高效液相色譜法測定魚露中章魚胺和牛磺酸

陳麗麗，白春清，袁美蘭，江勇，趙利*

1(江西科技師范大學 生命科學學院，江西 南昌，330013)2(國家淡水魚加工技術研發分中心，江西 南昌，330013)

眾所周知，生物源單胺章魚胺(octpamine，OA)在各種無脊椎動物中扮演著神經激素、神經調節劑和神經遞質的角色，在多數無脊椎動物的神經和非神經組織中都發現了它，其功能相當于脊椎動物交感神經的腎上腺素能受體，OA調節了目前研究的無脊椎動物幾乎所有的生理過程[1]，包括周圍器官、感覺器官和中樞神經系統內的過程。OA也是人體內源性的生物胺，在人體內有重要的生理作用[2]。研究發現，OA是一種天然的β3-腎上腺素能受體激動劑[3]，它可作為食品和保健食品的原料或者臨床藥物的輔助制劑，也可以單獨或與其它材料聯合使用，用于減肥和治療糖尿病[4-5]。在無脊椎動物的各種組織中都發現OA的存在[6]，且含量較高。

魚露中章魚胺的含量相對豐富，約為0.06 %～0.1 %[7]，是天然章魚胺的主要來源。章魚胺含量測定的方法有光纖LED誘導熒光毛細管電泳檢測法、放射酶學測定法、柱前衍生-RP-HPLC方法、毛細管氣相色譜-負化學電離質譜法[8-13]等。榮艷萍[7]等采用高效液相色譜法測得鳀魚魚露和七星魚魚露中章魚胺含量分別為1055 μg/mL和566 μg/mL。曲映紅[14]以智利外海莖柔魚內臟為原料發酵魚露，測得魚露中的章魚胺含量高達4.5 mg/mL。

牛磺酸(taurine)，又稱β-氨基乙磺酸，因為最早是從牛黃中分離出來的，所以取名牛磺酸。是一種存在于動物體內的非蛋白質結構的特殊游離氨基酸，是一種半必需氨基酸，在動物體內的各個組織和器官中含量最為豐富[15]，對于維持體內組織細胞的穩定具有重要的意義。另外，還有少量的牛磺酸以小肽和乙酰化的形式存在，這些短肽在體內同樣有重要的作用。合成牛磺酸的半胱氨酸亞硫酸羧酶(CSAD)在人體內活性較低，所以人體需要攝取食物中的牛磺酸來滿足自身的需要。牛磺酸作為一種神經遞質、滲透調節劑和抗氧化劑等作用已被研究。研究表明，牛磺酸有調節滲透壓、抗氧化[16]、神經傳導、免疫等作用，是良好的護肝劑，具有增強視力、促進大腦發育、解除疲勞的作用，還具有一定的抗腫瘤活性[17-21]。同時，牛磺酸還被作為強化營養的食品添加劑添加入嬰幼兒奶粉中[22]。隨著人們對牛磺酸功能的不斷探索和認識，天然牛磺酸的市場潛力不斷擴大。

水產品中牛磺酸的含量十分豐富，尤其是在軟體動物中[23]。牛磺酸也是魚露的重要成分。目前國內外測定牛磺酸的方法有中和滴定法、高壓液相色譜法、氨基酸自動分析法、薄層層析法和分光光度計法等[24-25]。高效液相色譜法有樣品處理簡單、方法精確度、靈敏度高和測定速度快等特點，被廣泛應用于測定牛磺酸。

牛磺酸和章魚胺對人體來說都是必不可少的，而魚露中同時含有章魚胺和牛磺酸，因此本研究在于尋找一種方便、快捷的方法同時檢測魚露中的章魚胺和牛磺酸的含量。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

草魚內臟：從南昌市鄱陽湖農牧漁產業發展股份有限公司取回，置于-20℃冰柜凍存，使用前在10℃以下用流水解凍；鰻魚內臟：江西東海食品有限公司，-20℃凍存，使用前在10℃以下用流水解凍；實驗室利用魚內臟自行發酵制備魚露，所有魚露樣品4℃保存；醬油種曲：北京食品釀造研究所，4℃保存；NaH2PO4(分析純)，天津市大茂化學試劑廠；乙腈(色譜純)，2，4-二硝基氟苯(分析純)，章魚胺鹽酸鹽(≥98%)，牛磺酸(≥99%)，美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

Agilent 1260高效液相色譜儀,美國安捷倫；KQ-250DE型數控超聲波清洗器,昆山市超聲儀器有限公司；HH-1數顯恒溫水浴鍋,常州市萬豐儀器制造有限公司；0.45 μm水系微孔濾膜，0.22 μm有機相微孔濾膜 上海興亞凈化材料廠；DELTA- 320型精密pH計 METTLER TOLEDO公司；UT-12型電熱鼓風干燥箱,上海一恒科學儀器有限公司；HA-300MD型高壓滅菌鍋,Hirayama Manufacturing Corporation；TDL-5A型臺式低速離心機,上海菲恰爾分析儀器有限公司；SPX-100B-Z型生化培養箱,上海博訊實業有限公司醫療設備廠。

1.3 實驗方法

1.3.1 魚露的制備

參照周敏等[26]的方法，將草魚和鰻魚的內臟經分段加鹽、低鹽速釀的方法發酵制備魚露。取發酵第0、5、10、15、20、25、30天的樣品以及成品魚露為樣品，所有樣品4 ℃冰箱保存，進行章魚胺和牛磺酸含量的測定。

1.3.2 檢測分析

1.3.2.1 色譜條件

色譜柱：SunFireTMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)，柱溫35 ℃，流動相：乙腈-0.02 mol/L的NaH2PO4溶液(40∶60)，pH 7.5，流速為1.0 mol/min，紫外檢測波長360 nm，進樣量10 μL。

1.3.2.2 標準溶液的制備

(1)取25 mL棕色容量瓶，加入稱取的0.025 0 g牛磺酸和章魚胺標準品，用超純水溶解并定容，制備濃度為1 mg/mL的牛磺酸、章魚胺標準混合液。

(2)將1 mL上述標準混合液置于10 mL的容量瓶中，加入1.5 mL濃度為10 mol/L的氨水溶液，再加入0.65 %的2.4-二硝基氟苯乙腈溶液2 mL，混勻室溫靜置5 min。在57 ℃水浴加熱10 min，加入pH 7.5的磷酸鹽溶液定容，得到0.1 mg/mL的牛磺酸、章魚胺衍生標準混合溶液。將0.1 mg/mL的混合標準溶液，用pH7.5的磷酸鹽溶液稀釋成0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.08 mg/mL的混合標準溶液，用微孔濾膜過濾，進樣10 μL，用HPLC進行檢測。以混合物衍生標準溶液的濃度為橫坐標，以峰面積為縱坐標，進行線性回歸。本試驗所有樣品放4 ℃冰箱冷藏保存，有效期7 d。

1.3.2.3 樣品的制備

稱0.0100 g的樣品，用超純水溶于10 mL的容量瓶中混勻并定容。吸取此樣品溶液0.1 mL于10的容量瓶中，同1.3.2.2(2)進行衍生處理。

1.3.3 數據分析與作圖

試驗結果采用平均值±標準差(mean±SD)表示，每個試驗平行4次。采用SPSS對試驗數據進行差異性分析(ANOVA)檢查各個結果的顯著性差異，同時采用Excel 2010進行數據處理。

2 結果與分析

2.1 混合物衍生標準溶液中牛磺酸及章魚胺高效液相色譜保留時間

取1.3.2.2(2)中的混合物衍生標準溶液，按照上述色譜條件進行液相測定，得到章魚胺及牛磺酸衍生物色譜圖如圖1所示，可以確定標準品衍生物的出峰時間。牛磺酸衍生物的出峰時間是在1.89 min，章魚胺衍生物的出峰時間是在7.72 min。圖2為樣品溶液中章魚胺和牛磺酸衍生物色譜圖，對樣品用同樣的方法衍生處理、測定，色譜圖中相同時間點的出峰物質即為樣品中的章魚胺和牛磺酸衍生物，由此計算樣品中章魚胺和牛磺酸的含量。

a-牛磺酸;b-章魚胺

圖2 樣品溶液中章魚胺和牛磺酸衍生物色譜圖

2.2 牛磺酸和章魚胺衍生的標準混合溶液線性關系

按照色譜條件對牛磺酸和章魚胺衍生的標準混合溶液進行測定，將測得的峰面積與樣品濃度繪制標準曲線。章魚胺的質量濃度在0.01～0.1 mg/mL時與峰面積呈良好的關系，線性回歸方程為y=219 812x-1 428.9，相關系數R2=0.992 6；牛磺酸的質量濃度在0.03～0.1 mg/mL時與峰面積呈良好的關系，線性回歸方程為y=23 860x-202.42，相關系數R2=0.992 9。

2.3 穩定性試驗

吸取樣品，按上述色譜條件分別在衍生后放置0、2、4、6、8、12、24 h進樣，測定其峰面積的值，結果如表1所示。樣品在放置的時間段內，其測得的峰面積變化越小，說明樣品越穩定，試驗結果準確。章魚胺峰面積RSD=0.053 %(n=6)，牛磺酸峰面積RSD=0.027 %(n=6)。結果分析可知，樣品衍生后在24 h內基本穩定。

表1 穩定性試驗(n=6)

2.4 精密度試驗

精密吸取衍生后的標準混合溶液，按照色譜條件，連續進樣6次，記錄峰面積的值，結果如表2所示。同種樣品按照固定的條件進樣檢測，得到的結果越接近，說明儀器的精密度越好，測得的試驗結果越精準。章魚胺峰面積平均值為23 566，RSD=0.035%(n=6)；牛磺酸峰面積平均值為2 154.14，RSD=0.012%(n=6)，表明儀器精密度良好。

表2 精密度試驗(n=6)

2.5 重復性試驗

精密稱取同樣的樣品六份，按照1.3進行樣品制備、衍生，相同的色譜條件進行檢測。試驗結果如表3所示。同樣的樣品進行衍生處理后，如果測得出峰面積相差不大，說明本試驗在操作過程中出現的誤差比較小，試驗結果更加準確。樣品中章魚胺的峰面積平均值為33 143，RSD=1.339 %(n=6)；牛磺酸峰面積平均值669.64，RSD =0.013 %(n=6)。

表3 重復性試驗(n=6)

2.6 加標回收率試驗

吸取已知含量的樣品溶液0.2 mL，再向其中加入0.8 mL的標準混合溶液進行衍生化處理，在上述色譜條件下進行檢測并計算回收率， 重復測定5次，加標回收率結果如表4所示，章魚胺的平均回收率為99.23%，RSD =0.044%(n=5)；牛磺酸的平均回收率為97.67%，RSD =0.038%(n=5)。使用高效液相色譜法測定魚露中章魚胺和牛磺酸的含量具有很好的適用性和可行性。

表4 加標回收率實驗結果

2.7 魚露樣品中章魚胺和牛磺酸含量的測定

取發酵過程中第0、5、10、15、20、25、30天以及第34 d制備的成品魚露，測定章魚胺和牛磺酸的含量。發酵過程中，章魚胺含量的變化趨勢如圖3所示，從總體上看，鰻魚發酵章魚胺的含量稍高于草魚魚露。在發酵過程中，發酵前期章魚胺的含量逐漸增加，發酵后期章魚胺的含量有所下降，由于魚露的發酵是由多種酶共同作用的結果，后期含量的下降可能是因為章魚胺被降解為扁桃酸衍生物所引起的。發酵34 d制備的成品魚露，草魚魚露中章魚胺的含量為(6.53±0.12)mg/mL，鰻魚魚露中章魚胺的含量為(7.49±0.08)mg/mL。

牛磺酸的含量變化如圖4所示。在發酵的整個過程中，牛磺酸的含量基本保持不變，但草魚魚露中牛磺酸的含量顯著高于鰻魚魚露。發酵成品草魚魚露牛磺酸的含量為(14.29±0.38)mg/mL，鰻魚魚露中牛磺酸的含量為(1.21±0.24)mg/mL。牛磺酸的含量不發生變化是因為在發酵的過程中牛磺酸不參與發酵反應，成品魚露中牛磺酸的含量為原料中原本所含有的牛磺酸的含量。

圖3 發酵過程中章魚胺含量的變化

圖4 發酵過程中牛磺酸含量的變化

3 結論

本試驗建立了HPLC測定章魚胺和牛磺酸含量的方法，并研究了魚露發酵過程中章魚胺和牛磺酸含的變化趨勢。與之前的檢測方法相比，該方法可以實現這兩種物質同時檢測，而且與以往單一的測定方法相比較，準確度有所提高。色譜條件為：色譜柱：SunFireTMC18(4.6 mm×150 mm，5 μm)， 柱溫35 ℃，以0.02 mol/L的NaH2PO4為流動相，pH調為7.5，流速為1.0 mol/min,紫外檢測波長360 nm，進樣量10 μL。魚露發酵過程中章魚胺含量呈現上升趨勢，牛磺酸的含量基本不發生變化。發酵成品魚露中，草魚魚露章魚胺的含量為(6.53±0.12)mg/mL，鰻魚魚露中章魚胺的含量為(7.49±0.08)mg/mL，草魚魚露牛磺酸的含量為(14.29±0.38)mg/mL，鰻魚魚露中牛磺酸的含量為(1.21±0.24)mg/mL。