八月瓜果皮中常春藤皂苷元水解工藝優化及圖譜分析

石兵艷，李祥，劉毅，王蕓

(陜西科技大學 化學與化工學院, 農林技術推廣工程中心，陜西 西安, 710021)

常春藤皂苷元，又名(3β，4α)-3，23-二羥基齊墩果-12-烯-28-酸，分子式C30H4804，屬于齊墩果烷型五環三萜類化合物，是許多天然產物的活性成分[1]，廣泛存在于多種藥用植物中[2]。對于常春藤皂苷元的研究，只有從各種植物中對所有有效成分的提取、分離及純化得到常春藤皂苷元[3-4]、采用高效液色譜對其進行含量測定[5]，沒有研究者系統地對常春藤皂苷元工藝優化及含量測定進行研究。

八月瓜為木通科木通屬攀援式常年生藤本植物三葉木通的果實，是野生水果珍品[6-12]，SYUJIL等[13]在三葉木通的果皮中分離得到11個三萜皂苷，常春藤皂苷元是將皂苷成分水解后得到產物[14]。八月瓜果皮厚實，是提取皂苷元的優良來源。

本實驗以通過超聲輔助提取的皂苷粉末，進一步水浴水解為常春藤皂苷元的得率為指標，探尋水解常春藤皂苷元的最佳工藝條件，并在最優條件下用高效液相色譜法測定八月瓜果皮中常春藤皂苷元的含量。采用傅立葉紅外光譜對常春藤皂苷元主要官能團進行分析，且與常春藤皂苷元標準品進行對照分析；采用核磁共振對常春藤皂苷元結構進行分析，與文獻報道中的常春藤皂苷元核磁共振數據進行比較分析。本文將為陜西戶縣八月瓜基地的八月瓜果皮中常春藤皂苷元的提取、含量測定、以及結構分析提供參考價值。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

八月瓜果皮，由陜西戶縣八月瓜基地提供(2019.11)；HCl、H3PO4、乙醇、丙酮、正丁醇、氯仿、KBr(分析純)，乙腈、甲醇(色譜純)，國藥集團化學試劑有限公司；氘代二甲基亞砜dimethylsulfoxide-d6(D,99.96%)(色譜純)，麥克林；常春藤皂苷元標品，上海源葉生物科技有限公司。

BSA224S電子天平，賽多利斯科學儀器(北京)有限公司；H-H數顯恒溫水浴鍋，國華電器有限公司；R201L旋轉蒸發儀，上海申生科技有限公司；DGH-9145A電熱鼓風干燥箱，上海—恒科學儀器有限公司；KH-200KDB型高功率數控超聲波清洗器，昆山禾創超聲儀器有限公司；EClasscial 3100高效液相色譜儀，大連依利特分析儀器有限公司；傅立葉紅外光譜儀，德國布魯克Bruker公司；BrukeravanceⅢ-400MHz核磁共振波譜儀，德國布魯克Bruker公司。

1.2 方法

1.2.1 皂苷的提取

準確稱取5.00g八月瓜果皮粉末，按照料液比1∶15(g∶mL)加入75%乙醇溶液密封浸泡15 h，然后溫度68℃，功率160W，超聲萃取30 min，過濾收集上清液，將濾渣繼續用相同料液比的乙醇溶液萃取，提取2次。合并萃取液減壓蒸餾揮干，加入15 mL丙酮超聲萃取綠原酸20 min，去掉丙酮萃取液。將未溶于丙酮中提取物加入15 mL蒸餾水劇烈搖動至全溶，用水飽和的正丁醇溶液純化萃取3次，第1次和第2次用20 mL，第3次15 mL，合并水飽和的正丁醇萃取液濃縮揮干即為皂苷成品[15]，收集粉末備待用。

1.2.2 常春藤皂苷元的水解

準確稱取0.200 0 g 1.1.1項下提取的皂苷粉末，加入20 mL甲醇，一定體積分數的HCl 5 mL，在一定溫度下水浴回流水解，待室溫后向其加入10 mL蒸餾水，用氯仿純化萃取2次，第1次用15 mL，第2次10 mL，然后合并氯仿層，減壓蒸干得到常春藤皂苷元成品。

(1)

2 結果與分析

2.1 單因素對皂苷元水解的影響

2.1.1 HCl體積對皂苷元水解的影響

按照1.1.2中方法，分別加入HCl體積為5%、10%、15%、20%、25%、30%、36%對皂苷水解，探索HCl體積分數對皂苷元水解的影響。由圖1可知，HCl體積分數5%～25%，皂苷元得率呈現迅速遞增趨勢，而25%～36%呈現緩慢變化，因此皂苷元水解時HCl體積分數為25%為宜。當HCl體積分數過小時，水解不完全；當過大時，由于劇烈條件下苷元結構發生脫水、環合、雙鍵位移等變化，從而使得皂苷元得率降低[16]。

圖1 HCl體積分數對常春藤皂苷元水解的影響

2.1.2 溫度對皂苷元水解的影響

按照1.1.2中方法，加入25%HCl 5mL，分別在60、70、80、90、95 ℃條件下，探索溫度對皂苷元水解的影響。由圖2可知，溫度60～80 ℃時，呈現遞增趨勢，而80 ℃之后呈現遞減趨勢，因此溫度80 ℃為宜。皂苷元得率隨著水解溫度的升高而逐漸增大，可能是由于溶劑分子與皂苷分子運動劇烈，擴散增強所致；溫度過高，得率降低的原因：(1)溫度過高使得乙醇揮發，減少了萃取溶劑，(2)會導致部分苷元結構發生發轉變，生成其他物質[17]。

圖2 溫度對常春藤皂苷元水解的影響

2.1.3 水解時間對皂苷元水解的影響

按照1.1.2中方法，加入25%HCl 5 mL，溫度為80℃，分別水解0.5、1、1.5、2、2.5、3、3.5、4 h，探索時間對皂苷元水解的影響。由圖3可知，水解時間0.5～3.0 h時，皂苷元水解得率呈現逐漸遞增趨勢，而3.0～3.5 h時緩慢變化，呈現出持平，3.5 h以后遞減，考慮到時間、能量選擇3 h為宜。隨著水解時間加長，由于產生的熱效應，使得率增加，但是水解時間過長，會使得皂苷元結構破壞，導致皂苷元得率降低，或者可能存在副反應的進行，導致皂苷元的生成逐漸減少[18]。

圖3 時間對常春藤皂苷元水解的影響

2.2 響應面優化設計

在單因素實驗的基礎上，以HCl體積分數，水解溫度，水解時間3個因素為考察對象，每個因素選擇3個水平，以常春藤皂苷元的得率作為響應值，利用Design-Expert 10.0進行響應面分析，實驗因素與水平見表1。

表1 Box-Behnken實驗因素與水平

2.3 響應面設計及結果分析

2.3.1 回歸模型的建立及數據分析

根據實驗過程進行優化實驗。根據表1設計實驗，結果見表2。

表2 Box-Behnken實驗結果

各因素回歸擬合后，得到常春藤皂苷元水解的回歸方程為：Y=62.04+0.73A+3.17B-3.94C+5.63AB-1.98AC+2.14BC-5.98A2-5.88B2-7.92C2，二次回歸擬合后的回歸方程分析見表3。由表3實驗結果進行分析，可知水解時間、水解溫度和HCl體積分數3個因素對常春藤皂苷元的水解均為顯著影響因子，其中水解溫度和鹽酸體積分數為極顯著。該模型F=312.07，P=0.000 1(P<0.05)，表明模型極顯著，而失擬項的F=0.465 2，P>0.05失擬不顯著，校正決定系數R2=0.994 3，說明模型擬合程度良好，且誤差小。

表3 響應面實驗結果

注：P<0.01差異極顯著；P<0.05差異顯著。

2.3.2 響應面分析

圖4為根據回歸結果繪制的各因素關于常春藤皂苷元水解響應曲面圖和等高線圖，考察擬合響應面的形狀，分析各因素對皂苷水解得率的影響。圖a中三維響應面的形狀都與拋物線圖形相似，說明皂苷元水解得率的最大值出現在中間點處，此模型存在最大值的穩定點。圖b等高線中圓心都存在且位于其橢圓內部，交互作用顯著，且A和B等高線圖形狀更趨近與橢圓，交互作用極顯著。

2.3.3 響應面條件優化及驗證試驗

通過軟件分析，常春藤皂苷元水解的最佳工藝條件為水解時間3.133 h、溫度81.772℃、HCl體積分數23.828%。在此條件下，八月果果皮中提取到的皂苷元水解得率預測值可達63.156%。為了試驗方便操作，將工藝條件進行修正為水解時間3.2 h、溫度82℃、HCl體積分數24%。在此條件下驗證皂苷元水解試驗，得率均值為61.423%，與預測值 63.156%相近，說明響應面優化皂苷元水解的工藝條件可行。

2.4 常春藤皂苷元含量測定

2.4.1 色譜條件

色譜柱: Hypersil ODS C18色譜；檢測器：DAD3100二極管陣列檢測器；柱溫：27℃；流動相：乙腈-0.1%磷酸水溶液(體積比20∶80)；流速：1 mL/min，進樣量：20 μL。在此條件下對常春藤皂苷元對照品溶液和樣品溶液進行測定。在此色譜條件下分析常春藤皂苷元對照品和樣品，由圖5常春藤皂苷元標品的保留時間為22.71 min，圖6八月瓜果皮中常春藤皂苷元樣品保留時間為22.55 min，因此標品與樣品得到保留時間基本一致。

a、b-水解時間和溫度交互作用;c、d-水解時間和鹽酸體積交互作用;e、f-溫度和HCl體積分數交互作用

圖5 常春藤皂苷元標品的HPLC譜圖

圖6 八月瓜果皮中常春藤皂苷元HPLC譜圖

2.4.2 對照品溶液的配制

精確稱取常春藤皂苷元標準品10.00 mg，用V(甲醇)∶V(二氧甲烷)=5∶1溶解，然后定容于10 mL容量瓶，配成質量濃度為1 mg/mL常春藤皂苷元對照品溶液。

2.4.3 供試品溶液的配制

將2.3.3項下最優條件下水解得到常春藤皂苷元，用色譜甲醇溶解并定容于10 mL容量瓶。

2.4.4 線性關系的考察

精密移取常春藤皂苷元標準品溶液1.6，1.2，0.4，0.2和2 mL的容量瓶中，用色譜甲醇稀釋至刻度，得到成質量濃度分別為800、600、200、100 μg/mL的系列標準溶液，在上述色譜條件下測定，以對照品濃度(X)為橫坐標，峰面積(Y)為縱坐標進行線性回歸，計算得回歸方程為：Y=2 866.81X-60.451 6，R2=0.999 7，常春藤皂苷元濃度在0.1～1 mg/mL線性關系良好。

圖7 常春藤皂苷元的標準曲線

2.4.5 精密度試驗

精密吸取質量濃度為1 mg/mL的對照品溶液20 μL，按上述色譜條件連續進樣6次，記錄其峰面積，常春藤皂苷元峰面積的RSD=0.73%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表4 精密度試驗

2.4.6 重復性試驗

取已提取的皂苷粉末6份進行水解，采用2.4.3項下方法制備供試品溶液，分別置在上述色譜條件測定，記錄峰面積，計算含量。結果如表5所示，由表5可以看出，RSD=1.6%，表明此方法重現性良好。

表5 重復性試驗

2.4.7 穩定性試驗

取同一樣品溶液，每隔2 h 進樣20 μL，在上述色譜條件下測定6次，記錄其峰面積，計算得RSD=2.4%，所測得的RSD小于3%，說明供試品溶液在11 h內是穩定的，具體數據見表6。

表6 穩定性試驗

2.4.8 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的八月瓜皂苷粉末0.2 g，共6份，分別精密加入常春藤皂苷元對照品0.6 mL(濃度為1.00 mg/mL)，按照實驗方法制備，按上述色譜條件進行測定，并計算常春藤皂苷元的回收率，結果見表7，從表7中可以看出，加標回收率為97.06%，相對標準偏差為1.73%，表明所建立的方法能夠滿足實際樣品的分析要求。

表7 回收率實驗

2.4.9 樣品含量測定

取從八月瓜果皮中提取的皂苷粉末0.191 1g，按1.2.1的方法進行水解，按2.4.3方法配制供試品溶液進行測定，平行試驗3次，結果表明，八月瓜果皮中常春藤皂苷元的含量為11.559 0、11.516 5、11.594 8 mg/g，所以八月瓜果皮中常春藤皂苷元含量為(11.556 75±0.039 221) mg/g。

2.5 核磁共振分析

由圖8可知，在低場處δ12.07(1H，s，COOH)為羧基上的的氫信號，δ5.18(1H，brs，H-12)為12位上烯基上的氫信號，δ4.32(1H，s，-OH)為羥基上的氫信號，δ3.24(1H，m，H-3)是連接羥基碳上的氫信號，δ1.24(3H，s，H-27)為27位甲基上的氫信號，δ1.10(3H，s，H-30)為30位上甲基上的氫信號，δ0.88(3H，s，H-26)是26位甲基上的氫信號，δ0.71(3H，s，H-26)為26位甲基上的氫信號，δ0.54(3H，s，H-23)為23位甲基上的氫信號。

圖8 常春藤皂苷元的核磁共振HNMR譜

由圖9可知，在碳譜的低場處δ179.07(C-28)是羧基上的碳信號，δ121.95(C-12)和δ144.38(C-13)分別是12位、13位雙鍵上的碳信號，δ75.92(C-3)是連接—OH上的—CH的碳信號，δ64.30(C-23)是連接—OH上的—CH2的碳信號。在碳譜的高場區δ14.19(C-24)、δ15.02(C-25)、δ17.22(C-26)、δ26.50(C-27)、δ33.30(C-29)、δ23.03(C-30)是6個-CH3的碳信號。以及其他的飽和碳信號δ38.95(C-1)、δ27.07(C-2)、δ42.96(C-4)、δ46.42(C-5)、δ17.36(C-6)、δ31.78(C-7)、δ40.82(C-8)δ47.51(C-9)、δ37.83(C-10)、δ22.58(C-11)、δ41.83(C-14)、δ27.62(C-15)、δ26.9(C-16)、δ46.11(C-17)、δ41.24(C-18)、δ45.89(C-19)、δ30.09(C-20)、δ33.71(C-21)、δ32.13(C-22)。

圖9 常春藤皂苷元的核磁共振13CNMR譜

綜上所述，所提取的化合物與文獻[4，19-20]所報道的常春藤皂苷元核磁數據基本一致，其核磁1HNMR13CNMR數據與文獻報道比較見表8。

2.6 傅立葉紅外光譜分析

表8 常春藤皂苷元的核磁共振數據

圖10 常春藤皂苷元的紅外光譜

3 結論

本實驗以通過超聲輔助提取的皂苷粉末，進一步水浴水解為常春藤皂苷元的得率為指標，探索了HCl體積、水解時間、溫度各影響因素，并根據單因素試驗結果設計了響應面實驗，確定了水解常春藤皂苷元的最佳工藝條件，并在最優條件下建立八月瓜果皮中常春藤皂苷元的含量測定方法，高于文獻匯報的陜西常春藤皂苷元含量5.26 mg/g。采用傅立葉紅外光譜對常春藤皂苷元主要官能團進行分析；采用核磁共振對常春藤皂苷元結構進行分析，與文獻報道中的常春藤皂苷元核磁共振數據基本一致[4，19-20]。其主要結論如下：

(1)通過單因素與響應面分析來優化水解條件。探討了HCl體積分數、溫度和水解時間對常春藤皂苷元得率的影響。得到最佳的水解條件：水解時間3.2 h、溫度82℃、HCl體積分數24%，在該條件下常春藤皂苷元得率為61.423%，常春藤皂苷元水解得率高，接近預期結果。

(2)以乙腈-0.1%磷酸(體積比20∶80)溶液為流動相，檢測波長為210 nm，建立了高效液相色譜法測定八月瓜果皮中常春藤皂苷元的方法。結果表明，常春藤皂苷元在0.1～1 mg/mL具有線性關系，回歸方程:Y=2 866.81X-60.451 6，R2=0.999 7。精密度試驗RSD 為0.73%，穩定性試驗RSD為2.4%，重復性試驗RSD 為1.6%，加標回收率為97.0%，其RSD為1.73%。樣品中常春藤皂苷元含量為(11.556 75±0.039 221)mg/g，此方法操作準確、可靠，可以作為常春藤皂苷元含量測定的方法。

(3)采用傅立葉紅外光譜對常春藤皂苷元主要官能團分析，皂苷元特有的5個主要特征吸收峰3 442、2 943、1 693、1 461、1 043 cm-1都存在，且與常春藤皂苷元標準品的官能團基本吻合。

(4)采用核磁共振對常春藤皂苷元結構進行分析，常春藤皂苷元的核磁共振數據與報道中的基本一致。