超微茶粉和糯米粉對豬肉肌原纖維蛋白乳化特性的影響

孫克奎，姜雪娟，潘雅燕，縱心想，熊國遠*，周希

1(黃山學院 旅游學院，安徽 黃山，245021)2(安徽省農產品加工工程實驗室，安徽農業大學 茶與食品科技學院，安徽 合肥，230036)

肌原纖維蛋白(myofibrillar protein, MP)是組成肌肉中肌纖維的一種重要的蛋白質，約占肌肉中總蛋白質的50%～55%，其在影響加工肉制品質量方面起著關鍵作用[1]。對于肉類產品來說，它對肉制品獨特的風味和感官特性有重要影響[2]。國內外很多學者主要針對添加外源性物質改變MP功能特性的影響展開相關研究。袁程程等[3]將沙蒿膠加入蝦蛄肌原纖維蛋白中，研究報道了適當添加沙蒿膠有利于提高MP的乳化特性和理化性質；楊明等[4]將轉谷氨酰胺酶和馬鈴薯淀粉加入鯉魚肌原纖維蛋白中，研究表明兩者均能改善MP的功能特性；賈娜等[5]向豬肉肌原纖維蛋白中加入食用膠，研究發現食用膠均可顯著提高MP的乳化能力、凝膠硬度和彈性以及保水性，且添加量越高，增加的幅度越大；但添加食用膠后，肌原纖維蛋白的凝膠白度略有下降。ZHUANG等[6]將甘蔗膳食纖維加入到MP中研究報道了甘蔗膳食纖維可以提高MP凝膠的功能特性等，尋找并通過外源物質的添加不僅能改善MP的加工特性，而且對于開發新型功能食品也具有重要意義。

茶葉中含有很多功能成分，如茶多酚、茶多糖、維生素等，國內有一些關于茶多酚在肉制品中的報道，如馬嫄等[7]在午餐肉中分別添加一定量的茶多酚和TBHQ，研究報道了不同添加量茶多酚處理的午餐肉均有較好的抗氧化效果。XIONG等[8]向肉中加入綠茶提取物，研究發現茶提取物的抗氧化能力是由于其含有高含量的兒茶素、單寧等黃酮類化合物。梁進等[9]將茶多酚和納米茶多酚加入瘤株小鼠體內，研究報道了納米茶多酚對人肝癌細胞HepG2有明顯的生長抑制作用，并呈劑量與時效關系。但大多是茶中活性成分的利用，但茶粉對肉制品的影響還未見報道，且茶粉中纖維素含量高，市場上廢茶碎茶多，研究茶粉對MP的功能特性影響，這對茶粉在肉制品中的應用起重要的指導意義。糯米粉中主要成分是支鏈淀粉，淀粉是人體攝入能量的主要來源，由于其價格低、天然可再生，同時又是優良的增稠劑，因而被廣泛運用到食品工業中。YI等[10]將糯米粉添加進牛肉餅中，研究表明糯米粉能有效改善牛肉餅的理化性能和感官特性。GAO等[11]研究了糯米粉對豬肉餅品質的影響，研究表明添加3%的糯米粉的豬肉餅品質更好。但糯米粉對MP乳化特性的研究還未見報道。

本研究旨在評估超微茶粉和糯米粉對肌原纖維蛋白乳化特性的影響，研究不同質量濃度TP和GRF對MP乳化活性(emulsion activity index, EAI)、乳化穩定性(emulsion stability index, ESI)、起泡性(foaming ability, FA)、起泡穩定性(foaming stability, FS)乳化液粒度和分布、乳化液微觀的影響，以期對超微茶粉和糯米粉在肉與肉制品中的應用提供理論指導和參考，也為開發新型功能肉制品提供思路和借鑒。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 原料及主要試劑

(1)原料

普通綠茶,由安徽農業大學茶與食品科技學院提供;糯米粉,淮南市新食客食品有限公司;金龍魚牌大豆油,益海嘉里糧油有限公司;普通豬瘦肉,購于大潤發超市。

(2)主要試劑

NaH2PO4、Na2HPO4、NaCl、牛血清蛋白、CuSO4，酒石酸鉀鈉、NaOH、十二烷基磺酸鈉(SDS)、尼羅藍、尼羅紅、卡爾科弗盧爾熒光增白劑、異丙醇,以上試劑均為分析純。

1.1.2 主要設備與儀器

GZX-9070 MBE 數顯鼓風干燥箱，博訊實業有限公司醫療設備廠；Ultra Turrax T-25 Basic 高速分散器，德國IKA公司；LSM800 激光共聚焦顯微鏡，德國卡爾蔡司有限公司；Masterizer2000 激光粒度儀，英國馬爾文儀器有限公司；Beckman Avanti J-E 離心機，美國Beckman coulter公司；FE20實驗室pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；IKA C-MAG HS7 磁力攪拌器，德國IKA公司；PE Lambda35紫外可見分光光度計，力臻卓越科學儀器有限公司；JA503 分析電子天平，常州幸運電子設備有限公司；YXQM-1L系列行星球磨機，長沙米淇儀器設備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 原料的制備

(1)MP的提取

參照 PARK等[12]，并稍作修改。將豬肉剔除筋膜后充分斬碎至肉糜狀，加入4倍體積的磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.5)，緩沖溶液濃度為0.02 mol/L，肉漿在10 000 r/min 轉速下用高速分散器勻漿1 min，勻漿液在4 ℃下于冷凍離心機內以7 800 r/min 的轉速離心20 min，棄上清液，向沉淀中加入4倍體積磷酸鹽緩沖液離心，重復3次，得到粗MP。然后向粗MP中加入4倍體積的0.1 mol/L的NaCl 溶液，再勻漿離心1次，用冰洗液沖洗得到的沉淀，4層紗布過濾，濾液再次進行離心，離心后的沉淀即是MP。提取的MP用4 ℃的冰箱儲存，以備后續使用。實驗過程溫度保持在4 ℃左右。

(2)超微茶粉的制備[13]

利用球磨機生產超微茶粉的工藝，將茶葉于40 ℃干燥，再用小型家用粉碎機進行粗粉碎，過40目篩。將所得到的粗顆粒進球磨機(球磨機公轉盤轉速為400 r/min，粉碎時間為40 min)，得到的超微茶粉用粒度儀測定其平均粒徑為13.8 μm。

1.2.2 肌原纖維蛋白濃度的測定

用雙縮脲法測定[14]：用牛血清蛋白(BSA)作為標準蛋白，用去離子水將標準的結晶牛血清蛋白溶解，配制成10 mg/mL的標準蛋白溶液。測得標準曲線：y=0.046 7x-0.004 1；R2=0.999 4。隨后取1 g蛋白溶于25 mL磷酸鹽緩沖鹽，取3個試管分別加入1 mL樣品溶液，加入4 mL雙縮脲試劑，充分搖勻后在室溫下放置30 min，于540 nm處進行比色測定。

1.2.3 乳化活性和乳化穩定性的測定

(1)混合溶液的配制

將MP用0.6 mol/L NaCl溶液(pH=6.5)配制成1 mg/mL溶液。添加不同質量濃度的茶粉和糯米粉至MP的混合溶液中，攪拌至均勻形成混合溶液。

(2)參考AGYARE等[15]的方法，并稍作修改，采用濁度法。將大豆油與MP混合溶液以1∶4的比例加到燒杯中，使用高速分散器高速勻漿1 min(轉速為10 000 r/min)，立即從杯底0.5 cm處取出100 μL勻漿，加入5 mL 0.1% SDS溶液的試管中并進行振蕩(SDS的添加是為了防止乳化后聚集體的形成)，混合均勻。測定其在500 nm處的吸光值，記為A0。10 min后，用相同方法再次于500 nm處測定其吸光值，記為A10。

MP溶液的乳化活性和乳化穩定性可通過公式(1)和(2)進行計算:

(1)

(2)

式中：A500表示樣品在500 nm處的吸光值；ψ表示樣品中油相的體積分數(ψ=0.25)；C表示蛋白質溶液的質量濃度；A0和A10分別表示0 min和10 min取得的樣品的吸光值。

1.2.4 起泡性和起泡穩定性的測定

參考OGUNWOLU等[16]的方法，并有所修改。將MP溶于0.6 mol/L NaCl溶液，配制成5 mg/mL的蛋白溶液，然后添加不同質量濃度的茶粉和糯米粉至MP的混合溶液，室溫下磁力攪拌30 min形成混合溶液。取20 mL溶液于100 mL量筒中，10 000 r/min轉速下勻漿1 min。立刻讀取泡沫的總體積，記為V0,靜置30 min后再次讀取泡沫體積，記為V30。起泡性和起泡穩定性可通過公式(3)和(4)進行計算:

(3)

(4)

式中：V表示MP溶液的體積,mL；V0和V30分別表示均質后和靜置30 min以后讀取的體積,mL。

1.2.5 乳化液粒度和分布測定

乳化液的制備[17]：乳化液由MP、水、大豆油、不同添加量的茶粉和糯米粉制備(按質量比例，加入2%的MP，30%的大豆油，0.05%、0.10%、0.15%超微茶粉，0.30%、0.40%、0.50%糯米粉)。將MP與去離子水以1∶8的比例混合，并于室溫下用磁力攪拌器攪拌3 h，制成均勻的混合蛋白溶液，然后在4 ℃下保存24h以備使用。制備好的蛋白溶液中加入大豆油并用高速分散器在15 000 r/min條件下均質90 s(冰浴)制成預乳化液，再向預乳化液加入水和相應添加量的茶粉和糯米粉，在10 000 r/min條件下均質90 s(冰浴)。

乳化液粒徑的測定：通過 Masterizer2000激光粒度儀測定乳化液中油滴平均直徑的大小。分散相為水，采用濕法進樣模式，顆粒的折射率為1.436，吸收率為0.001。

1.2.6 乳化液微觀觀察

通過激光共聚焦顯微鏡觀察乳化液中蛋白質、油滴和多糖的分布情況。將80 μL 0.01%的尼羅紅染液(溶于異丙醇)、0.01%尼羅藍染液(溶于異丙醇)、卡爾科弗盧爾熒光增白劑以1∶1∶1的體積比與1 mL上述制備的乳化液均勻混合，并立即滴加在單凹載玻片上，蓋上蓋玻片進行觀察。樣品在3個激光束下被激發，尼羅紅在514 nm下被激發，尼羅藍在633 nm下被激發，熒光增白劑在405 nm下被激發。尼羅紅為油染料，尼羅藍為蛋白染料，卡爾科弗盧爾熒光增白劑為多糖染料[18]。

1.2.7 數據分析

實驗每組均采取3次重復，即n=3。采用軟件SPSS 24.0進行統計分析，方差分析采用ANOVA分析，多重比較采用Duncan法，P< 0.05表示差異顯著，用Origin軟件進行繪圖。試驗數據以“平均值±標準差(Mean±SD)”來表示。

2 結果與分析

2.1 肌原纖維蛋白乳化活性及乳化穩定性

乳化活性和乳化穩定性是用于評價蛋白質的乳化性能的關鍵指標。EAI是指單位質量蛋白質在促進油水互溶時，穩定油水界面的大小，ESI是指維持油水混合不分離時，蛋白質抵抗外界條件的能力。

圖1 茶粉和糯米粉對肌原纖維蛋白乳化活性和乳化穩定性的影響

由圖1可知，TP添加量在0%～0.10%時，MP乳化活性逐漸提高，但TP添加量過大，乳化活性反而下降；TP添加量為0.10%，乳化活性達到最大值(22.02±2.02)m2/g；MP乳化活性隨著GRF增加而不斷提升，GRF添加量為0.50%，MP的乳化活性達到最大值(23.15±1.50)m2/g，顯著高于空白對照組(P<0.05)，可能因為茶粉中的纖維在油水界面形成了較厚的界面膜，使得液滴之間產生空間位阻效應從而阻礙了液滴聚集[19]；而茶粉固體顆粒之間相互纏結形成的網絡結構在一定程度上增加了乳液的穩定性。但加入過量TP會包裹蛋白質表面活性基團，使乳化膜厚度增大，導致蛋白質乳化活力降低[4]。糯米粉的添加，顯著提高MP的網絡結構聚集性，從而使MP的乳化活性增大[20]。

MP乳化穩定性隨著TP(0%～0.05%)和GRF(0%～0.30%)添加量的增加而提高，TP添加量為0.05%，ESI達到最高值((89.6±4.02)%)，顯著高于空白對照組(P<0.05)；GRF添加量為0.30%，ESI達到最大值((80.1±3.6)%)，但與空白對照組沒有顯著差異(P>0.05)。可能是TP添加量適量上升，TP的纖維與MP相互結合，相互作用，形成二維網絡結構，阻礙脂肪在體系中擴散，使得乳化液的穩定性能夠提升[21]；隨著TP添加量增大，乳化液微粒間距離變小，蛋白質吸附層的黏著力減小，使得油滴聚集，穩定性降低。這可能是因為糯米粉的添加增加了體系的稠度，阻礙了油滴的聚集，提高了體系的乳化穩定性[4]。當添加量過多時，乳化液微粒粒度變大，使得油滴聚集，而且過多的淀粉易發生沉降而不能在溶液體系中起到作用[22]。

2.2 肌原纖維蛋白起泡性及起泡穩定性

由圖2可知，TP添加量為0%～0.10%時，MP的起泡性逐漸提高，最高值為(23.3±2.3)%，顯著高于對照組(P< 0.05)；當TP添加量持續增加，MP起泡性逐漸降低。蛋白質起泡性由蛋白質分子擴散、界面張力及疏水基團含量和分布等決定，TP添加量低，蛋白質與多糖相互作用阻止氣泡粗化，溶解度上升，起泡性增強；但茶粉添加量過多會包裹蛋白質，蛋白質和水界面上的蛋白量較少導致起泡性的降低。GRF添加量為0%～0.50%時，MP的起泡性不斷增加，最高值為(29.0±2.0)%，且與對照組有顯著差異(P< 0.05)。蛋白起泡性的提高可能是因為水研磨的糯米粉含有大量支鏈淀粉，其溶于水，能增加該MP的拉伸性，氣泡形成能力提高，糯米面粉中還含有一定量的蛋白質，也使得起泡性增加[23]。

圖2 茶粉和糯米粉對肌原纖維蛋白起泡性和起泡穩定性的影響

TP添加量為0.0%～0.05%時，MP起泡穩定性逐漸增加，最高值為(78.0±4.6)%，較其他添加組有顯著差異(P< 0.05)。泡沫的穩定性與蛋白的溶解性柔韌性等有關，起泡穩定性提高可能因為低添加量TP能改善蛋白的溶解性，但過多TP會降低蛋白之間的相互作用，使泡沫穩定性降低[24]。MP的起泡穩定性隨GRF添加量的增加而降低，與對照組有顯著差異(P<0.05)。可能是體系的黏度隨著粒子濃度的增加而增加，阻礙了均質過程中粒子的移動以及在油水界面的吸附，并且淀粉的聚集作用使得蛋白泡沫發生聚集和破裂，從而使起泡穩定性降低。

2.3 茶粉和糯米粉對肌原纖維蛋白乳化液粒徑的影響

由表1、表2和圖3、圖4可知，隨著TP添加量的增加乳化液粒度變小，TP添加量為0.15%時，液滴的粒度最小，此時平均粒度為(28.515 μm)。可能是由于多糖與蛋白質的協同作用，與蛋白質通過氫鍵作用和疏水作用在乳化體系中均勻分散開[25]。因為多糖減少了液滴和連續相之間的密度差異，能顯著改善連續相的黏度并使液滴的尺寸減小，使得乳化液更加穩定。也可能是茶粉中的多酚導致乳化液顆粒變小，WANG等[25]發現α -乳清蛋白與 EGCG 共價結合能提高其抗氧化能力并降低了乳化液的粒徑。GRF添加量為0%～0.40%時，液滴平均粒度隨GRF添加量的增加而減小，但GRF添加量為0.50%時，粒度反而增大，可能是由于GRF過多，導致連續相中的多糖過多使得液滴之間的間隙變小，發生絮凝和沉淀等現象，吸附在液滴表層的蛋白被排擠出來，液滴凝集而使粒度增大。

圖3 茶粉對乳化液粒度的影響

圖4 糯米粉對乳化液粒度的影響

表1 添加茶粉的乳化液液滴平均粒度

注：不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)。下同。

表2 添加糯米粉的乳化液液滴平均粒度

2.4 茶粉和糯米米粉對肌原纖維蛋白乳化液微觀狀態的影響

激光共聚焦顯微鏡是研究蛋白質和多糖實際分布和相互作用的重要工具，成像顯示了肌原纖維蛋白、大豆油、茶粉和糯米粉在乳化液中的分布及相互作用。由圖5、圖6可知，脂肪顆粒多呈現球狀或者近似球狀，MP包裹在這些大小不一的脂肪球表面，使得乳化體系更加穩定[27]。當乳化液中不添加茶粉和糯米粉時，乳化液的液滴分布密集混亂，大小不一，隨著茶粉和糯米粉的添加，液滴分散且顆粒均逐漸變小，但茶粉對乳化液液滴大小的影響力更大。可能是外源性添加物中的多糖物質與蛋白的協同作用，改善乳化液的黏度，吸附在油脂表面形成空間阻礙防止油滴聚集，從而使乳化體系穩定。由圖6可知，由于GRF中支鏈淀粉含量高，支鏈淀粉與肉類蛋白的相互作用，隨著糯米粉添加量的增加，絮凝開始增加。這可能歸因于未吸附的淀粉引起的絮凝作用，導致高添加量糯米粉增加了乳液粒度。

a-CK；b-0.05%TP；c-0.1%TP；d-0.15%TP

a-CK；b-0.30%GRF；c-0.40%GRF；d-0.50%GRF

3 結論

研究表明，適當TP和GRF的添加可以改善MP的乳化特性。與對照組相比，添加0.05%、0.10%的TP，能夠提高蛋白的乳化活性、乳化穩定性、起泡性和起泡穩定性，但加入量過高，反而會使蛋白的乳化活性和乳化穩定性都降低。而糯米粉中含有大量支鏈淀粉，提升了蛋白的持水能力和保油能力，易形成穩定的乳化體系，因此添加了GRF的蛋白乳化活性和起泡性都有所提高。從乳化液的微觀結構可看出，TP和GRF會使液滴的粒度減小，分布更加均勻，因此乳化體系更加穩定。總的來說，向肌原纖維蛋白中添加適量的TP和GRF，肌原纖維蛋白的乳化特性得到改善；因此，TP和GRF在乳化肉制品加工中有較好的應用前景，對生產新型功能性乳化性肉制品提供了較好的思路。