秸稈堿預(yù)處理液脫毒及其在丁醇發(fā)酵中的應(yīng)用

董晉軍，馬寶劍，龔磊，韓瑞枝，許國超，周婕妤，倪曄*

1(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，生物催化與酶工程研究室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，工業(yè)生物技術(shù)教育部重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

預(yù)處理是秸稈類生物質(zhì)原料用于發(fā)酵工業(yè)的首要環(huán)節(jié)，目前主流的預(yù)處理方法有蒸汽爆破、稀酸法和稀堿法等[1-4]。其中效果較好的方法是稀堿法[5-6]，該方法很有希望用于工業(yè)生產(chǎn)[7]。而稀堿法預(yù)處理可破壞木質(zhì)素和半纖維素間的化學(xué)鍵，相對于酸法預(yù)處理具有較強的脫木質(zhì)素能力，且預(yù)處理過程中糖損失較少。木質(zhì)纖維素預(yù)處理液中不僅含有抑制菌體生長的酚類、酸類、酮類和呋喃類等毒素[8-9]，而且對環(huán)境造成嚴(yán)重的污染。相對于堿法預(yù)處理，酸法預(yù)處理液由于木質(zhì)素含量較低，所以顏色較淺，目前對酸法預(yù)處理液進(jìn)行脫毒的研究較多[10-11]，但對堿預(yù)處理液脫毒工藝鮮見報道。

本研究以玉米秸稈為原料，采用稀堿預(yù)處理法，先加酸沉淀以去除堿溶性木質(zhì)素，再以活性炭脫毒的方式將殘留的毒素進(jìn)一步去除，并將脫毒后的預(yù)處理液用于水解過程和丁醇發(fā)酵液，驗證其脫毒效果，以建立從源頭控制廢水的“清潔生產(chǎn)”工藝。該工藝在預(yù)處理后沒有廢水排放，僅有副產(chǎn)物堿溶性木質(zhì)素，而木質(zhì)素可以用來生產(chǎn)硫化鈉[12]、活性炭[13-14]、香蘭素[15-16]、無毒型生物抑制劑，還可以用于塑料和橡膠混料體系中[17]。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玉米秸稈，山東澤生生物科技有限公司；纖維素酶(濾紙酶活150 FPU/mL，最適pH 4.8)，青島蔚藍(lán)生物股份有限公司；其他化學(xué)試劑均購自國藥集團(tuán)。糖丁基梭菌(ClostridiumsaccharobutylicumDSM 13864)，德國DSMZ微生物菌種保藏中心。

1.2 儀器與設(shè)備

DNP-9162恒溫培養(yǎng)箱，上海精宏實驗設(shè)備有限公司；CP3900氣相色譜儀，美國瓦里安公司；LC1260高效液相色譜儀，安捷倫科技(中國)有限公司；GI54T立式高壓滅菌鍋，南京庚辰科學(xué)儀器有限公司；Centrifuge 5810型臺式高速離心機(jī)，德國 Eppendorf 公司；FE28酸度計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；HYL-C組合式搖床，江蘇強樂實驗設(shè)備有限公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養(yǎng)基配方

種子培養(yǎng)基[18](g/L)：牛肉膏10，酵母浸出粉10，可溶性淀粉1，葡萄糖5，NaCl 3，蛋白胨10，半胱氨酸鹽酸鹽0.5，乙酸鈉3，調(diào)pH值至6.5，115℃高壓蒸汽滅菌20 min。

發(fā)酵培養(yǎng)基[18](g/L)：玉米秸稈水解液(還原糖50)，玉米漿干粉10 ，CaCO34，(NH4SO4) 2，K2HPO40.5，MnSO4·H2O 0.01，調(diào)pH值至6.5，120℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.3.2 玉米秸稈的堿預(yù)處理方法及木質(zhì)素的提取方法

取粉碎后玉米秸稈100 g，配制1L、1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù)) NaOH溶液，以固液比1∶10(g∶mL)的比例混合，然后于立式高壓滅菌鍋中以120℃加熱1 h，達(dá)到堿處理的效果。處理后過濾分離得預(yù)處理后秸稈和堿預(yù)處理液。預(yù)處理后秸稈用水沖洗至中性，置入烘干箱中60℃烘干，以備后續(xù)水解糖化實驗。

收集堿預(yù)處理液分別添加一定量的稀H2SO4調(diào)節(jié)pH后，12 000 r/min離心5 min去除堿溶性木質(zhì)素，上清稀釋一定倍數(shù)后用分光光度計測OD420和OD280，以分析預(yù)處理液中抑制物的含量。

1.3.3 預(yù)處理液脫毒用于丁醇發(fā)酵

在15個100 mL三角瓶中分別加入6 g堿處理后的秸稈、48 mL堿預(yù)處理液，按梯度分別加入0、5、10、15、20 g/L的活性炭，每個梯度3個平行樣，于立式高壓滅菌鍋中120℃處理20 min進(jìn)行脫毒。而后在超凈工作臺中取樣0.5 mL，12 000 r/min離心5 min，取上清液250 μL，稀釋到20倍和400倍測量OD420和OD280。

在無菌環(huán)境中加入干熱滅菌的CaCO31 g，將膜過濾除菌的纖維素酶(30 FPU/g秸稈)加入上述滅菌后的三角瓶中，水解36 h后在超凈工作臺按照10%的接種量接種C.saccharobutylicumDSM 13864。

1.4 分析方法

還原糖濃度的測定采用DNS法[19]，丁醇濃度的測定采用氣相色譜法[20]。

預(yù)處理液中毒素含量用比色法來測定，將預(yù)處理液稀釋20倍，OD420測定美拉德反應(yīng)產(chǎn)物[21-22]，將預(yù)處理液稀釋400倍，OD280測定酚類化合物含量[23]。

2 結(jié)果與分析

2.1 工藝流程

玉米秸稈堿預(yù)處理液脫毒工藝流程如圖1所示。

圖1 玉米秸稈堿預(yù)處理液脫毒工藝流程圖

2.2 堿預(yù)處理液的脫毒

2.2.1 堿預(yù)處理液木質(zhì)素的去除

OD420和OD280被用來評估預(yù)處理液中抑菌物質(zhì)美拉德反應(yīng)產(chǎn)物和酚類物質(zhì)的含量。由圖2可知，隨著H2SO4添加量增加，預(yù)處理液pH逐漸下降，OD420和OD280也不斷下降；當(dāng)H2SO4添加量達(dá)到9 g/L，pH為3.8左右時，OD280和OD420基本達(dá)到穩(wěn)定；故選擇pH 3.8作為去除堿溶性木質(zhì)素的最適pH。堿溶性木質(zhì)素沉淀后預(yù)處理液顏色深度明顯降低，堿溶性木質(zhì)素大量析出。

A-OD420；B-OD280

2.2.2 活性炭脫毒

加酸去除預(yù)處理液中堿溶性木質(zhì)素的同時，也去除了一部分抑制菌體生長的毒素。為進(jìn)一步去除預(yù)處理液中的毒素，采用了活性炭脫毒方法。比較了添加CaCO3緩沖pH值至5.0和不添加CaCO3條件下活性炭的脫毒情況(圖3)。當(dāng)不添加CaCO3時，溶液pH值為3.8，較添加CaCO3低，而低pH有利于活性炭的吸附[24]。因此，不添加CaCO3時活性炭的脫毒效果較好，尤其是苯酚類物質(zhì)的脫毒效果較好(圖3-B)。當(dāng)活性炭添加量為15 g/L時，脫毒效果基本達(dá)到穩(wěn)定，OD420(稀釋20倍)為0.025，OD280(稀釋400倍)為0.003 4。

A-OD420；B-OD280

2.3 堿預(yù)處理后玉米秸稈的水解糖化

當(dāng)堿預(yù)處理液活性炭脫毒后，測定預(yù)處理液中含有少量還原糖(小于0.5 g/L)，因為在堿性條件下預(yù)處理水解的部分還原糖發(fā)生羥醛縮合反應(yīng)生成羧酸，如乳酸和乙酸[25]。利用CaCO3作為pH緩沖劑加入預(yù)處理液與預(yù)處理好的秸稈混合并添加纖維素酶水解(圖4)。當(dāng)活性炭添加量不斷提高，水解的還原糖略有提高。當(dāng)活性炭質(zhì)量濃度為20 g/L，水解36 h后還原糖質(zhì)量濃度達(dá)到63.5 g/L。以檸檬酸鈉緩沖液、不加活性炭為對照，36 h水解還原糖質(zhì)量濃度為57.4 g/L。pH緩沖劑CaCO3和檸檬酸鈉(對照，結(jié)果未顯示)對水解的影響不大。由于秸稈水解過程固液比較大，過量CaCO3可控制pH值在5.0左右，所以選擇CaCO3代替檸檬酸鈉緩沖液(pH 4.8)作為pH緩沖劑。乳酸發(fā)酵過程中也常用CaCO3作為pH緩沖劑[26]。

對照1-不添加活性炭；對照2-活性炭添加量10g/L

2.4 堿預(yù)處理秸稈及預(yù)處理液脫毒用于丁醇發(fā)酵

將酶水解后的秸稈水解液(連同活性炭和未徹底水解的秸稈殘渣)在無菌環(huán)境中接入丁醇發(fā)酵菌種C.saccharobutylicumDSM 13864種子液和滅菌的培養(yǎng)基濃縮液進(jìn)行發(fā)酵(圖5)。發(fā)酵72 h后測定發(fā)酵液中丁醇含量，不添加活性炭的水解液沒有丁醇產(chǎn)生；隨著活性炭濃度的加大，丁醇濃度逐漸升高；當(dāng)活性炭質(zhì)量濃度為15 g/L時，丁醇濃度趨于穩(wěn)定，達(dá)到10.2 g/L，相對于葡萄糖對照組,丁醇產(chǎn)量提高了21%。

圖5 堿預(yù)處理秸稈及脫毒后的預(yù)處理液用于丁醇發(fā)酵

3 結(jié)論

本研究基于源頭控制的理念，將堿預(yù)處理液進(jìn)行脫毒并用于秸稈水解和丁醇發(fā)酵過程，以減少廢水排放。首先，在堿預(yù)處理液中加入9 g/L的H2SO4，pH 3.8 時，可沉淀預(yù)處理液中的堿溶性木質(zhì)素。接著，對去除堿溶性木質(zhì)素的堿預(yù)處理液進(jìn)行活性炭脫毒，不同加量活性炭對秸稈的水解影響不明顯，但對丁醇發(fā)酵影響較大。當(dāng)活性炭添加量為15 g/L時，發(fā)酵72 h丁醇質(zhì)量濃度達(dá)到最高10.2 g/L，而不添加活性炭脫毒的預(yù)處理液在發(fā)酵中不產(chǎn)丁醇。本研究工藝對利用秸稈進(jìn)行無廢制造生物燃料有一定的參考價值。