紅曲菌液態發酵產天然黃色素的條件優化

管宏偉，劉婷婷，陳磊，許贛榮，張薄博

(江南大學 生物工程學院，糖化學與生物技術重點實驗室，江蘇 無錫，214122)

紅曲菌(Monascussp.)是一種小型的絲狀真菌，能產生多種重要的代謝產物，主要的包括紅曲色素、Monacolin 類物質、γ-氨基丁酸以及多糖等[1-4]。其中紅曲色素被廣泛地用于食品著色，特別是在中國、日本以及其他東南亞國家[5]。紅曲色素是包括紅曲紅色素、紅曲黃色素、紅曲橙色素在內的多種色素的混合物，作為與紅曲紅色素結構類似的同系物中的紅曲橙色素和紅曲黃色素這2種天然色素，尚未工業化生產[6]。目前天然色素僅占市場份額的30%，其余為合成與半合成色素[7]。但是由于合成與半合成色素潛在的毒性與致癌性，使得天然來源的色素受到了人們越來越多的關注和喜愛。紅曲菌發酵生產色素又分為固態發酵和液態發酵。相比于固態發酵，液態發酵不易污染、培養條件易控制、生產效率高，更適合大規模工業化生產，但目前已工業化的液態發酵過程僅適用于紅曲紅色素，而具有廣泛應用前景的紅曲黃色素由于技術水平的限制，尚未工業化生產[8-10]。雖然早期主要是以紅曲紅色素的形式被大眾接受，但隨著紅曲黃色素的研究深入，紅曲黃色素產品凸顯出了巨大的市場潛力[11]。因此，選育適合液態發酵生產紅曲黃色素的高產菌株，優化培養條件，提高發酵水平，逐漸成為國內外研究的熱點[12-14]。

近年來，紅曲黃色素的研究越來越受到關注，國內外研究者通過發酵優化的方式不同程度上提高了紅曲黃色素的產量。李瑞杰等使用紅色紅曲菌M-7為實驗菌株，對液態發酵生產水溶性紅曲黃色素的條件進行了優化，使得水溶性黃色素色價達到5.56 U/mL[15]。ZHOU等通過響應面的方法優化了紅曲菌突變體MYM的培養基組成，使得水溶性黃色素色價達88.14 U/mL[16]。LV等使用紫色紅曲菌進行液態發酵，通過在培養的第72 h添加5 g/L的司盤-80，醇溶性黃色素色價達到669.2 U/mL[12]。然而，已有的研究主要通過添加前體或效應因子等方式來提高黃色素產量，在成本或操作上存在一定的不足之處。

本研究利用前期研究室建立的雙液相發酵方法為基礎[17]，主要通過設計合理的碳氮源種類和濃度、無機鹽添加量，調控液態發酵過程的初始pH、培養溫度等條件，來進一步提高醇溶性紅曲黃色素的色價；此外，在優化發酵條件的基礎上，通過分離純化，液質聯用和核磁共振等手段解析黃色素分子結構，本文在一定程度上為紅曲黃色素發酵水平的提高以及工業化應用奠定了基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

紫色紅曲菌 sjs-6，本實驗室保藏菌種;玉米淀粉,上海塞翁福農業發展有限公司;中鏈甘油酯,上海佑創實業有限公司;耐高溫α-淀粉酶,江蘇銳陽生物科技有限公司;(NH4)SO4、NaNO3、KH2PO4、K2HPO4、無水CaCl2、MgSO4，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

HH-B11-360電熱恒溫培養箱，連云港醫療器械設備廠；HYL-C全溫搖床柜，太倉市實驗設備廠；GI100T高壓蒸汽滅菌鍋，上海申安醫療器械廠；GEX-9240MBE電熱鼓風干燥箱，上海博訊醫療設備廠；CX31光學顯微鏡，日本奧林巴斯株式會社；waters 1525高效液相色譜，美國Waters公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 培養基條件

紅曲菌，接種于PDA斜面，30 ℃避光培養7 d，4 ℃保藏。孢子懸浮液制備：利用無菌水將PDA斜面表層的孢子洗下，使孢子數達到1×107個/mL。種子培養基(g/L)：玉米淀粉 60，(NH4)2SO44，NaNO32，MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，K2HPO4·3H2O 2，KH2PO4·3H2O 2，FeSO41，用乳酸調pH值至5.0。分裝每瓶50 mL，121℃滅菌20 min。接種量為5 mL，30 ℃，180 r/min下培養2 d。

發酵培養基(g/L)：玉米淀粉60， (NH4)2SO44，NaNO32， MgSO4·7H2O 0.5，CaCl20.1，K2HPO4·3H2O 2，KH2PO4·3H2O 2，FeSO41，用乳酸調pH值至5.0。分裝每瓶50 mL，每瓶添加萃取劑20 mL，121℃滅菌20 min。接種量為10%，30 ℃、180 r/min下培養7 d。

1.3.2 培養條件的優化

在初始培養基的基礎上，分別探討了碳源、氮源的種類與添加濃度，金屬離子Mg2+濃度以及初始pH和培養溫度對紅曲菌產黃色素的影響。

1.3.3 檢測方法

1.3.3.1 色價檢測方法

取適量發酵液進行離心，離心條件為 6 000 r/min、 10 min，使萃取相與發酵液及菌體分離。取1 mL萃取相置于50 mL比色管內，用無水乙醇進行稀釋至適當倍數，進行全波長掃描，波長為300～600 nm，計算萃取相中色素色價及色調,如公式(1)、(2)所示(色價計算時，黃色素取OD410 nm，橙色素取OD460 nm， 紅色素取OD510 nm)：

發酵液色價/(U·mL-1)

(1)

(2)

1.3.3.2 菌體量檢測方法

將發酵液充分振蕩搖勻后，取適量發酵液進行離心，離心條件為6 000 r/min、 10 min， 輕輕吸去上層萃取相，留下層。以適量蒸餾水洗滌后用烘干的濾紙進行抽濾，50℃烘干水分至恒重，計算如公式(3)所示：

(3)

式中：A為菌體量，g/L；V為所取的發酵液的體積，mL；m1為烘干后菌絲體與濾紙的總質量，g；m2為濾紙的質量，g。

1.3.3.3 發酵液pH測定

取適量發酵液進行離心，離心條件為6 000 r/min、10 min，輕輕吸去上層萃取相。用標準緩沖溶液校準精密數字酸度計，校準完成后，用去離子水清洗酸度計，擦凈，測定待測發酵液的pH， 等讀數穩定即可記錄數據。

1.3.3.4 紅曲黃色素提取與分析方法

取適量發酵液進行離心，離心條件為6 000 r/min、10 min，取上層萃取相與體積分數為85%乙醇以1∶4體積比混合，倒入分液漏斗中，劇烈振蕩后靜置，待分層后取上層。將上層液體倒入旋轉蒸發儀的蒸餾燒瓶內，以溫度50 ℃、轉速100 r/min的條件進行旋轉蒸干，直至無液體蒸出。取出蒸干后的黃色素粗品再次進行離心，離心條件為6 000 r/min、10 min，取上層，避光保存于-20 ℃。

將提取的黃色素用無水乙醇稀釋適當的倍數后使用分析型高效液相色譜進行檢測，并使用分析性高效液相色譜制取一定量的黃色素純品。取2 mL制備型高效液相色譜收集液，通過液質聯用分析紅曲黃色素的相對分子質量，并采用核磁共振解析紅曲黃色素的結構。

2 結果與分析

2.1 氮源種類對紅曲菌液態發酵黃色素產量的影響

氮源作為微生物生長代謝必不可少的營養成分，在紅曲菌發酵產色素過程中起著至關重要的作用。PISAREVA等通過研究發現，尿素是作為紅曲菌發酵生產色素的最佳氮源[18]。而也有研究表示，蛋白胨在紅曲菌發酵過程中顯著促進了紅曲色素的合成，是紅曲色素合成的最有利的氮源之一[19-21]。由此可見，紅曲菌發酵生產色素的最優氮源具有菌株特異性。我們分別選取(NH4)2SO4、NH4NO3、檸檬酸銨、NH4Cl、牛肉浸膏、魚粉蛋白胨、酵母浸膏、酵母浸粉8種氮源進行優化，紅曲黃色素色價及菌體量如圖1-a所示。以無機氮源為唯一氮源時，黃色素色價因氮源種類不同而出現明顯的差異，其中以NH4NO3為氮源時，黃色素色價僅為32.84 U/mL，菌體量也較低，僅為5.61 g/L；以(NH4)2SO4為氮源時，黃色素色價能夠達到344.06 U/mL，在此條件下，紅曲菌sjs-6菌體生長狀況良好，菌體量超過20 g/L。以有機氮源為唯一氮源時，黃色素色價一般為200 U/mL左右，彼此間差距較小。由結果可知，以(NH4)2SO4為氮源時更有利于紅曲黃色素生產。

圖1-b中顯示的是不同條件下，紅曲菌色素產物在300～600 nm的吸收峰，其中黃色素的代表峰為(410±10)nm，橙色素的代表峰為(460±10)nm，紅色素的代表峰為(510±10)nm。由此可見，紅曲菌在不同氮源的條件下合成的主要色素成分是不一樣的，以有機氮源(圖1-a, 圖1-b中E～H)為唯一氮源時，紅曲菌sjs-6主要合成橙色素，其色價高于黃色素，黃色素的色調值小于1；無機氮源對紅曲菌合成色素的影響不一致，當以無機氮源(NH4)2SO4(圖1-a, 圖1-b中A)為唯一氮源時，黃色素的色調超過1，此時紅曲菌所產色素主要以黃色素為主。由此可見，通過調節氮源的種類能夠顯著改變紅曲菌液態發酵產生色素的主要色調，本文以黃色素為研究目標，因此，選擇(NH4)2SO4為氮源進行后續實驗。

A-(NH4)2SO4；B-NH4NO3；C-檸檬酸銨；D-NH4Cl；E-牛肉浸膏；F-魚粉蛋白胨；G-酵母浸膏；H-酵母浸粉a-氮源種類對紅曲菌生長、色素產量及黃色素色調的影響；b-氮源種類對紅曲色素萃取液吸收峰的影響

2.2 碳源種類對紅曲菌液態發酵黃色素產量的影響

碳源與氮源一樣是影響微生物發酵的重要因素，TZANN等通過研究發現，葡萄糖及其低聚糖和多糖在紅曲菌生長和色素生成方面均優于其他碳源[22]，而也有報導發現，半乳糖和乙醇更適合作為碳源用于紅曲菌發酵產色素[1,23]。可見，與氮源類似，紅曲菌發酵的最優碳源也具有菌株特異性。分別選取葡萄糖、果糖、麥芽糖、蔗糖、玉米淀粉、大米粉和甘油7種碳源進行優化，黃色素色價及紅曲菌菌體量如圖2-a所示。結果表明，不同碳源條件下菌體生長強度表現為：大米粉>玉米淀粉>麥芽糖>蔗糖>果糖>葡萄糖>甘油；不同碳源條件下黃色素合成能力為：麥芽糖>甘油>蔗糖>果糖>葡萄糖>大米粉>玉米淀粉。以多糖(大米粉、玉米淀粉)為碳源時，紅曲菌的菌體量明顯增加，但黃色素色價偏低，其中以玉米淀粉作為唯一碳源時，黃色素色價最低，僅為147.31 U/mL；以二糖(麥芽糖、蔗糖)為碳源時，黃色素色價較高，尤其是以麥芽糖為唯一碳源時，黃色素色價達到358.84 U/mL。這可能是因為麥芽糖為二糖，發酵過程中紅曲菌自身能夠合成相關酶類，催化麥芽糖緩慢分解生成單糖，使發酵液中單糖濃度持續維持在較適宜的水平，既避免了菌體大量生長，同時又促進了紅曲黃色素的合成與積累。可知，紅曲菌sjs-6生產紅曲黃色素的最佳碳源為麥芽糖。

由圖2-b可見，當使用不同種類的碳源時，紅曲菌合成的色素吸收峰主要集中在420 nm左右，未發生明顯的波峰遷移，說明與氮源影響因素相比，碳源種類只對黃色素的產量產生一定的影響，對產色素種類幾乎無影響。為了研究碳源種類對紅曲色素色調的影響，分別測定黃色素、紅色素、橙色素的色價，計算色素色調，結果如圖2-a所示。當以麥芽糖、大米粉為碳源時，色素色調值大于1，此時紅曲菌sjs-6主要生產黃色素，其產量遠高于其他色素成分；當以葡萄糖、果糖、蔗糖、玉米淀粉、甘油為碳源時，紅曲菌sjs-6液態發酵得到的黃色素的產量低于其他色素之和；由此可見，當以麥芽糖為紅曲菌發酵的碳源時，發酵產物以黃色素為主，且色價最高。

A-葡萄糖；B-果糖；C-麥芽糖；D-蔗糖；E-玉米淀粉；F-大米粉；G-甘油a-碳源種類對紅曲菌生長、色素產量及黃色素色調的影響；b-碳源種類對紅曲色素萃取液吸收峰的影響

2.3 氮源添加量對紅曲菌液態發酵黃色素產量的影響

以(NH4)2SO4為唯一氮源，分別選擇6種不同氮源添加量(2、4、6、8、10、12 g/L)進行實驗。紅曲菌菌體量及黃色素色價如圖3所示，當氮源添加量由2 g/L 增長至6 g/L時，紅曲菌的菌體量由8.28 g/L增長至13.28 g/L，相應的黃色素色價也呈現出上升趨勢；當氮源添加量高于6 g/L，紅曲菌菌體量趨于穩定狀態，而黃色素色價持續上升，直至氮源添加量為10 g/L時，黃色素色價達到最高值；當氮源添加量繼續由10 g/L增長至12 g/L時，黃色素色價反而降低。由此可知，(NH4)2SO4的最優添加量為10 g/L。

研究發現，發酵過程中氮源添加量不同，紅曲菌色素的色調也會改變。圖3中顯示出紅曲色素色調的相應變化，可見，當氮源添加量為2 g/L時，紅曲菌合成其他色素量高于黃色素，色素色調值低于1；當氮源添加量從4 g/L增至10 g/L時，色素色調值由1.0增至1.2，紅曲菌主要合成黃色素；當氮源添加量超過10 g/L時，色素色調值略有下降，紅曲菌仍以黃色素為主產物，但其他色素的合成比率上升。由結果可知，10 g/L為紅曲菌液態發酵的最佳氮源添加量。

圖3 氮源添加量對紅曲菌生長、色素產量及黃色素色調影響

2.4 碳源添加量對紅曲菌液態發酵黃色素產量的影響

以麥芽糖為唯一碳源，分別選擇5種不同添加量20、40、60、80、100 g/L進行發酵優化實驗，紅曲菌菌體量及紅曲黃色素色價如圖4所示。當碳源添加量為20 g/L時，紅曲菌菌體量及黃色素色價均處于較低水平；當碳源添加量由40 g/L增長至80 g/L時，紅曲菌生長代謝過程得到充足的碳源，菌體量逐漸穩定于14 g/L左右，黃色素色價持續上升；當碳源添加量為80 g/L時，黃色素色價最高，達到427.65 U/mL；當碳添加量繼續由80 g/L增長至100 g/L時，黃色素色價反而隨之降低。

不同的碳源添加量對紅曲黃色素色調有著一定影響，當碳源添加量由20 g/L增至100 g/L時，發酵產物中紅、橙、黃3種色素的色價有所變化，但黃色素色調值始終大于1.0，表明紅曲菌主要合成黃色素。綜上結果，紅曲菌生產黃色素的最佳碳源添加量為80 g/L。

圖4 碳源添加量對紅曲菌生長、色素產量及黃色素色調的影響

2.5 Mg2+添加量對紅曲菌液態發酵黃色素產量的影響

金屬離子，尤其是Mg2+，對紅曲菌生長和色素生產有極大的影響，有研究表明，當Mg2+質量濃度在0.06～0.96 g/L時，隨著Mg2+濃度的增加，紅曲色素的產量也隨之出現明顯的提高[22]。本實驗以MgSO4為Mg2+來源，分別選擇4種不同添加量0.5、1.0、1.5、2.0 g/L，對Mg2+添加量進行優化，紅曲菌菌體量及黃色素色價如圖5所示。當Mg2+添加量由0.5 g/L增至1.0 g/L時，黃色素色價由244.14 U/mL增長至333.79 U/mL，紅曲菌菌體量由9.94 g/L上升至11.31 g/L；當Mg2+添加量繼續增加時，不利于紅曲菌的生長及黃色素的合成，可能是由于此時Mg2+濃度過高，抑制了紅曲色素相關合成酶的活力。由實驗可知，最佳Mg2+添加量為1.0 g/L，在此條件下黃色素色價最高。

同時研究發現，Mg2+添加量能夠影響紅曲菌合成色素的色調。當Mg2+添加量由0.5 g/L增至2.0 g/L時，紅曲黃色素的色調值有所下降，但始終大于1.0，表明紅曲菌主要合成黃色素；當Mg2+添加量為0.5 g/L時，黃色素色調值最高，此時黃色素的產量約為其他兩種色素產量的1.89倍。綜合考慮色價的結果，選擇Mg2+添加量為1.0 g/L。

圖5 Mg2+添加量對紅曲菌生長、色素產量及黃色素色調的影響

2.6 初始pH對紅曲菌液態發酵黃色素產量的影響

一般來說，紅曲菌生長和色素生產的較適pH為4.0～7.0，不同pH的培養基可能會影響紅曲色素組成，YONGSMITH等發現，在初始pH 7.0的條件下Monascussp. KB 10合成橙紅色的色素混合物，在初始pH低于4時Monascussp. KB 10產生淺金色的色素混合物[24]。CHEN等也發現，當pH值低于4時，M.purpureusUQM 192F產黃色素ankaflavin的能力顯著提高[19]。本實驗以乳酸進行pH調節，分別選擇6種不同初始pH(3、4、5、6、7、8)，研究發酵培養基初始pH對紅曲菌生長及黃色素產量的影響。紅曲菌菌體量及黃色素色價如圖6所示，當發酵液pH過低或過高(處于3或8)時，紅曲菌生長受到抑制，菌體量偏低，對應的黃色素色價也較低。尤其是當pH為3時，黃色素色價僅為111.01 U/mL；當pH在4～7時，紅曲菌生長狀況較好，菌體量穩定于12 g/L左右，各實驗組黃色素色價均大于400 U/mL。其中pH為6時，黃色素色價最高，達到444.44 U/mL。因此紅曲菌液態發酵產黃色素的最佳初始pH為6。

不同初始pH的培養基會影響紅曲黃色素色調，初始pH值為3時黃色素產量低于其他色素之和，黃色素色調小于1.0；當初始pH在4～8范圍內時，黃色素色調均大于1.0，紅曲菌主要合成黃色素，尤其是當初始pH值為7時，黃色素產量為其他色素產量的1.33倍，黃色素色調值最高。

圖6 初始pH對紅曲菌生長、色素產量及黃色素色調的影響

2.7 培養溫度對紅曲菌液態發酵黃色素產量的影響

一般來說，紅曲菌在25～30℃下培養適合菌體的生長及色素的生產，不同的培養溫度對紅曲菌的色素合成有著顯著的影響，如AHN等報道，當Monascussp. J101在25 ℃下培養時，紅曲紅色素產量比30 ℃時高10倍[25]。本實驗選取26、28、30、32、3 4℃5種培養溫度，研究培養溫度對紅曲菌生長及黃色素產量的影響。紅曲菌菌體量及黃色素色價如圖7所示。當培養溫度由26℃增至30℃時，紅曲菌菌體量由6.81 g/L增至13.59 g/L，相應的黃色素色價由254.22 U/mL顯著增至508.61 U/mL；當培養溫度繼續提高，紅曲菌的菌體量仍較為穩定(13 g/L左右)，而黃色素色價則呈現較為明顯的下降趨勢。因此，30℃為紅曲菌sjs-6菌體生長和黃色素合成的最佳培養溫度。

不同培養溫度對紅曲黃色素色調也有一定的影響，隨著培養溫度升高(26～34 ℃)，黃色素色調值呈現上升趨勢。當培養溫度較低(<30 ℃)時，紅曲色素色調值低于1.0；當培養溫度超過30 ℃時，紅曲色素色調值大于1.0，此時紅曲菌合成黃色素量超過其他色素之和。由此可知，通過控制培養溫度，能夠有效減少其他色素合成，提高黃色素合成比例。

圖7 培養溫度對紅曲菌生長、色素產量及黃色素色調的影響

2.8 紅曲黃色素結構解析

將發酵結束后的紅曲黃色素進行提取之后，使用分析型高效液相色譜進行檢測，檢測圖譜如圖8-b所示。其峰為單一組分，從峰面積歸一化計，占樣品總量的97.18%。之后使用制備型高效液相色譜對該組分進行純化制備，以液質聯用法對已純化的紅曲黃色素的相對分子質量進行測定，由圖8-c可清晰地看出M+H(分子質量為359.1)的準分子離子峰，確定其相對分子質量為358 Da，與文獻報道中的一種主要的紅曲黃色素-紅曲素(monascin)的分子質量一致。經核磁共振分析得知，該黃色素有26個氫，21個碳，包括3個羰基碳、3個甲基碳、3個亞甲基碳、5個次甲基碳以及4個季碳。以上信息與文獻報道中的紅曲素完全一致[26]，確定紅曲菌sjs-6在實驗室條件下發酵生產的黃色素為紅曲素，分子式為C21H26O5。

3 結論

本實驗以高產黃色素的紫色紅曲菌sjs-6為實驗對象，通過優化使黃色素色價達到508.61 U/mL，較未優化前提高了52%。并通過計算黃色素色調值的方法，更直觀地展示出黃色素的占比及其變化趨勢。此外，在優化發酵條件的基礎上，通過分離純化、液質聯用和核磁共振等手段解析黃色素分子結構。然而，目前的研究仍處于搖瓶水平，在發酵罐放大過程中仍有許多需要解決的問題。計劃下階段以目前優化的結果為基礎，進一步通過代謝調控的方式，提高紅曲黃色素的產量，并逐步在發酵罐中進行放大實驗，為實現紅曲黃色素的工業化應用奠定基礎。

a-紅曲素結構式;b-紅曲色素高效液相圖譜;c-純化后的紅曲黃色素質譜圖;d-純化后的紅曲黃色素13CNMR；e-1HNMR