魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦的保鮮效果

張家源，張洪才，陳舜勝*

1(上海海洋大學 食品學院，上海，201306)2(國家淡水水產品加工技術研發中心(上海)，上海，201306)

南美白對蝦(Penaeusvannamei)又名凡納濱對蝦，隸屬于對蝦科(Penaeidae)、對蝦屬(Penaeus)、Litopenaeus亞屬，原產于中、南美洲太平洋沿岸的溫暖水域，是世界三大養殖蝦類之一，具有較好的營養價值[1]。該蝦生長快、適應性強、產量高、品質好，是重要的水資源。但由于對蝦特殊的生理生化特性，即含有大量的高活性多酚氧化酶和蛋白質，再加之蝦肉中的含水量也很高[2-3]。因此對蝦在死亡后易受到微生物的污染以及由于蛋白質等含氮物質的分解而產生大量的尸胺、組胺等有害物質而很快腐敗變質[4-6]。同時其體內的多酚氧化酶也將催化酪氨酸等物質，產生一系列的生化反應，生成黑色素，從而使蝦體表面出現黑斑，即黑變現象[7-8]。因此需要采取相應的措施來抑制對蝦體內的酶活和微生物的生長繁殖，從而延緩對蝦的腐敗變質，延長其貨架期。

魚精蛋白是一種分子質量較小的球形堿性蛋白質。不僅是肝素唯一的拮抗劑，同時也具有良好的抑菌性，具有天然、無毒、安全等特點。其對革蘭氏陽性菌的抑菌效果優于革蘭氏陰性菌，而食品包括各種蝦類的腐敗菌以革蘭氏陰性菌為主，因此可將魚精蛋白與其他保鮮劑復配使用，以提高魚精蛋白的抑菌譜。殼聚糖是一種天然多糖，具有廣譜抑菌作用、抗氧化作用和很好的成膜性，對假單胞菌、沙門氏菌等革蘭氏陰性菌都具有很好的抑制效果。國內外對魚精蛋白的應用研究側重于醫學領域，如抗凝血、運輸藥物的載體等，而在食品保鮮領域的應用研究并不多。本研究利用具有較好抑菌作用的魚精蛋白作為保鮮劑，并與殼聚糖進行復配作為保鮮劑，分析南美白對蝦在貯藏過程中的品質和理化指標的變化，探究其對南美白對蝦的保鮮效果，不僅為南美白對蝦的貯藏和保鮮技術提供理論支持，也為魚精蛋白的高效利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鮮活南美白對蝦，購于臨港新城農工商超市生鮮部；魚精蛋白(來自暗紋東方鲀)，上海海洋大學食品學院實驗室自制；殼聚糖(食品級)，浙江澳興生物技術有限公司。

H3PO4、HClO4、KOH、NaOH、NaCl(均為分析純)，國藥集團上海化學試劑有限公司；KH2PO4、K2HPO4、甲醇(均為色譜純)，上海安普實驗科技股份有限公司；三磷酸腺苷(adenosine triphosphate，ATP)、二磷酸腺苷(adenosine diphosphate，ADP)、AMP、IMP、次黃嘌呤(hypoxanthine，Hx)、肌苷(inosine，HxR)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

H2050R 高速冷凍離心機，長沙湘儀有限公司；AD200L-P數顯高速分散均質機，上海標本模型廠；PHS-3C pH計，上海儀電科學儀器股份有限公司；LC-2010CHT HPLC儀，日本島津公司；AUW320分析天平，日本島津公司；UV-2100紫外-可見分光光度計，美國尤尼柯儀器有限公司；Kjeltec8400凱氏定氮儀，丹麥FOSS公司。

1.3 方法

1.3.1 樣品預處理

將鮮活的南美白對蝦用冰塊低溫致死，挑選無損傷且大小相近的蝦((10±2)g)若干，浸泡在相應的保鮮劑中(表1)，10 min后取出，放在無菌密封袋中，4 ℃冰箱貯藏，各指標每2 d測1次。

表1 魚精蛋白-殼聚糖復合保鮮劑實驗設計表

1.3.2 pH值的測定

稱取5 g碎蝦肉，加入45 mL超純水，均質60 s，靜置30 min后過濾，測定其pH值。

1.3.3 硫代巴比妥酸值(TBA)的測定

1.3.4 持水力的測定

參照孫衛青等[10]的方法，稍作修改。精確稱取3 g蝦肉，用濾紙包好，8 000 r/min離心10 min，取出樣品，精確稱量離心后蝦肉的質量。持水力按公式(1)計算：

(1)

式中：m0，離心前蝦肉的質量，g；m1，離心后蝦肉的質量，g。

1.3.5 菌落總數(TVC)的測定

參照GB4789.2—2016《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》[11]對南美白對蝦進行菌落總數的測定。稱取5 g蝦肉，加入45 mL滅菌生理鹽水，選擇3 個合適的稀釋度，用平板計數瓊脂計算蝦肉中的菌落總數，每個稀釋度倒兩個平板，選取菌落數量為30～300 個的平板進行計數。培養溫度為(30±1)℃，培養時間(72±3)h。

1.3.6K值的測定

參照CHENG等[12]的方法，稍作修改。稱取5 g碎蝦肉，加入10%(體積分數，下同)的高氯酸(perchloric acid，PCA)10 mL，勻漿1 min，4 ℃、8 000 r/min離心10 min。收集清液，沉淀加入 5%的PCA 5 mL洗滌，攪拌均勻，4 ℃、8 000 r/min離心分離10 min。重復2 次。合并3次上清液，用1 mol/L的KOH溶液和5%的PCA溶液調節上清液pH值至6.3～6.5，靜置30 min后過濾，定容至50 mL容量瓶中，搖勻。用0.22 μm的濾膜過濾后轉入棕色進樣瓶，于-30 ℃冰箱保存待測。

高效液相條件：色譜柱ODS-SPC18(4.6 mm×250 mm)，粒徑5 μm，以0.05 mol/L的K2HPO4和KH2PO4混合液(體積比1∶1)作為流動相，流速為1 mL/min，進樣量為15 μL，柱溫為30 ℃，檢測波長為254 nm。K值按公式(2)計算:

(2)

式中：ATP、ADP、AMP、IMP、HxR和Hx分別為三磷酸腺苷、二磷酸腺苷、單磷酸腺苷、次黃嘌呤核苷酸、肌苷酸和次黃嘌呤的含量，mg/L。

1.3.7 揮發性鹽基氮(TVB-N)的測定

使用自動凱氏定氮儀測定不同保鮮劑處理后的南美白對蝦在4 ℃冷藏過程中的TVB-N值。每組重復3 次，取平均值。

1.3.8 色差的測定

參考趙莉等[13]的方法，稍作修改，通過色差儀，測定南美白對蝦第二腹節的L*、a*、b*的值，每組實驗5次平行，結果取平均值。總體色差按公式(3)計算：

(3)

式中：ΔE，總體色差；Ln，第n天的L*值；L0，第0天的L*值；an，第n天的a*值；a0，第0天的a*值；bn，第n天的b*值；b0，第0天的b*值。

1.3.9 感官評定

依據對蝦的衛生標準[14]并參考考NIRMAL等[15]的方法。感官評定小組由5 名感官敏銳并具有感官評定經驗的人員組成，分值在9 分(極新鮮)和0 分(完全腐敗) 之間，對南美白對蝦從肌肉組織、外觀和氣味等方面進行評分。具體評分標準見表2。

表2 南美白對蝦官評分標準

1.4 數據處理

采用SPSS 17.0軟件對數據進行Ducan多重比較法進行差異顯著性檢驗和相關性分析，Origin 8.5軟件作圖。

2 結果與分析

2.1 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中pH值的影響

pH值的大小可判定水產品品質的優劣度。南美白對蝦在冷藏過程中，隨著時間的延長，其pH值在貯藏前期略有降低，但隨著貯藏時間的延長，pH值逐漸升高(圖1)。pH值的下降主要是由于蝦體在死亡后，從僵硬至自溶解僵轉變階段會隨著糖原降解而產生乳酸，并且ATP會分解成磷酸等酸性物質，導致pH值降低[16]。也有研究表明是由于脂肪水解產生了游離脂肪酸而導致pH值的下降[17-18]。隨著貯藏時間的延長，蝦肉進入自溶腐敗階段，在此過程中，由于蝦肉自身的酶類和微生物活動導致其體內的蛋白質、氨基酸等含氮化合物分解為三甲胺等堿性含氮物，使得pH值逐漸升高[19]。SHAMSHAD等[20]研究指出,pH值為7.8是區分品質可否接受的關鍵點。由圖1可知，CK組和PTM組在第6天時的pH值已超出可接受范圍，CTS、CP1和CP3組第8天時，pH值分別為7.76、7.78和7.74，接近可接受范圍，CP2組在第10天時超出可接受范圍。與對照組相比，CTS、PTM、CP1、CP2和CP3處理組均能夠有效抑制貯藏后期蝦肉pH值的升高。尤其是CP2組最為明顯。這說明復配保鮮劑能夠有效的控制酶和微生物的活性，從而延緩蝦肉的腐敗變質。

圖1 魚精蛋白復配保鮮劑對冷藏南美白對蝦pH值的影響

2.2 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中脂肪氧化程度的影響

水產品中的不飽和脂肪酸易氧化成不穩定的氫過氧化物，繼而進一步水解為醛、酮等物質，其中丙二醛(malondialdehyde，MDA)是主要的降解產物，其與TBA反應生成紅色絡合物，可用來評價脂肪的氧化程度[21]。由圖2可知，新鮮的蝦肉經保鮮劑處理后的TBA值約為0.04 mgMDA/kg，各組的TBA值均呈上升趨勢。主要是由于隨著蝦肉中多不飽和脂肪酸有氧氧化程度的不斷加深而生成過氧化物和最終產物，導致其后期TBA值不斷升高[22]。由圖2可以看出，對照組(CK)的TBA值呈直線上升趨勢，而處理組(CTS、PTM、CP1、CP2和CP3)的TBA值在前6 d時變化差異不大，其上升速度明顯低于對照組(CK)。從第6天開始，各處理組的TBA值顯著升高，其中PTM組上升的最快，而魚精蛋白-殼聚糖復配處理組表現出明顯的抑制作用。說明含有殼聚糖的復合保鮮劑不僅可以延緩南美白對蝦脂肪氧化速率，而且還能降低南美白對蝦脂肪氧化程度。該結果與劉金昉等[23]的研究結果一致。

圖2 魚精蛋白復配保鮮劑對冷藏南美白對蝦硫代巴比妥酸值的影響

2.3 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中持水力的影響

肌肉的持水力是反映肌肉品質的重要指標，直接影響產品的質構、鮮度及感官品質[24]。蝦肉中含有較多的水分，新鮮的蝦肉有較好的持水性。由圖3可知，新鮮的南美白對蝦的持水力為83%。隨著貯藏時間的延長，持水力整體呈下降趨勢，表明蝦肉開始逐漸腐敗。蝦肉在貯藏過程中持水力的變化與蝦體自身發生的反應有關，主要是肌肉組織的分解反應引起的蛋白質變性及分解。實驗組中蝦肉的持水力降低幅度較對照組小，主要是因為對照組中的樣品易滋生微生物，導致蛋白質被分解，難以與回滲水分進行水合作用，故持水力降低。CP1和CP2組表現出較優的持水力，該復合保鮮劑處理的蝦體持水力無顯著差異，均優于其他組別。

圖3 魚精蛋白復配保鮮劑對冷藏南美白對蝦持水力的影響

2.4 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中菌落總數(TBC)的影響

菌落總數的變化可反映出生物體中蛋白質和氨基酸在微生物的作用下分解代謝的情況，是衡量水產品腐敗情況的重要指標。蝦類的菌落總數小于等于5.0 lgCFU/g為一級鮮度，菌落總數在5.0 lgCFU/g～5.7 lgCFU/g為二級鮮度；當蝦體的菌落總數大于6.0 lgCFU/g時，認為不宜食用[25-26]。南美白對蝦冷藏過程中菌落總數的變化如圖4所示。隨著冷藏時間的延長，南美白對蝦的菌落總數整體呈上升趨勢。鮮活南美白對蝦的菌落總數為4.3 lgCFU/g，為一級鮮度。冷藏至第2天時，南美白對蝦的菌落總數不僅沒有升高反而出現下降趨勢，可能是因為蝦體中不耐寒菌體死亡以及魚精蛋白和醋酸浸泡處理起到了殺菌作用而導致。姚潔玉等[27]對殼聚糖-柑橘精油微膠囊對南美白對蝦的保鮮效果研究中發現，貯藏1 d后的南美白對蝦的菌落總數較新鮮樣品的菌落總數低，可能因為醋酸浸泡與殼聚糖-柑橘精油微膠囊處理的結果。對照組從第2天起，微生物增長迅速，第6天的菌落總數為5.42 lgCFU/g，在二級鮮度范圍內，第8天已超出二級鮮度范圍。處理組中菌落總數的增長速度均慢于對照組，PTM組的菌落總數第6天為5.15 lgCFU/g，為二級鮮度，總菌落數較對照組低，說明魚精蛋白可在一定程度上抑制微生物的生長繁殖，冷藏第10天時，菌落總數為5.90 lgCFU/g，超出二級鮮度范圍；CTS組的菌落總數在第8天時為二級鮮度，第10天時已超出二級鮮度范圍；CP1、CP2和CP3組的菌落總數第8天時分別為5.42、5.24、5.25 lgCFU/g，均為二級鮮度，冷藏至第10天時菌落總數均在二級鮮度范圍內，因此說明用單純的魚精蛋白作為保鮮劑對南美白對蝦的保鮮效果并不理想，而與殼聚糖復配后可提高其保鮮效果。

圖4 魚精蛋白復配保鮮劑對冷藏南美白菌落總數的影響

2.5 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中K值的影響

K值是用來評價水產品的鮮度指標之一，其與ATP及其降解產物有關。水產品在貯藏過程中ATP的降解途徑為：ATP→ADP(二磷酸腺苷)→AMP(一磷酸腺苷)→IMP(肌苷酸)→HxR(肌苷)→Hx(次黃嘌呤)。胡亞芹等[28]指出K值越小，表示鮮度越好。K值越大，表明水產品中的蛋白質分解越嚴重。LI等[29]的報道指出，生物的種類、肌肉組織、捕食等因素均會對K值產生影響。一般認為，K值不大于20%時為一級鮮度，20%～40%為二級鮮度，大于60%時為初期腐敗[30-31]。由圖5可知，K值隨貯藏時間的延長不斷上升。對照組的K值在第4天時已接近二級鮮度，第6天時超出二級鮮度，而處理組的K值均低于對照組，在貯藏后期，CP1、CP2和CP3組表現出明顯的優勢，3組無顯著差異。而對照組和PTM組的鮮度指標較差。

2.6 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中揮發性鹽基氮(TVB-N)值的影響

揮發性鹽基氮(TVB-N)是動物性食品在內源酶和微生物的作用下，分解產生的二甲胺、三甲胺及其他氨類化合物，是用來評價水產品腐敗程度的常用指標之一[32]。根據國標GB 2733—2015《鮮、凍動物性水產品衛生標準》[33]規定，海水蝦的TVB-N含量不大于30 mg/100g為可接受范圍。此外，可根據TVB-N的含量劃分鮮度等級，其中TVB-N含量不大于15 mg/100g時為一級鮮度，不大于20 mg/100g時為二級鮮度，不大于30 mg/100g時為三級鮮度[34]。南美白對蝦4℃保藏過程中TVB-N值的變化如圖6所示。各組的TVB-N值隨著貯藏時間的延長呈上升趨勢。新鮮南美白對蝦的揮發性鹽基氮含量約為5.1 mg/100 g，屬于一級鮮度。對照組(CK)在整個冷藏過程中的上升速度最快，第2天時，各組的TVB-N值均未超過一級鮮度(P>0.05)，第4天時，對照組的TVB-N值為15.31 mg/100g，為二級鮮度，其他組別均為一級鮮度。對照組的TVB-N值在第8天時達到三級鮮度，第10天時已超過規定范圍；CTS、PTM、CP3組均在第6天時達到二級鮮度，三者之間CTS和CP3組較優，且這2組之間無明顯差異(P>0.05)，PTM組第8天時為三級鮮度，第10天時已超出規定范圍，CP1和CP2組在第8天時為二級鮮度，第10天時為三級鮮度，CP3組第10天時也為三級鮮度，且CP1、CP2和CP3組的值均低于其他組，其中CP2組最優。由圖4和圖6可知，TVB-N的變化和菌落總數呈正相關，說明魚精蛋白-殼聚糖復配保鮮劑在抑制微生物生長，所以能顯著延緩南美白對蝦TVB-N的上升。

2.7 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中色差的影響

表3為魚精蛋白-殼聚糖復配保鮮劑對南美白對蝦處理后，在4 ℃冷藏期間，色差指標的變化。總的來看，6組的明暗度L*值均呈下降趨勢，表明蝦體顏色隨時間的延長逐漸加深。與對照組相比，處理組能顯著抑制L*值的下降(P<0.05)。冷藏第2天時，PTM、CP1、CP2、CP3組與CK和CTS組存在顯著性差異(P<0.05)，但前者的明暗度L*值卻相對較低，說明在貯藏前期，魚精蛋白的介入并不能保護蝦體顏色的加深；冷藏第6天時，CK組、CTS、PTM、CP1、CP2組和CP3組三者之間存在顯著性差異(P<0.05)，各處理組均優于CK組；冷藏第8天時，CK組、CTS、CP1、CP2、CP3組和PTM組三者之間存在顯著性差異(P<0.05)，但復配保鮮劑處理未能表現出明顯的優勢。a*值表示蝦體顏色在紅綠方向的變化。a*值為負，表示蝦體顏色偏綠，a*值為正，表示蝦體顏色偏紅。隨著冷藏時間的延長，a*值逐漸增加，說明蝦體表面顏色逐漸發紅，各處理組直接表現出顯著性差異(P<0.05)。b*值表示蝦體顏色在黃藍方向的變化。b*值為負，表示蝦體顏色偏藍，b*值為正，表示蝦體顏色偏黃，隨著冷藏時間的延長，蝦體顏色逐漸發黃，CTS組、PTM組和CP1、CP2、CP3組之間存在顯著性差異(P<0.05)，CP1、CP2、CP3組均優于其他處理組，但3組之間無顯著性差異(P>0.05)。因此，復配保鮮劑處理組能有效延緩蝦體的顏色變化。ΔE值表示的是蝦體總色差的大小。冷藏4 d后，對照組的ΔE值明顯上升，顯著高于各處理組。結果表明，CP1、CP2、CP3組與PTM組存在顯著性差異(P<0.05)，能明顯抑制蝦體顏色變化，而CP1、CP2、CP3組與CTS組相比無顯著性差異(P>0.05)。

表3 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中色差指標的影響

注: 同列小寫字母不同表示顯著差異(P<0.05)，同行大寫字母不同表示顯著差異(P<0.05)。

2.8 魚精蛋白復配保鮮劑對南美白對蝦冷藏過程中感官評定的影響

南美白對蝦感官評定結果如表4所示。由表4可知，隨著貯藏時間的延長，各組的感官評分均呈下降趨勢，其中對照組下降速度最快。貯藏第2天時，對照組與其他各組存在顯著性差異(P<0.05)。在貯藏后期，3種比例復配的保鮮劑處理組感官評分均優于其他各組，CP2組得分最高，但三者之間無顯著性差異(P>0.05)。

表4 南美白對蝦感官評定結果

注：表中數據為樣品“感官品質平均分值±標準差”(n=5)；表中同一列的不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)；表中同一行的不同大寫字母表示差異顯著(P<0.05)。

3 結論

研究發現單純的魚精蛋白處理組保鮮效果并不樂觀，可能是由于蝦類含有較高的蛋白質和水分，易腐敗變質，同時也因為魚精蛋白對革蘭氏陽性菌的抑制作用優于革蘭氏陰性菌，而食品腐敗菌中，以革蘭氏陰性菌為主，因此保鮮效果不明顯。而魚精蛋白-殼聚糖復配保鮮劑對南美白對蝦的保鮮效果明顯優于其他處理組，可能是因為殼聚糖具有良好的成膜性，能抑制南美白對蝦的氧化黑變，同時與魚精蛋白復配后也增強了其保鮮效果。綜合pH值、硫代巴比妥酸值(TBA)、持水力、菌落總數(TBC)、K值和揮發性鹽基氮(TVB-N)等指標發現，3組魚精蛋白-殼聚糖復配處理組，即0.01 g/mL殼聚糖+0.001 g/mL魚精蛋白(CP1)、0.01 g/mL殼聚糖+0.003 g/mL魚精蛋白(CP2)和0.01 g/mL殼聚糖+0.005 g/mL魚精蛋白(CP3)中，CP2組表現出較優的保鮮效果，通過色差和感官評定結果發現，CP1、CP2和CP3處理組之間無顯著性差異。綜和考慮，CP2組為最優處理組，可以有效的控制微生物和酶的活性，從而延緩pH值、K值、菌落總數和揮發性鹽基氮的升高，降低蝦體的脂肪氧化程度，抑制肌肉組織中蛋白質的分解和變性，延緩持水力的降低。綜合來看，該復配保鮮劑是一種高效、安全的生物保鮮劑，能有效提高南美白對蝦的品質，延長其貯藏期，具有較大的推廣價值。該研究也為魚精蛋白在食品保鮮領域的應用提供參考依據。