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)原料及試劑

PRMI-1640完全培養(yǎng)基、新生牛血清,購自美國Gibco公司；胰蛋白酶、MTT,購自美國Amresco公司；青霉素、硫酸鏈霉素,購自美國Sigma公司；Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix,購自加拿大Fermentas公司；TRIzol,購自美國Invitrogen公司；M-MLV,購自美國Promega公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒、PI細(xì)胞凋亡染色試劑盒,購自碧云天生物公司。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器

超凈工作臺(tái)(DL-CJ-1N型)，北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司產(chǎn)品；GL-20M型高速冷凍離心機(jī)，上海盧湘離心機(jī)儀器有限公司產(chǎn)品； Model680型酶標(biāo)儀、iCycler iQ5系統(tǒng)Real-Time PCR擴(kuò)增儀，美國Bio-Rad產(chǎn)品； LABOROTA 4000型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，德國Heidolph產(chǎn)品；BD FACSCanto Ⅱ流式細(xì)胞儀，美國Becton Dickinson公司。

1.2 方法

1.2.1 東海海參性腺提取物(Am-GE)制備

新鮮東海海參清洗后，沿肛門用剪刀剖開機(jī)體，分離性腺，洗凈，取東海海參性腺樣品(以下提取步驟均按照1 g 樣品計(jì)算)，加入30 mL丙酮，利用高速勻漿機(jī)均質(zhì)后，于室溫下攪拌提取2 h，75 00×g離心15 min，取上清液，殘?jiān)尤?0 mL丙酮在相同條件下重復(fù)提取1次，兩次提取液合并，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進(jìn)行減壓濃縮，冷凍干燥得Am-GE，置于4℃保存，備用。

1.2.2 HepG2和Caco-2細(xì)胞增殖檢測

取對數(shù)生長期的HepG2和Caco-2細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基調(diào)整為2×104個(gè)/mL后接種于96孔培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，加入不同濃度的Am-GE(終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL)，每孔200 μL，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24、48和72 h。培養(yǎng)結(jié)束后棄去培養(yǎng)基，加入0.5 mg/mL的MTT液。繼續(xù)培養(yǎng)4 h，加入酸化異丙醇，吹打至藍(lán)色結(jié)晶物完全溶解，測定570 nm處吸光值，以[(Am-GE組吸光值)/(空白對照組吸光值)]×100%表示不同濃度的Am-GE處理下細(xì)胞的存活率。并以擬合曲線求出半數(shù)抑制濃度(IC50)，重復(fù)實(shí)驗(yàn)4次。

1.2.3 HepG2細(xì)胞凋亡檢測

將Am-GE配制成質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75 mg/mL，以0 mg/mL為對照組，分別處理HepG2細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞利用Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒進(jìn)行檢測，利用流式細(xì)胞儀測定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.4 HepG2細(xì)胞周期檢測

將Am-GE配制成質(zhì)量濃度為0、0.25、0.5、0.75 mg/mL，以0 mg/mL為對照組，分別處理HepG2細(xì)胞24 h后，收集細(xì)胞，75%乙醇固定過夜，經(jīng)PI細(xì)胞凋亡染色試劑盒染色后進(jìn)行流式細(xì)胞儀測定，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.5 Caco-2細(xì)胞成瘤能力檢測

將Am-GE配制成質(zhì)量濃度為0、0.1、0.2、0.3 mg/mL，以0 mg/mL為對照組，分別處理Caco-2細(xì)胞7 d，用4%多聚甲醛固定細(xì)胞，用Gimsa染色后拍照，重復(fù)實(shí)驗(yàn)3次。

1.2.6 RAW264.7細(xì)胞炎癥因子基因mRNA表達(dá)檢測

取對數(shù)生長期的RAW264.7細(xì)胞，以完全培養(yǎng)基調(diào)整為2×104個(gè)/mL后接種于6孔培養(yǎng)板。細(xì)胞貼壁培養(yǎng)24 h后，吸棄培養(yǎng)基，1組細(xì)胞加入不含LPS的完全培養(yǎng)基，其他5組細(xì)胞均入LPS終濃度為100 ng/mL的完全培養(yǎng)基，在加入LPS的細(xì)胞中，同時(shí)加入終濃度分別為0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1 mg/mL的Am-GE，每個(gè)濃度3個(gè)復(fù)孔。于37℃、5%CO2條件下分別培養(yǎng)24、48 和72 h。

采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR方法(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)檢測Am-GE對RAW264.7細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA表達(dá)的影響。取小鼠肝臟0.1 g，加入150 mL TRIzol，低速勻漿破碎細(xì)胞，提取總RNA。取1 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，之后于25 mL 的反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增，各反應(yīng)物及用量為：cDNA模版 6 μL(稀釋5倍)，Maxima SYBR Green qRT-PCR Master mix 12.5 μL，上、下游引物各0.3 μL，超純水5.9 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃變性15 s，60 ℃退火20 s，72 ℃延伸30 s，共42個(gè)循環(huán)，炎癥因子基因均以β-actin作為內(nèi)參校正，將正常不添加LPS和Am-GE的RAW264.7細(xì)胞組定為1個(gè)單位。如表1所示，各目的基因引物序列使用Primer Premier 6.0設(shè)計(jì)，由上海生工生物工程有限公司合成。

表1 PCR研究中炎癥信號(hào)因子基因引物序列

2 結(jié)果與分析

2.1 Am-GE對HepG2和Caco-2細(xì)胞增殖的影響

如圖1所示，隨著Am-GE濃度的增加，HepG2和Caco-2的細(xì)胞活性逐漸下降。對于HepG2細(xì)胞，當(dāng)Am-GE濃度低于0.8 mg/mL時(shí)，24、48和72 h的時(shí)間處理對其活性影響不顯著(P>0.05)，當(dāng)Am-GE濃度大于等于0.8 mg/mL時(shí)，72 h的時(shí)間處理比24 h和48 h對其活性的抑制更加顯著(P<0.05)，表明Am-GE顯著抑制了HepG2細(xì)胞生長，且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系，但總體來說Am-GE對其生長的抑制作用時(shí)間依賴性不顯著。對于Caco-2，Am-GE濃度為0.1、0.2、0.4和0.5 mg/mL時(shí)，Caco-2細(xì)胞活性抑制率在72 h均顯著高于24 h；Am-GE濃度為0.8和1.0 mg/mL時(shí)，Caco-2細(xì)胞活性抑制率72 h顯著高于48 h，兩者均顯著高于24 h，具有時(shí)間依賴性，表明Am-GE顯著抑制了Caco-2細(xì)胞生長，且有明顯的劑量效應(yīng)關(guān)系和時(shí)間效應(yīng)關(guān)系。以上結(jié)果表明Am-GE能有效地抑制HepG2和Caco-2腫瘤細(xì)胞的增殖活性。

圖1 Am-GE對HepG2細(xì)胞和Caco-2細(xì)胞活性的影響(n=4)

2.2 Am-GE對HepG2細(xì)胞凋亡的影響

如圖2所示，R4為活細(xì)胞，R5為早期凋亡細(xì)胞，R3為晚期凋亡細(xì)胞，R2為壞死細(xì)胞；R3+R5為凋亡細(xì)胞，其量化結(jié)果如表2所示。隨著Am-GE質(zhì)量濃度從0、0.25、0.50和0.75 mg/mL的增加，在每個(gè)濃度梯度點(diǎn)時(shí)，正常HepG2細(xì)胞數(shù)量均顯著減少(P<0.05)，具有較高的劑量效應(yīng)關(guān)系；對于早期凋亡細(xì)胞，Am-GE質(zhì)量濃度從0、0.25和0.50 mg/mL的增加，其細(xì)胞凋亡數(shù)量逐漸增加(P<0.05)，但當(dāng)Am-GE質(zhì)量濃度為0.75 mg/mL，早期細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著減少，達(dá)到0 mg/mL的水平；對于晚期凋亡細(xì)胞，隨著Am-GE質(zhì)量濃度(0、0.25、0.50和0.75 mg/mL)的增加，在每個(gè)濃度梯度點(diǎn)時(shí)，晚期HepG2凋亡細(xì)胞數(shù)量均顯著增加(P<0.05)，呈現(xiàn)較高的劑量效應(yīng)關(guān)系；對于死亡細(xì)胞，Am-GE在各濃度時(shí)，其數(shù)量變化不顯著。結(jié)果顯示，Am-GE能顯著促進(jìn)HepG2細(xì)胞的凋亡，具有顯著的抗腫瘤活性。

圖2 Am-GE對HepG2細(xì)胞凋亡的影響(n=3)

表2 Am-GE對HepG2細(xì)胞凋亡數(shù)量的影響

注：上標(biāo)字母不同表示差異顯著,P<0.05.

2.3 Am-GE對HepG2細(xì)胞周期的影響

如圖3和表3所示，與Am-GE濃度0 mg/mL相比，0.25、0.50 和0.75 mg/mL的Am-GE均能顯著減少G1期HepG2細(xì)胞的比例；同時(shí)顯著增加G2期HepG2細(xì)胞的比例，其增加值分別為79.54%、96.10%和85.11%；但不同濃度的Am-GE彼此之間變化不顯著；但對于S期細(xì)胞，隨著Am-GE濃度(0、0.25、0.50和0.75 mg/mL)的增加，各組細(xì)胞的數(shù)量變化均不顯著。表明東海海參性腺提取物處理引起了G2期阻滯，進(jìn)而抑制HepG2細(xì)胞的增殖。

圖3 Am-GE對HepG2細(xì)胞周期的影響(n=3)

表3 Am-GE對HepG2細(xì)胞周期量化值的影響(n=3)

注：上標(biāo)字母不同表示差異顯著,P<0.05。

2.4 Am-GE對Caco-2細(xì)胞成瘤能力的影響

如圖4所示，在不加入Am-GE的Caco-2細(xì)胞中，細(xì)胞瘤狀體出現(xiàn)較密集，當(dāng)加入Am-GE處理后，瘤狀體密度和大小均有顯著減小，且隨著Am-GE濃度的增加，Caco-2細(xì)胞瘤狀體的大小和密度呈現(xiàn)減小的趨勢，具有顯著的劑量效應(yīng)關(guān)系，說明Am-GE能夠顯著抑制Caco-2細(xì)胞的成瘤能力。

2.5 Am-GE對RAW264.7細(xì)胞炎癥因子mRNA表達(dá)的影響

如圖5所示，與不加入LPS的RAW264.7細(xì)胞比較，加入LPS的細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的相對表達(dá)量均顯著增加(圖5)，表明LPS引起了RAW264.7細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。與加入LPS但未加入Am-GE的RAW264.7細(xì)胞比較，加入50和100 mg/mL的Am-GE并未引起TNF-α基因mRNA的顯著變化，當(dāng)Am-GE濃度增加至150和200 mg/mL時(shí)，TNF-α基因mRNA的相對表達(dá)量分別顯著下降了35.92%和45.98%(圖5-A)。對于IL-1β mRNA的相對表達(dá)量，50、100、150和200 mg/mL的Am-GE均顯著降低了細(xì)胞IL-1β基因mRNA的轉(zhuǎn)錄水平，分別下降了30.51%、36.90%、44.44%和47.62%(圖5-B)。100、150和200 mg/mL的Am-GE顯著降低了IL-6 mRNA相對表達(dá)量21.71%、29.39%和36.84%(圖5-C)。對于iNOS mRNA相對表達(dá)量，50、100、150和200 mg/mL的Am-GE分別顯著降低了39.27%、35.02%、58.19%和75.14%(圖5-D)。以上結(jié)果可知，加入Am-GE能夠有效減少炎癥因子mRNA的表達(dá)，從而起到抗炎作用。

圖5 Am-GE對RAW264.7細(xì)胞炎癥細(xì)胞因子mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討論

海參作為中國傳統(tǒng)的營養(yǎng)食品和藥食同源類生物資源，近年來得到了廣泛的關(guān)注。本文利用丙酮對東海海參性腺進(jìn)行提取，首次證明了丙酮提取物Am-GE能有效地抑制HepG2肝臟腫瘤細(xì)胞和Caco-2節(jié)腸腫瘤細(xì)胞的增殖，同時(shí)降低RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥因子基因的表達(dá)水平，提示Am-GE具有較好的抗腫瘤和抗炎癥的生物活性。

關(guān)于海參功能活性成分的研究，已證明海參有機(jī)溶劑提取物中含有豐富的腦苷脂、長鏈堿、神經(jīng)節(jié)苷脂、EPA/DHA型磷脂等多種生物活性脂類[15]。研究發(fā)現(xiàn),海參腦苷脂能顯著抑制S180腹水瘤小鼠TNF-α、IL-1和IL-6的分泌[16]，海參EPA型磷脂能有效地降低非酒精性脂肪肝大鼠肝臟脂質(zhì)的堆積[17]，抑制PC12細(xì)胞線粒體凋亡通路中關(guān)鍵基因Bax、Caspase-9、Caspase-3 mRNA的相對表達(dá)量，促進(jìn)Bcl-2 mRNA的相對表達(dá)量[18]，通過激活PI3K/Akt信號(hào)通路發(fā)揮降血糖的物物活性[19]。HU等證明海參長鏈堿能有效地降低肥胖小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6濃度，并抑制其基因在脂肪組織中的表達(dá)，以此發(fā)揮抗炎癥的作用[20]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Am-GE可以顯著地抑制巨噬細(xì)胞TNF-α、IL-1β、IL-6和iNOS mRNA的相對表達(dá)量，具有較強(qiáng)的抗炎癥作用；同時(shí)，Am-GE能顯著抑制肝癌細(xì)胞的增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯和細(xì)胞凋亡，并將腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期阻斷在G2期，使之無法進(jìn)入凋亡過程的關(guān)鍵限制點(diǎn)S期，提示Am-GE可以顯著地通過抑制HepG2細(xì)胞的細(xì)胞周期(S期阻斷)發(fā)揮抗腫瘤活性。因此，可以推測Am-GE在本實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)的生物活性，與提取物中含有的磷脂、腦苷脂、長鏈堿等生物活性脂質(zhì)有密切的關(guān)系，但Am-GE中各類脂質(zhì)的種類與相對含量尚未檢測，在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過程中將進(jìn)一步深入研究。

綜上，東海海參性腺丙酮提取物具有顯著的抗腫瘤和抗炎癥生物活性，這將為東海海參的精深加工和高值化利用提供新的思路。