山楂葉多酚的純化及其抗氧化特性與組分分析

巫永華，劉恩岐，張建萍，陳尚龍，陳安徽，邵穎

(徐州工程學(xué)院 江蘇省食品資源開發(fā)與質(zhì)量安全重點建設(shè)實驗室，江蘇 徐州， 221008)

山楂作為一種重要的藥用植物資源被收錄于《中國藥典》[1]和歐洲許多國家的藥典[2]中。研究表明不僅山楂果，山楂葉提取物也表現(xiàn)出良好的抗氧化[3]、抗炎、鎮(zhèn)痛[4]、調(diào)節(jié)免疫功能[5]和預(yù)防動脈粥樣硬化、冠心病[6]、調(diào)血脂[7]、降血糖[8]等改善心腦血管系統(tǒng)等方面的生理活性，這些功效與其所含有的原花青素、黃酮、酚酸等成分密切相關(guān)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)山楂葉中含有一定量的多酚物質(zhì)，其多酚粗提液具有較好的抗氧化活性[9]，但由于多酚粗提液含有較多的多糖、蛋白質(zhì)等雜質(zhì)，會影響其生理活性評價的準確性，因此有必要對其進行分離純化，以獲得純度較高的多酚物質(zhì)，并評價其生理功能。

大孔吸附樹脂具有良好的化學(xué)穩(wěn)定性和吸附選擇性，同時還有吸附量大、操作條件溫和、簡單、安全、不易受酸堿和雜質(zhì)的影響、可再生、使用周期長，有利于大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點，被廣泛用于天然活性化合物的分離純化[10-11]。近年來，大孔吸附樹脂純化多酚類物質(zhì)已有大量的報道[12-16]，并取得了較好的效果。但用于山楂葉多酚的純化鮮有報道，本文探討大孔吸附樹脂對山楂葉粗多酚的純化效果，分析純化后山楂葉多酚的抗氧化和多酚組成成分，為山楂葉多酚類物質(zhì)的進一步研究和在功能性食品、藥品中利用提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山楂葉，10月上旬采摘；纖維素酶(1 800 U/mg)、果膠酶(1 000 U/mg)、SP-825、XAD-2、AB-8和D101樹脂，上海源葉生物科技有限公司；KBr(光譜純)，美國PIKE公司；DPPH，Sigma公司；其余試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

R206旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海申生科技有限公司；HH-1恒流泵，上海嘉鵬科技有限公司；BSZ-100自動部分收集器，上海滬西分析儀器廠；TU-1810紫外分光光度計，北京普析通用有限公司；L550離心機，湖南湘儀離心機儀器有限公司；1260Ⅱ高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司；Nicolet iS10傅里葉紅外光譜儀，美國Thermo fisher公司。

1.3 山楂葉粗多酚的制備

參照課題組優(yōu)化的方法制備山楂葉多酚[9]。將新鮮的山楂葉于放置于60 ℃鼓風(fēng)干燥箱中干燥24 h，粉碎后過50目篩。取適量山楂葉粉，加入5倍的石油醚，室溫攪拌24 h，靜置分層后下層再加入適量石油醚，重復(fù)以上操作3次進行脫脂脫蠟。準確稱取脫脂山楂葉粉100 g，加入質(zhì)量濃度為0.20 mg/mL的復(fù)合酶(纖維素酶與果膠酶質(zhì)量比為1∶1)的水溶液4 000 mL，在40 ℃，pH 4.5下酶解2 h，過濾，收集濾液。濾渣中加入70%乙醇400 mL，于50 ℃下浸提2 h，抽濾，合并上述提取液，加無水乙醇至醇濃度為80%，4 ℃過夜，離心，上清液減壓濃縮，冷凍干燥后得到山楂葉粗多酚粉，置于-20 ℃下保存，備用。

1.4 大孔樹脂純化山楂葉粗多酚

1.4.1 大孔樹脂的預(yù)處理

取一定量的SP-825，D101，AB-8，XDA-2樹脂，用無水乙醇處理24 h后用蒸餾水沖洗至無醇味，用5% NaOH處理8 h后，蒸餾水洗至中性，再用1 mol/L HCl處理8 h后，用純水洗至中性，抽濾，備用。

1.4.2 最佳樹脂的篩選

通過靜態(tài)吸附、解吸試驗篩選出對山楂葉多酚分離性能最佳的樹脂。稱取經(jīng)預(yù)處理的4種樹脂各5.00 g，各加入100 mL質(zhì)量濃度為1.6 mg/mL的山楂葉多酚粗提液，在25℃、120 r/min下水浴振蕩，每隔1 h吸取1 mL上清液，測其多酚含量，至吸光值無明顯變化為止。倒去上清液后，加入50%的乙醇溶液100 mL，25℃、120 r/min水浴振蕩，每隔1 h吸取1 mL上清液，測其多酚含量，至吸光值無明顯變化為止。按公式(1)和(2)計算不同樹脂的吸附率和解吸率：

(1)

(2)

式中：C0,初始多酚質(zhì)量濃度，μg/mL；C1,吸附平衡后上清液的多酚濃度，μg/mL；C2,解吸后乙醇洗脫液中的多酚質(zhì)量濃度，μg/mL。

1.4.3 AB-8大孔樹脂靜態(tài)吸附-解吸試驗

1.4.3.1 樣液pH的確定

分別稱取處理好的樹脂2.00 g于5個錐形瓶中，加入50 mL一定質(zhì)量濃度的山楂葉多酚樣液，調(diào)pH值為4.0、4.5、5.0、5.5、6.0，于25℃下120 r/min振蕩吸附8 h，測定上清液中多酚含量，考察樣液pH值對樹脂吸附性能的影響

1.4.3.2 樣液初始濃度的確定

稱取處理好的樹脂2.00 g于5個錐形瓶中，分別加入50 mL質(zhì)量濃度為57.14、64.27、71.43、78.57、85.71 μg/mL的山楂葉多酚粗提液，在最優(yōu)pH及25℃、120 r/min下振蕩吸附8 h，測定上清液中多酚含量，考察樣液初始濃度對樹脂吸附性能的影響。

1.4.3.3 洗脫劑濃度的確定

在最佳上樣pH和濃度條件下進行吸附，吸附飽和后，分別用體積分數(shù)為60%、70%、80%、90%、100%的乙醇作為洗脫劑，在洗脫液料比為25∶1(乙醇溶液∶大孔吸附樹脂，mL∶g)，25℃、120 r/min下振蕩解吸2 h，測定上清液中多酚含量，考察洗脫劑濃度對AB-8大孔樹脂解吸性能的影響。

1.4.4 AB-8大孔樹脂動態(tài)吸附-解吸試驗

1.4.4.1 上樣流速的選擇

將預(yù)處理好的AB-8大孔樹脂裝入玻璃層析柱(1.5 cm×26 cm)中，沉降30 min，在最佳pH和濃度條件下，將山楂葉多酚提取液分別以0.5、1.0、1.5 mL/min的流速上柱，按3 mL每管收集流出液，并測定各管流出液的總酚含量。

1.4.4.2 洗脫流速的選擇

吸附液全部流過后，再用蒸餾水過柱，將吸附后的樹脂洗至流出液為無色時，使用最優(yōu)濃度的乙醇，分別以0.4、0.6、1 mL/min的洗脫速度對其進行洗脫，按3mL每管收集流出液，并測定各管流出液的總酚含量。

1.5 總酚含量的測定

總酚含量的測定參照陳安徽等[9]報道的方法。以沒食子酸為標準品，繪制標準曲線，獲得的回歸方程為y=0.091 9x+0.030 8，R2=0.999 3，相關(guān)性良好。測定樣品中多酚含量時，移取樣液1 mL于25 mL棕色容量瓶中，按照標準曲線的方法進行操作，并根據(jù)回歸方程計算出樣液中的多酚含量。

1.6 山楂葉多酚抗氧化活性分析

試驗以總還原力、Fe2+離子螯合能力、DPPH·和·OH清除能力為指標，參照陳安徽等[9]報道的方法測定分析山楂葉多酚純化前和純化后的抗氧化活性。

1.7 山楂葉多酚的組分分析

分別用稱取20 mg的沒食子酸、兒茶素、綠原酸、咖啡酸、表兒茶素、阿魏酸、蘆丁、槲皮素、山奈酚和熊果酸，用甲醇溶解，配成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的單一標準液，各取120 μL混合配成10種物質(zhì)的混合標準品，分別用0.22 μm 濾膜過濾后用于HPLC檢測。樣品用甲醇溶解后，用0.22 μm濾膜過濾后檢測。

分析條件：采用安捷倫1260ⅡHPLC 系統(tǒng)，二極管陣列(DAD)檢測器，自動進樣器進樣，Agilent C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)。參考史斌斌[17]的方法，并根據(jù)預(yù)試驗結(jié)果稍作修改，流動向 A為0.8%乙酸，B為色譜甲醇，柱溫 28 ℃，進樣量 20 μL，流速 0.9 mL/min。流動相洗脫方法見表1所示：

表1 流動相梯度洗脫方法

1.8 山楂葉多酚的FTIR分析

參考曠慧[18]的方法，取山楂葉多酚純化物1～2 mg與200 mg烘干后的光譜純KBr混合均勻，研磨至粒度小于2 μm的粉末。用壓片機壓成均勻透明的薄片，在波長4 000～400 cm-1掃描，獲得FTIR圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 大孔樹脂分離純化山楂葉多酚的試驗結(jié)果

2.1.1 樹脂種類及靜態(tài)吸附、解吸時間的確定

不同的樹脂由于其物理和化學(xué)特性不同，會表現(xiàn)出對目標物的吸附特性不一樣。試驗選擇的4種樹脂對山楂多酚提取物的吸附效果見圖1。總體而言，4種樹脂對山楂葉多酚都具有較好的吸附效果，均達到了97%以上，但相比較而言，AB-8的吸附效果較好。從吸附時間對吸附率來看，4種樹脂在試驗條件下吸附8 h即可待到吸附平衡。故選擇8 h為最佳吸附時間。

圖1 樹脂種類和吸附時間對吸附率的影響

圖2 樹脂種類和解吸時間對解吸率的影響

吸附平衡后，采用50%的乙醇進行解吸，由圖2可知，解吸率在前2 h時內(nèi)迅速增加，達到72%以上，之后趨于平穩(wěn)，表明解吸2 h即可達到良好的解吸效果；4種樹脂中SP-825的解吸效果最好，其次是AB-8，但二者的解吸率沒有顯著差異。

樹脂對目標物的吸附和解吸效果都好時才能最大限度的純化回收多酚物質(zhì)。綜合吸附和解吸試驗結(jié)果，AB-8樹脂對山楂葉多酚的純化效率最好，故選擇AB-8為最佳樹脂進行后續(xù)研究。

2.1.2 AB-8樹脂靜態(tài)吸附-解吸條件的確定

2.1.2.1 樣液pH的選擇

樣液pH不同會改變?nèi)芤旱娜芙舛龋M而影響樹脂的吸附效果，山楂葉多酚粗提液的酸堿值會對樹脂吸附作用的影響見圖3。由圖3可知，AB-8樹脂對山楂葉多酚的吸附效果在pH為4.5時，吸附率最高。因此，選定pH值為4.5作為純化時樣液的最佳酸堿環(huán)境。不同酸堿度會改變?nèi)芤褐心繕顺煞值拇嬖谛问剑淖內(nèi)芤簶O性，從而影響其與大孔吸附樹脂間的分子作用力，而山楂葉多酚含有一定的酚羥基結(jié)構(gòu)，呈弱酸性，在酸性條件下比較穩(wěn)定，也利于大孔樹脂對多酚的吸附[12,19]。

圖3 pH值對吸附率的影響

2.1.2.2 上樣濃度的選擇

起始上樣濃度的不同會導(dǎo)致單位體積多酚分子與樹脂接觸數(shù)量不同而呈現(xiàn)不同的吸附效果，試驗結(jié)果見圖4。由圖4可以看出，吸附率隨著上樣濃度的增大呈現(xiàn)的趨勢是先增加后減小，并在質(zhì)量濃度為64.29 μg/mL時吸附率最大，這可能是由于濃度增加有利于增大多酚分子與樹脂的接觸面積以提高吸附率，但是濃度過高時黏度會比較大，不利于其他分子與樹脂接觸、阻礙分子的擴散且增加了雜質(zhì)對樹脂的競爭，且易產(chǎn)生沉淀，堵塞樹脂，造成多酚吸附率下降；而過低的濃度會有部分樹脂未達到吸附飽和[20]。因此，選定質(zhì)量濃度為64.29 μg/mL時作為純化時樣液初始上樣濃度。

圖4 上樣濃度對吸附率的影響

2.1.2.3 洗脫劑濃度的選擇

試驗選擇不同體積分數(shù)的乙醇進行解吸，試驗結(jié)果見圖5。由圖5可以看出，解吸率隨著乙醇體積分數(shù)的增大先急劇上升再急劇下降，當(dāng)乙醇體積分數(shù)是70%時解吸率最大。這可能與山楂葉多酚的主要組成成分的極性相關(guān)，但乙醇體積分數(shù)小于70%時，多酚與樹脂間形成的氫鍵不能被破壞，多酚無法洗脫下來，而高濃度乙醇的極性與山楂葉多酚的極性差距較大，解吸率會降低[21]；也有認為高濃度乙醇中水分含量較少，使一些水溶性酚類物質(zhì)無法被洗脫下來，導(dǎo)致解吸率降低[22]。因此，選定體積分數(shù)為70%的乙醇作為解吸時的洗脫劑。試驗結(jié)果與何婷采用AB-8樹脂純化龍眼核多酚的結(jié)果一致[23]。

圖5 乙醇體積分數(shù)對解吸率的影響

2.1.3 AB-8樹脂動態(tài)吸附-解吸試驗結(jié)果

2.1.3.1 上樣流速對樹脂吸附效果的影響

動態(tài)吸附過程中流速是影響樹脂吸附率的主要因素，當(dāng)流出液多酚含量為上樣液多酚含量的1/10時，被認為是泄漏點，當(dāng)出現(xiàn)泄漏點時停止上樣，被認為是吸附的最佳狀態(tài)[24]。上樣流速對AB-8樹脂吸附效果的影響試驗結(jié)果見圖6。隨著上樣液體積的增加，不同上樣流速時流出液中多酚的含量逐漸增大。當(dāng)流速為0.5 mL/min時，上樣29 mL左右達到樹脂吸附泄漏點；流速為1 mL/min時，上樣13 mL左右達到樹脂吸附泄漏點；流速為1.5 mL/min時，上樣10 mL左右達到樹脂吸附泄漏點；有報道認為上樣流速過快時，目標物與大孔樹脂不能充分接觸、吸附，使部分目標物直接流出柱子，過早出現(xiàn)泄漏點，導(dǎo)致樹脂吸附效果不高[12]。而流速越慢，雖有利于樹脂對山楂葉酚類物質(zhì)的吸附，但泄漏點越遲使得生產(chǎn)周期偏長。綜合分析，本試驗確定上樣的最佳流速是1 mL/min。此流速條件下最佳上樣量應(yīng)為13 mL。

圖6 上樣流速對吸附率的影響

2.1.3.2 洗脫速度對樹脂解吸效果的影響

洗脫流速對多酚解吸效果的結(jié)果見圖7。當(dāng)洗脫流速為0.4 mL/min和0.6 mL/min時得到的峰形相對較窄，且拖尾狀況不明顯，當(dāng)洗脫流速為1 mL/min時得到的洗脫峰會有較嚴重的拖尾現(xiàn)象。有報道認為洗脫流速過慢，則解吸時間延長，且在流動過程中被洗脫的多酚可能會被重新吸附，兩相間會重新建立動態(tài)平衡，降低解吸量；若洗脫流速過快，則會導(dǎo)致洗脫劑與樹脂的接觸時間短，無法充分解吸出來，降低解吸率[13]。綜合考慮，試驗確定洗脫的最佳流速是0.6 mL/min。此流速條件下最佳洗脫體積應(yīng)為30 mL。在此條件下洗脫下來的多酚回收率為78.25%，純化前后多酚的純度由(15.72±1.86)%，提高到了(80.93±2.32)%，提高了4.15倍。

圖7 洗脫流速對解吸率的影響

2.2 山楂葉多酚的抗氧化試驗結(jié)果

2.2.1 清除DPPH·能力的試驗結(jié)果

清除DPPH·的活性與抑制過氧化能力正相關(guān)，可用于評價自然植物的清除自由基效果。山楂葉多酚純化前后對DPPH·的清除效果見圖8，由圖8可以看出，在試驗濃度內(nèi)，隨著多酚溶液濃度的增大，清除率也在不斷上升，純化后的山楂葉多酚在質(zhì)量濃度為2.16 μg/mL時，清除率已經(jīng)達到89.99%；由表1可知，山楂葉多酚純化前后對DPPH·的IC50值分別為(1.28±0.14) μg/mL和(0.78±0.09) μg/mL，經(jīng)純化后清除效果顯著高于純化前的粗多酚(P<0.05)，純化后的山楂葉多酚具有更強的清DPPH·的能力。

圖8 清除DPPH·自由基能力的試驗結(jié)果

2.2.2 總還原能力試驗結(jié)果

圖9是不同濃度的山楂葉多酚純化前后的總還原能力試驗結(jié)果。由圖9和表1可知，山楂葉多酚具有較強的總還原能力，具有較好的量效關(guān)系，純化前后的IC50值分別為(3.66±0.18) μg/mL和(2.12±0.23) μg/mL，純化后的總還原能力顯著高于純化前的粗多酚(P<0.05)。

圖9 總還原能力的測定結(jié)果

2.2.3 螯合Fe2+能力的試驗結(jié)果

螯合Fe2+是指螯合劑分子將Fe21包合到其內(nèi)部，整體變成穩(wěn)定的化合物以阻礙亞鐵離子起作用，從而起到抗氧化的效果。由圖10可知，隨著多酚溶液質(zhì)量濃度的增大，對Fe2+螯合率不斷提高，表現(xiàn)出良好的劑量-效果關(guān)系；由表1可知，山楂葉多酚純化前后螯合Fe2+的IC50值分別為(55.58±1.24) μg/mL和(34.13±1.02) μg/mL。純化后的螯合效果顯著高于純化前的(P<0.05)效果。有報道認為茶多酚的酚羥基極易與金屬離子螯合[25]，提示山楂葉多酚具有酚羥基結(jié)構(gòu)，能阻止金屬離子對自由基連鎖反應(yīng)的催化作用。

圖10 螯合Fe2+離子能力的測定結(jié)果

2.2.4 清除·OH能力的試驗結(jié)果

·OH是活性最強的一種自由基，具有極強的氧化性，使紅細胞受損，引發(fā)細胞病變。由圖11可知，隨著溶液濃度的增大，純化前后的山楂葉多酚的對·OH的清除能力不斷提高，具有良好的劑量-效果關(guān)系；在多酚的質(zhì)量濃度為5.39 μg/mL時，山楂葉多酚對·OH的清除率分別為56.21%和26.56%；由表2可知，山楂葉多酚純化后清除·OH的IC50值為(4.49±0.16) μg/mL，表明純化后的山楂葉多酚具有更好的清除·OH作用。

圖11 清除·OH能力的測定結(jié)果

表2是山楂葉多酚純化前后純度和對不同抗氧化體系的抗氧化能力的比較。山楂葉多酚具有較好的DPPH·、·OH清除能力、螯合Fe2+能力和總還原力，提示山楂葉多酚具有很強的抗氧化活性，同時，經(jīng)過AB-8樹脂純化后，山楂葉多酚的純度和對各體系的抗氧化能力顯著高于未純化的粗提液(P<0.05)。蔣孟君等[26]研究表明，經(jīng)大孔樹脂純化后玫瑰花多酚的抗氧化活性有所提高，與本研究結(jié)果一致，可能是由于大孔樹脂對多酚類物質(zhì)起到了純化和富集的作用。也有報道認為植物多酚的抗氧化能力與總酚含量密切關(guān)系，另外分子質(zhì)量越大其抗氧化活性也增強，還與酚羥基的數(shù)量和所在的位置有很大的關(guān)系[27]。

表2 山楂葉多酚對體外不同反應(yīng)體系抗氧化能力的比較(IC50值)

注：同一指標不同字母上標表示顯著差異。“-”表示不能計算。

2.3 山楂葉多酚純化物的紅外光譜分析結(jié)果

圖12 山楂葉多酚純化物的紅外光譜圖

2.4 山楂葉多酚組成及含量分析

分別確定每種標準品的出峰時間，并以10種單體酚為混標，采用 HPLC-DAD 法測定山楂葉多酚純化物的組成，同時對其含量進行分析。由圖13和表3可知，山楂葉多酚純化物檢測出了綠源酸，表兒茶素，阿魏酸，蘆丁和熊果酸5種單酚物質(zhì)，其中含量最高的是熊果酸，為(61.38±2.32) μg/mL。賈亞楠[2]也報道山楂葉中含有較高的綠原酸，表兒茶素和碳苷黃酮成分。弓威[31]從山楂葉中鑒定出了槲皮素，熊果酸和槲皮素3-O-β-D-葡萄糖苷等成分。

1-沒食子酸;2-兒茶素;3-綠源酸;4-咖啡酸;5-表兒茶素;6-阿魏酸;7-蘆丁;8-槲皮素;9-山奈酚;10-熊果酸；a-標準品；b-樣品

表3 山楂葉多酚純化后單體酚種類及含量

3 結(jié)論

植物多酚作為一種重要的次生代謝產(chǎn)物，具有多種生理生化功能，但要評價其生理功能就必須要獲得高純度的多酚組分，試驗研究了大孔吸附樹脂對山楂葉多酚的純化工藝，結(jié)果表明，在4種樹脂中，AB-8樹脂對山楂葉多酚的純化效果較好，其最佳的純化工藝為樣液初始pH 4.5、初始質(zhì)量濃度為0.064 mg/mL、上樣流速為1.5 mL/min、洗脫劑乙醇體積分數(shù)為70%和洗脫流速為0.6 mL/min，在此條件下，山楂葉多酚的回收率為78.25%，純化前后多酚的純度由(15.72±1.86)%，提高到了(80.93±2.32)%，提高了4.15倍。體外抗氧化活性試驗表明，山楂葉多酚表現(xiàn)出較好的抗氧化能力，其粗提液和純化液對DPPH·清除能力的IC50值分別為(1.28±0.14) μg/mL和(0.78±0.09) μg/mL；對Fe2+螯合能力的IC50值分別為(55.58±1.24) μg/mL和(34.13±1.02) μg/mL；總還原能力的IC50值分別為(3.66±0.18) μg/mL和為(2.12±0.23) μg/mL；純化后對·OH清除能力的IC50值為(4.49±0.16) μg/mL；表明經(jīng)純化后山楂葉多酚的抗氧化能力較純化前有了顯著提高。紅外光譜分析顯示其具有多酚和黃酮的特征峰；HPLC分析表明山楂葉多酚中含有綠源酸，表兒茶素，阿魏酸，蘆丁和熊果酸5種單酚物質(zhì)，結(jié)果表明山楂葉多酚具有較高的開發(fā)和應(yīng)用價值。但是本研究僅僅通過10種標準品來鑒定山楂葉的酚類物質(zhì)組成，未對其進行對其進行更進一步的純化以制備出單體組分，并通過HPLC-MS、核磁共振等手段進行鑒定。