基于視頻與數(shù)字圖像比色的甘薯多酚氧化酶活力檢測(cè)

陳嘉，高麗，葉發(fā)銀，劉嘉，趙國(guó)華,3,4*

1(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)2(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院食品加工研究所，貴州 貴陽(yáng)，550006)3(重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心，重慶，400715)4(重慶市農(nóng)產(chǎn)品加工技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，重慶，400715)

甘薯又稱(chēng)番薯、紅薯、紅苕等，在我國(guó)至今已有400多年的種植歷史[1]。世界糧農(nóng)組織顯示，2017年我國(guó)甘薯種植面積約為3.37×104km2，約占世界甘薯種植面積的36.5%；產(chǎn)量為7.2×107t，約占世界總產(chǎn)量的63.6%。甘薯是重要的糧、菜、飼兼用作物，營(yíng)養(yǎng)豐富，含有豐富的膳食纖維、糖類(lèi)、維生素和礦物質(zhì)，有提高免疫力、預(yù)防骨質(zhì)疏松、防癌抗癌、防止動(dòng)脈硬化等作用[2]，是營(yíng)養(yǎng)均衡的保健食品。隨著居民生活水平的提高和營(yíng)養(yǎng)健康意識(shí)的增加，甘薯用于營(yíng)養(yǎng)食品、工業(yè)原料、飼料及醫(yī)藥的比例不斷增加。

甘薯在鮮切或加工過(guò)程中受到機(jī)械傷害后，傷口處極易發(fā)生褐變，進(jìn)而導(dǎo)致?tīng)I(yíng)養(yǎng)及加工價(jià)值降低。鮮切甘薯的褐變主要是由甘薯中的多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)催化綠原酸引起的[3]。PPO是廣泛存在于植物體中的一種含銅金屬酶類(lèi)，在食品生產(chǎn)加工過(guò)程中極易催化多酚類(lèi)物質(zhì)氧化生成黑色素，是甘薯育種、貯藏、保鮮及深加工過(guò)程中重點(diǎn)關(guān)注與檢測(cè)的對(duì)象。PPO活力檢測(cè)常用的方法是消光值法[4]，測(cè)定前需要在低溫條件下(4 ℃)提取粗酶液、離心并繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，操作繁瑣、費(fèi)時(shí)費(fèi)力，不能滿(mǎn)足大樣本容量檢測(cè)需求。因此，建立一種快速便捷的甘薯PPO活力快速檢測(cè)方法意義重大。

數(shù)字圖像比色法(digital image colorimetry)是一種便捷的新型檢測(cè)技術(shù)，主要是利用朗伯-比爾定律，即有色溶液的顏色深度(色度)與溶液濃度成正比，將數(shù)字圖像與化學(xué)顯色檢驗(yàn)結(jié)合起來(lái)的定性定量分析方法[5]。目前，數(shù)字圖像比色法已應(yīng)用于生物醫(yī)學(xué)[6-8]、化學(xué)[9-10]、農(nóng)業(yè)及環(huán)境[11-15]等多個(gè)領(lǐng)域中。在食品工業(yè)中，數(shù)字圖像比色可用于食品成分分析[16-17]、品質(zhì)檢測(cè)[18-19]、食品摻假[20]、酶活檢測(cè)[21]及食品安全監(jiān)控[22-24]。智能手機(jī)可以攝錄一段時(shí)間內(nèi)食品的顏色變化，利用數(shù)字圖像比色法分析被測(cè)樣品顏色的變化規(guī)律，從而對(duì)食品品質(zhì)進(jìn)行快速分析。有研究表明,甘薯塊根顏色與甘薯圖像的RGB值有相關(guān)性[25]，但基于數(shù)字圖像比色法的甘薯PPO活力快速檢測(cè)方法研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)以不同品系的甘薯為研究對(duì)象，通過(guò)提取甘薯切片在一定時(shí)間內(nèi)的圖像信息，建立甘薯PPO活力的快速檢測(cè)模型，以期為甘薯品質(zhì)分析、種質(zhì)篩選及企業(yè)生產(chǎn)提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

甘薯由重慶市甘薯工程技術(shù)研究中心提供，選取大小一致、表面光滑、無(wú)病蟲(chóng)害的不同品系甘薯，共計(jì)90份樣品。將甘薯表面泥土清洗干凈，室溫下晾干表面水分并編號(hào)，儲(chǔ)存于(15±2)℃?zhèn)溆谩?/p>

Na2HPO4、NaH2PO4、冰乙酸、無(wú)水乙酸鈉(分析純)，成都市科龍化工試劑廠；交聯(lián)聚乙烯吡咯烷酮(crosslinking polyvingypyrrolidone， PVPP)，北京拜爾迪生物技術(shù)有限公司；兒茶酚(化學(xué)純)，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)上海化學(xué)試劑公司。

1.2 儀器與設(shè)備

5810 R冷凍離心機(jī)，德國(guó)Eppendorf公司；AQ-180E粉碎機(jī)，慈溪市耐歐電器有限公司；iPhone 6s智能手機(jī)，美國(guó)蘋(píng)果公司；UV-2450紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)，日本島津公司。

拍照裝置：自制正方體木箱，箱內(nèi)背景為黑色毛氈，頂部開(kāi)5 mm圓孔用于手機(jī)拍照，采用25 W白色日光燈作為光源(圖1)。

圖1 拍照裝置圖

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 甘薯切片圖像信息采集

甘薯樣品從中心橫向一切兩半，一半用于甘薯PPO活力測(cè)定，另一半進(jìn)行切片，切片厚度約2 mm，用于手機(jī)拍照及圖像信息(RGB值)采集。將甘薯切片后立即放入拍照裝置中，采用手機(jī)攝像功能記錄甘薯切片的褐變過(guò)程，攝像時(shí)長(zhǎng)為180 s，攝像參數(shù)設(shè)置為720p HD, 30 fps，文件存貯為MOV格式。

圖像信息采用Matlab 2016a(美國(guó)MathWorks公司)軟件自編程序獲得，具體步驟為：讀取采集到的視頻文件，每間隔10 s截取一幀視頻圖像，對(duì)圖像進(jìn)行二值化(image binarization)處理及圖像分割，獲得甘薯切片輪廓區(qū)域內(nèi)圖像的紅(R)、綠(G)、藍(lán)(B)通道均值，即可得到該樣品在180 s內(nèi)RGB值的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)。每個(gè)樣品重復(fù)3次并取平均值。

1.3.2 PPO活力測(cè)定

粗酶液提取參照王禮群等[26]的方法，隨機(jī)稱(chēng)取2.0 g樣品，加入5 mL 0.1 mol/L的磷酸緩沖液(pH 6.8，含有0.1 mol/L PVPP)，研成勻漿后在4 ℃離心15 min(12 000 r/min)，上清液即為PPO粗酶液。

PPO活力的測(cè)定參照PIZZOCARO等[4]的方法稍作修改，取2.5 mL醋酸緩沖液(pH 4.4，醋酸濃度0.1 mol/L)，加入1 mL 0.2 g/L兒茶酚底物，再加入0.5 mL粗酶液后充分搖勻，測(cè)量3 min內(nèi)吸光度在410 nm波長(zhǎng)處的變化。在測(cè)定條件下，每分鐘吸光度變化0.01即為1個(gè)酶活力單位(U)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.3.3 模型的建立及驗(yàn)證

模型的建立及數(shù)據(jù)分析采用Matlab 2016a軟件。所建模型的優(yōu)劣采用擬合確定系數(shù)(coefficient of determination，R2)來(lái)判定，R2的意義是一個(gè)變量的變化有百分之多少可以由另一個(gè)變量來(lái)解釋?zhuān)溆?jì)算如公式(1)所示：

(1)

同時(shí)，為了評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)能力，需要采用外部驗(yàn)證集樣品對(duì)模型進(jìn)行驗(yàn)證。通常采用預(yù)測(cè)均方根誤差(root mean square error of prediction，RMSEP)、預(yù)測(cè)相關(guān)系數(shù)(correlation coefficient of prediction，rp)、預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)差(square error prediction SEP)、偏差(bias)以及標(biāo)準(zhǔn)偏差比(standard deviation ratio，SDR)來(lái)評(píng)價(jià)模型的預(yù)測(cè)能力。RMSEP即模型對(duì)樣品預(yù)測(cè)的均方根誤差，主要用于評(píng)價(jià)模型對(duì)外部樣本的預(yù)測(cè)能力，其值越小表明模型對(duì)外部樣品的預(yù)測(cè)能力越高，反之則預(yù)測(cè)能力越低。rp用于衡量樣本的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)程度，其值越接近于1，則表明預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)程度越好。SEP為預(yù)測(cè)標(biāo)準(zhǔn)偏差，對(duì)未知樣本進(jìn)行預(yù)測(cè)時(shí)，SEP值越小越好；bias為驗(yàn)證集各樣品的預(yù)測(cè)偏差的平均值，bias用于衡量模型的預(yù)測(cè)系統(tǒng)誤差，越小越好。SDR用來(lái)評(píng)價(jià)模型的穩(wěn)定性和預(yù)測(cè)能力，一般認(rèn)為，SDR<1表示無(wú)預(yù)測(cè)能力，SDR=1.5表明模型有一定的區(qū)分力，SDR=2表明有較好的預(yù)測(cè)能力，SDR>3則表示模型有很強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力[27]。RMSEP、rp、SEP、bias和SDR的計(jì)算公式(2)、(3)、(4)、(5)和(6)如下：

(2)

(3)

(4)

(5)

(6)

2 結(jié)果與分析

2.1 PPO活力測(cè)定結(jié)果與樣品集劃分

實(shí)驗(yàn)樣品共測(cè)定了90份甘薯樣品的PPO活力，采用含量梯度法[27]從90份樣品中挑選72份樣品作為校正集，用以構(gòu)建預(yù)測(cè)模型，其余18份作為外部驗(yàn)證集，以對(duì)模型的預(yù)測(cè)能力進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表1所示。

表1 甘薯樣品PPO活力測(cè)定結(jié)果及樣品集劃分

注：顯著差異性分析采用最小顯著差數(shù)法，表中相同小寫(xiě)英文字母表示無(wú)顯著差異(P>0.05)。

由表1可知，甘薯樣品中PPO活力最小值為6.09 U，與王禮群等[26]報(bào)道的結(jié)果近似，最大值為44.53 U，與郁志芳等[3]報(bào)道的結(jié)果接近；樣品集PPO活力6.09～44.53 U，表明實(shí)驗(yàn)材料涵蓋的范圍較廣，有利于后期模型的擬合。顯著性分析結(jié)果顯示，原始樣品集與校正集和驗(yàn)證集之間沒(méi)有顯著差異，說(shuō)明樣品集劃分合理；通過(guò)含量梯度法劃分校正集與驗(yàn)證集后，校正集樣品PPO活力范圍大于驗(yàn)證樣品集，有利于建立高精度的預(yù)測(cè)模型。

2.2 甘薯切片圖像RGB值隨放置時(shí)間的變化

由于PPO的存在，甘薯鮮切后持續(xù)暴露于空氣中，塊根中的多酚類(lèi)物質(zhì)會(huì)不斷氧化變色，切面顏色持續(xù)褐變加深。由酶活力的定義可知，切口處顏色變深的快慢與PPO活力有關(guān)。為詳細(xì)了解甘薯切片圖像RGB值隨時(shí)間變化的情況，選擇樣品中PPO活力較低和較高的2個(gè)樣品，以時(shí)間為橫軸，以切片的RGB顏色值為縱軸作圖，結(jié)果如圖2所示(圖2-a為低PPO活力樣品，PPO活力10.84 U；圖2-b為高PPO活力樣品，PPO活力32.13 U)。甘薯切片顏色的直觀變化如圖3所示。

a-低PPO活力樣品;b-高PPO活力樣品

a-低PPO活力樣品;b-高PPO活力樣品;下標(biāo)1 ～ 4分別代表0、60、120、180 s時(shí)的切片圖像

從圖2可以看出，低PPO活力樣品(圖2-a)切片圖像的R、G、B值在0～180 s略有下降，但變化不大，即褐變程度不大。高PPO活力樣品(圖2-b)切片圖像的R、G、B值在前60 s內(nèi)快速下降，在120 s后變化趨于平直。這可能是因?yàn)樵诟适砬衅c空氣剛剛接觸時(shí)，由于PPO活力較高，底物與氧氣快速反應(yīng)使得切片快速褐變；60 s以后，隨著底物的不斷消耗，褐變速度逐漸減緩；在120 s后，隨著底物的進(jìn)一步消耗，切面附近的酶促褐變趨于停止。

由圖3可以直觀地看出，由于品種的不同，低PPO活力樣品的顏色偏紅(圖3-a)，因此其圖像RGB值的R值最高，G值次之，B值最低(圖2-a)；高PPO活力樣品切片總體偏黃(圖3-b)，因此其圖像的R值和G值總體相當(dāng)(圖2-b)，即紅光和綠光混合而呈現(xiàn)為黃色。由于甘薯中含有β-胡蘿卜素等橘黃色天然色素，當(dāng)白光照射至甘薯切片時(shí)，β-胡蘿卜素等吸收光線中藍(lán)綠色光的同時(shí)反射紅黃色光，從而使甘薯塊根切片呈現(xiàn)橘黃或橘紅色，手機(jī)鏡頭拍攝到的實(shí)際是吸收光的補(bǔ)色，因此在圖2中B值總處于最低。在空氣中放置一段時(shí)間，低PPO活力樣品邊緣略微褐變，但總體變化不明顯，表現(xiàn)為圖2-a中RGB值總體下降平緩；高PPO活力樣品褐變明顯，特別是圖3-b1到圖3-b2，樣品的褐變程度明顯增加，與圖2-b中0～60 s RGB值快速下降對(duì)應(yīng)。

甘薯切片發(fā)生褐變，其圖像的RGB值會(huì)不斷變化(圖2)，同時(shí)甘薯中含有β-胡蘿卜素等天然色素，切片本身的顏色(圖3)也會(huì)對(duì)圖像的RGB值產(chǎn)生疊加與影響。因此直接使用切片的RGB值評(píng)價(jià)甘薯PPO活力會(huì)存在很大誤差。CHOODUM等[28]的研究發(fā)現(xiàn)，使用數(shù)字圖像比色法建立預(yù)測(cè)模型時(shí)，采用反應(yīng)前后體系RGB差值作為自變量，模型預(yù)測(cè)能力不會(huì)受到體系本身顏色的影響。甘薯酶促褐變程度受到PPO活力與底物濃度的雙重影響，由圖2可以看出，甘薯鮮切初期酶促褐變的底物充足，圖像RGB值的變化可以充分反映PPO的活力，而超過(guò)60 s后，由于底物消耗褐變速度逐漸下降。綜合考慮樣品PPO活力高低情況，在后續(xù)的研究中，選擇 30 s作為提取甘薯切片圖像RGB變化特征的時(shí)間點(diǎn)，將切片圖像0～30 s的R、G、B值的變化量記為ΔR、ΔG和ΔB。

2.3 ΔR、ΔG和ΔB與PPO活力的相關(guān)性

分別以ΔR、ΔG和ΔB為橫軸，以樣品PPO活力為縱軸作圖，以考察0～30 s切片圖像RGB的變化量與PPO活性的關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)圖4。同時(shí)，分析ΔR、ΔG和ΔB與PPO活力間的相關(guān)性，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 甘薯切片PPO活力與數(shù)字圖像RBG值的相關(guān)性分析

注：**表示在0.01水平上顯著相關(guān)。

a-ΔR；b-ΔG；c-ΔB

從圖4可以直觀地看出，ΔR、ΔG和ΔB均與PPO活力呈正相關(guān)。圖4-a中，數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布較為集中且有較強(qiáng)的規(guī)律性，表明ΔR與PPO活力有較高的相關(guān)性，相關(guān)性分析結(jié)果顯示(表2)，ΔR值與PPO活力間呈極強(qiáng)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.946。圖4-b和圖4-c中，數(shù)據(jù)點(diǎn)的分布較為分散，但整體上隨著ΔG或ΔB的增加PPO活力也不斷提高，相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ΔG、ΔB與PPO活力呈中等強(qiáng)度正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別為0.799和0.620。

2.4 甘薯PPO活力預(yù)測(cè)模型的建立及驗(yàn)證

分別采用ΔR、ΔG、ΔB及其組合為自變量，建立線性回歸模型(分別記為模型1～7)，模型的優(yōu)劣采用擬合決定系數(shù)R2評(píng)價(jià)，結(jié)果如表3所示。

表3 甘薯PPO活力預(yù)測(cè)模型

由表3可知，模型1、4、5、7的R2較為接近，分別為0.894，0.903，0.895和0.903，并且所有模型中均包含變量ΔR，這是因?yàn)棣與PPO活力呈極強(qiáng)正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.946。僅用ΔR對(duì)PPO活力進(jìn)行擬合，模型1的R2即可達(dá)到0.894，同時(shí)，ΔG和ΔB均與PPO有中等強(qiáng)度正相關(guān)，在模型1的基礎(chǔ)上引入ΔG和(或)ΔB，模型的R2均有所提高。

為了進(jìn)一步比較模型1、4、5、7的預(yù)測(cè)能力，采用驗(yàn)證集樣品對(duì)以上4個(gè)模型進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果如表4所示。

表4 模型的驗(yàn)證結(jié)果

可以看出，4種模型的rp均大于0.95，說(shuō)明對(duì)于驗(yàn)證集樣品，4種模型預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)程度均較高；SDR均大于3，說(shuō)明模型均有較強(qiáng)的預(yù)測(cè)能力。模型7的RMSEP=2.079，低于其他模型，SEP與bias最小，說(shuō)明預(yù)測(cè)的標(biāo)準(zhǔn)偏差與系統(tǒng)誤差最小，而SDR=3.459，高于其他模型，說(shuō)明模型7對(duì)外部樣本的預(yù)測(cè)能力最強(qiáng)，因此選擇模型7為甘薯PPO活力最優(yōu)預(yù)測(cè)模型，模型的表達(dá)式為：

甘薯PPO活力(U)=0.557+5.260×ΔR+0.850×ΔG-0.034×ΔB

圖5為最優(yōu)模型預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值的關(guān)系圖。模型的預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值比較均勻的分布在趨勢(shì)線周?chē)瑹o(wú)明顯的聚集或偏移趨勢(shì)，說(shuō)明模型的預(yù)測(cè)值和實(shí)測(cè)值之間的相關(guān)程度較高。

圖5 預(yù)測(cè)值與實(shí)測(cè)值關(guān)系圖

3 結(jié)論

PPO是引起鮮切甘薯褐變的主要原因，PPO活力是甘薯貯藏保鮮及深加工中經(jīng)常測(cè)定的指標(biāo)。常用的PPO活力檢測(cè)方法操作較為繁瑣，建立一種快速、簡(jiǎn)便且不需要太多化學(xué)前處理的檢測(cè)方法意義重大。實(shí)驗(yàn)采用手機(jī)拍攝甘薯切片的褐變視頻，采用Matlab軟件自編程序提取視頻180 s內(nèi)圖像信息的動(dòng)態(tài)變化數(shù)據(jù)，并建立了PPO活力預(yù)測(cè)模型。研究發(fā)現(xiàn)，0～30 s圖像R值的變化量(ΔR)與PPO活力呈極強(qiáng)的正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)0.946)，G值與B值的變化量(ΔG和ΔB)與PPO活力呈中等強(qiáng)度正相關(guān)(相關(guān)系數(shù)分別為0.799和0.620)。采用多元線性回歸模型對(duì)ΔR、ΔG、ΔB與PPO活力間的關(guān)系進(jìn)行擬合，所得最優(yōu)模型的R2達(dá)到0.903；對(duì)驗(yàn)證集樣品進(jìn)行預(yù)測(cè)，最優(yōu)模型的rp、RMSEP和SDR分別為0.956，2.079和3.459。相比于常用的PPO活力檢測(cè)方法，基于視頻信息的甘薯PPO活力檢測(cè)方法，在模型建立之后，樣品無(wú)需前處理，操作簡(jiǎn)便快捷，為數(shù)字圖像比色法在甘薯品質(zhì)檢測(cè)中的應(yīng)用提供了一種新的思路與方法。需要說(shuō)明的是，在實(shí)際應(yīng)用中由于甘薯的品種、產(chǎn)地等不同，所得結(jié)果會(huì)產(chǎn)生一定誤差，需不斷增加校正集樣品數(shù)量并更新模型，以獲得更為可靠的預(yù)測(cè)結(jié)果。在后續(xù)的研究中，還可以考慮采用近紅外光譜等方法建立無(wú)損檢測(cè)模型，更為快速的檢測(cè)甘薯PPO活力。