miR-485-5p靶向作用于SOX5抑制肝癌細胞Hep3B的活力及侵襲和遷移能力*

王常元， 范 偉， 馮新富， 張 瑩， 劉振華， 蔣 濤

(貴州省人民醫院 1肝膽外科二部, 2肝膽外科三部， 貴州 貴陽 550002)

肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)簡稱肝癌，是最常見的原發性肝癌，發病率位居全球腫瘤第6位[1]，占全球所有腫瘤發生率的7%[2]，患者長期生存率較低，5年生存率低于15%。因此，研究肝癌發生和轉移的分子機制，對肝癌的個體化精準治療極其重要。

研究表明，微小RNA-485-5p (microRNA-485-5p, miR-485-5p)可抑制食道癌[3]、小細胞肺癌[4]和肝癌[5]等腫瘤細胞的增殖、遷移和侵襲，并可抑制膠質瘤細胞增殖[6]。性別決定區Y框蛋白5(sex determining region Y-box protein 5, SOX5)在非小細胞肺癌[7]和三陰性乳腺癌[8]中相對高表達，其高表達可以促進腫瘤細胞的增殖和轉移。但SOX5在肝癌細胞中的表達，以及miR-485-5p與SOX5在肝癌中的關系目前還尚未可知。本課題研究 miR-485-5p影響肝癌Hep3B細胞的活力及侵襲和遷移能力的分子機制，以及SOX5在此機制中的作用，以期為肝癌的靶向治療提供新的靶點。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1臨床樣本 選取貴州省人民醫院2017年6月～2017年12月手術切除經病理檢查確診為肝細胞癌的肝癌組織標本和癌旁正常組織(與腫瘤組織臨近>1.5 cm)各22例，患者年齡為29～69歲，平均年齡(49.77±10.87)歲，組織標本切除前患者均未進行放化療等治療方式。樣本用途均與患者說明，并與患者簽訂知情同意書。

1.2細胞、試劑和儀器 人肝癌細胞株Huh7、Hep3B和HCCLM3及人正常肝細胞株THLE-3購自ATCC。胎牛血清(fetal bovine serum，FBS)和RPMI-1640培養基購自Gibco;胰蛋白酶(trypsin)、牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)、二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)和MTT購自Sigma-Aldrich；Transwell板購自Corning；抗SOX5抗體、抗增殖細胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen, PCNA)抗體、抗Ki67抗體、抗細胞周期蛋白D1(cyclin D1)抗體、抗基質金屬蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2, MMP-2)抗體和抗β-actin抗體購自Abcam；RT-qPCR引物, miR-485-5p模擬物(miR-485-5p mimics, miR-485-5p)和抑制物(anti-miR-485-5p)，SOX5的過表達載體(pcDNA-SOX5)和干擾物(SOX5 small interfering RNA, si-SOX5),空載體和陰性對照[miR-control (miR-con)、anti-miR-control (anti-miR-con)和si-control (si-con)]及雙螢光素酶載體購自上海吉瑪制藥有限公司；雙螢光素酶報告基因檢測系統(dual-luciferase reporter assay system)購自Promega；Lipofectamine 2000轉染試劑、總RNA提取試劑盒、 real-time PCR試劑盒和反轉錄試劑盒購自Invitrogen；BCA蛋白檢測試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司。顯微鏡、發光儀、酶標儀及real-time PCR儀購自Bio-Rad。

2 方法

2.1細胞培養 將肝癌細胞Hep3B、Huh7和HCCLM3及人正常肝細胞株THLE-3培養于含10% FBS、1×105U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素的RPMI-1640培養基中，置于飽和濕度、37 ℃、5% CO2培養箱中培養。將細胞培養至對數生長期，顯微鏡下觀察，胰蛋白酶消化傳代。

2.2細胞轉染 將對數生長期的Hep3B細胞以每孔2×105個接種于6孔板中，觀察細胞至融合度為80%～90%時進行轉染。先用無血清Opti-MEM培養液稀釋脂質體和各組片段及載體，將等體積稀釋的脂質體和各組載體片段輕柔混勻，室溫下孵育20 min，將混合液加入到培養好的Hep3B細胞中，輕柔混勻，培養6 h，換成RPMI-1640完全培養基，轉染48 h，收集細胞，驗證轉染效果。

2.3RT-qPCR檢測mRNA的表達 收集各組細胞，根據Total RNA提取試劑盒說明書的步驟進行操作，提取細胞總RNA，然后以RNA為模板按照反轉錄試劑盒說明書合成cDNA，再以cDNA為模板按照 real-time PCR的說明書進行反應。反應程序為: 95 ℃ 4 min；95 ℃ 45 s、58 ℃ 35 s、72 ℃ 45 s，40個循環；72 ℃ 10 min。用2-ΔΔCt方法進行數據分析。miR-485-5p的上游引物序列為5’-AGAGGCTGGCCGTGATGAATTC-3’，下游采用試劑盒通用引物；SOX5的上游引物序列為5’-CAGCCAGAGTTAGCAATAGG-3’，下游引物序列為5’-CTGTTGTTCCCGTCGGAGTT-3’； U6的上游引物序列為5’-CTCGCTTCGGCAGCAGCACATATA-3’,下游引物序列為5’-AAATATGGAACGCTTCACGA-3’；β-actin的上游引物序列為5’-CAGGGCGTGATGGTGGGCA-3’,下游引物學序列為5’-CAAACATCATCTGGGTCATCTTCTC-3’。

2.4Western blot實驗 收集各組細胞，加入RIPA裂解液，室溫裂解20 min，超聲破碎細胞，收集蛋白并檢測濃度。進行SDS-PAGE，轉PVDF膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的 I 抗[抗SOX5抗體(1∶1 200)、抗PCNA抗體(1∶1 000)、抗Ki67抗體(1∶500)、抗cyclin D1抗體(1∶1 500)、抗MMP-2抗體(1∶1 000)和抗β-actin抗體(1∶1 500)]，4 ℃孵育過夜，洗膜3次，然后加入稀釋的 II 抗，室溫孵育1 h，顯影。以β-actin為內參照，分析蛋白水平。

2.5MTT實驗測定細胞活力 收集轉染后的Hep3B細胞，消化細胞，稀釋細胞至1×107/L，以每孔200 μL將細胞接種于96孔板中，分別在培養至24 h、48 h和72 h進行 MTT 實驗，每孔加入 20 μL MTT溶液，培養4 h，棄上清，每孔再加入150 μL DMSO，室溫震蕩混勻5 min，酶標儀測定波長為490 nm處的吸光度(A)值。

2.6Transwell實驗檢測細胞遷移和侵襲能力 遷移實驗：將轉染后的各組Hep3B細胞培養至對數生長期，用含1% BSA的RPIM-1640培養基稀釋細胞至2×108/L。在Transwell下層小室加入500 μL含10% FBS的RPIM-1640培養基，上層加入100 μL稀釋好的細胞，置于37 ℃、5% CO2培養箱培養24 h，用棉簽拭去上層小室的細胞，甲醛固定遷移的細胞30 min，結晶紫染色30 min，顯微鏡觀察計數。侵襲實驗：將Matrigel膠用4 ℃無血清培養基以1∶8比例稀釋，加入上層小室，37 ℃ 烘3 h使稀釋后的Matrigel膠成為固態，以下步驟同遷移實驗，上層小室加入100 μL細胞，下層加入含10% FBS的培養基，培養24 h，固定細胞，染色，計數。

2.7免疫組化實驗檢測肝癌組織和癌旁組織中SOX5的表達 用4%多聚甲醛固定肝癌和癌旁組織樣本，梯度乙醇脫水，然后進行石蠟包埋，切片，按常規程序脫蠟和水化，用3% H2O2滅活內源性過氧化物酶15 min，然后用枸櫞酸緩沖液進行抗原修復，再用10%正常山羊血清37 ℃ 封閉30 min，加入1∶300稀釋的SOX5抗體，4 ℃過夜孵育，用PBS緩沖液清洗3次，加入稀釋的生物素標記Ⅱ抗，37 ℃孵育30 min，滴加鏈霉素抗生物素蛋白-過氧化物酶復合物工作液，37 ℃孵育30 min，洗3次，加DAB顯色液，避光顯色，終止顯色。蘇木素襯染胞核，乙醇梯度脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片，37 ℃干燥48 h，顯微鏡觀察并照相。以PBS代替Ⅰ抗作為陰性對照。

2.8雙螢光素酶報告基因實驗 按照2.2的步驟培養細胞，進行轉染，將構建好的SOX5的野生型(wild-type SOX5, SOX5-WT)和突變型(mutant SOX5, SOX5-MUT)雙螢光素酶報告載體分別與miR-con或miR-485-5p共轉染至培養好的Hep3B細胞，轉染48 h，收集細胞，驗證轉染效果，室溫裂解轉染的細胞20 min，離心收集上清，加入螢光素酶底物，發光儀檢測酶活性。以海腎螢光素酶活性為內參照，計算螢火蟲螢光素相對酶活性。

3 統計學處理

采用 SPSS 21.0統計軟件進行分析。數據以均數±標準差(mean±SD)表示，組間的比較采用獨立樣本t檢驗和單因素方差進行分析, 以P<0.05為差異有統計學意義。

結 果

1 miR-485-5p和SOX5在肝癌細胞系和正常肝細胞中的表達

與正常肝細胞THLE-3相比，miR-485-5p在肝癌細胞Hep3B、Huh7和HCCLM3組中的表達水平均顯著降低(P<0.05)，SOX5 的mRNA和蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；免疫組化結果顯示，與正常癌旁組織相比，肝癌組織中的SOX5水平顯著升高，見圖1。miR-485-5p和SOX5在3個肝癌細胞株中的表達情況一致，后續實驗選擇表達差異更大的Hep3B細胞進行研究。

2 miR-485-5p過表達可抑制Hep3B細胞的活力

與miR-con組相比，miR-485-5p組Hep3B細胞中的miR-485-5p表達量顯著升高(P<0.05)，細胞活力在48 h和72 h均顯著降低(P<0.05)，PCNA、Ki67和cyclin D1的表達顯著降低(P<0.05)，見圖2，說明過表達miR-485-5p可抑制Hep3B細胞的生長。

3 miR-485-5p過表達可抑制Hep3B細胞的遷移和侵襲能力

與miR-con組相比，miR-485-5p組Hep3B細胞遷移和侵襲細胞數均顯著下降(P<0.05)，MMP-2蛋白表達水平顯著降低(P<0.05),見圖3，說明過表達miR-485-5p可抑制Hep3B細胞的遷移和侵襲能力。

4 miR-485-5p靶向調控SOX5

SOX5的3’ UTR序列中含有與miR-485-5p互補的核苷酸序列，見圖4A。雙螢光素酶報告基因檢測系統結果顯示，與miR-con組相比，miR-485-5p組野生型SOX5-WT的螢火蟲螢光素酶相對活性顯著下降(P<0.05)，而突變型SOX5-MUT的螢火蟲螢光素酶相對活性沒有明顯變化,見圖4B。Western blot結果表明，與miR-con組相比，miR-485-5p組的SOX5蛋白表達量顯著下降(P<0.05)；與anti-miR-con組相比，anti-miR-485-5p組的SOX5蛋白表達量顯著上升(P<0.05)，見圖4C。

Figure 1. The expression of miR-485-5p was low in hepatocellular carcinoma cell lines and the expression of SOX5 was relatively high. A and B: the expression of miR-485-5p and the mRNA level of SOX5 were detected by RT-qPCR; C: the protein level of SOX5 was detected by Western blot; D: immunohistochemistry was used to detect the SOX5 expression (×200). Mean±SD.n=9.*P<0.05vsTHLE-3 group.

圖1 miR-485-5p在肝癌細胞系中低表達而SOX5相對高表達

5 敲減SOX5的表達可抑制Hep3B細胞的活力及遷移和侵襲能力

與si-con組相比，si-SOX5組Hep3B細胞的A值在48 h和72 h顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著下降(P<0.05)，SOX5、PCNA、Ki67、cyclin D1和MMP-2蛋白的表達均顯著降低(P<0.05)，見圖5，說明敲減SOX5的表達可抑制Hep3B細胞的活力、遷移和侵襲能力。

6 過表達SOX5部分逆轉了miR-485-5p過表達對Hep3B細胞活力及遷移和侵襲能力的抑制作用

與miR-con組相比，miR-485-5p組Hep3B細胞的活力在48 h和72 h均顯著降低(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著下降(P<0.05)，SOX5、PCNA、Ki67、cyclin D1和MMP-2蛋白的表達顯著降低(P<0.05)；與miR-485-5p+pcDNA組相比，miR-485-5p+pcDNA-SOX5組Hep3B細胞的活力在48 h和72 h顯著上升(P<0.05)，遷移和侵襲細胞數均顯著上升(P<0.05)，SOX5、PCNA、Ki67、cyclin D1和MMP-2蛋白的表達均顯著升高(P<0.05)，見圖6，說明SOX5過表達部分逆轉了過表達miR-485-5p對Hep3B細胞的活力及遷移和侵襲能力的抑制作用。

討 論

肝癌的復雜性和異質性導致其非常難以治愈，即使手術切除或消融后，仍有70%的患者在5～10年內經歷腫瘤復發，晚期患者的治療效果微乎其微[9]。研究肝癌發展機制，對肝癌患者的個體化精準醫療具有重要作用。

研究表明，大量miRNA在肝癌中表達異常，通過mTOR、Wnt、JAK/STAT和MAPK通路參與肝癌的發生，與腫瘤發展和轉移復發密切相關，并可作為肝癌的診斷、預后標志物及治療靶點[10-11]。Sun等[12]

Figure 2. Over-expression of miR-485-5p inhibited the viability and the expression of PCNA, Ki67 and cyclin D1 in the Hep3B cells. A: the expression level of miR-485-5p was detected by RT-qPCR; B: the cell viability was detected by MTT assay; C: the protein levels of cyclin D1, Ki67 and PCNA were detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group.

圖2 miR-485-5p過表達抑制肝癌細胞活力及PCNA、Ki67和cyclin D1的表達

Figure 3. Over-expression of miR-485-5p inhibited the migration and invasion abilities of Hep3B cells. A: the migration and invasion abilities were detected by Transwell assay (×100); B: the protein level of MMP-2 was detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group.

圖3 miR-485-5p過表達抑制肝癌細胞的遷移和侵襲能力

Figure 4. miR-485-5p targeted SOX5 and regulated its expression. A: 3′UTR of SOX5 contains a nucleotide sequence complementary to miR-485-5p; B: the luciferase activity was detected by dual-luciferase reporter assay; C: the protein level of SOX5 was detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group;#P<0.05vsanti-miR-con group.

圖4 miR-485-5p靶向調控SOX5的表達

Figure 5. Knock-down ofSOX5inhibited the viability, migration and invasion of Hep3B cells. A: the cell viability was detected by MTT assay; B: the migration and invasion abllities were detected by Transwell assay; C: the protein levels were detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vssi-con group.

圖5 敲減SOX5的表達抑制Hep3B細胞的活力、遷移和侵襲能力

Figure 6. Over-expression of SOX5 partially reversed the effects of miR-485-5p over-expression on the viability, migration and invasion of the Hep3B cells. A: the cell viability was detected by MTT assay; B: the migration and invasion abilities were detected by Transwell assay (×100); C: the protein levels were detected by Western blot. Mean±SD.n=9.*P<0.05vsmiR-con group;#P<0.05vsmiR-485-5p+pcDNA group.

圖6 過表達SOX5部分逆轉miR-485-5p過表達對Hep3B細胞活力及遷移和侵襲能力的抑制作用

研究表明，miR-485-5p在肝細胞癌組織中表達顯著下調，其表達與肝癌組織TNM分期和轉移呈負相關，過表達miR-485-5p可抑制癌細胞增殖、侵襲和轉移。Wang等[13]發現，miR-485-5p在肝癌組織中表達下調，是DSCR8的結合位點，通過激活Wnt /β-catenin信號通路促進肝癌進展。本研究結果表明，與人正常肝細胞THLE-3相比，miR-485-5p在肝癌細胞Hep3B、Huh7和HCCLM3中表達均顯著下調，過表達miR-485-5p可抑制Hep3B細胞增殖、遷移和侵襲，與前述研究結果一致，再次證實miR-485-5p在肝癌中的作用。

TargetScan預測結果發現，SOX5的3’UTR序列中含有與miR-485-5p互補的核苷酸序列，提示miR-485-5p與SOX5之間可能存在調控關系，也提示SOX5可能參與肝癌的發展。SOX5是SOX(SRY-related high-mobility-group box)家族成員之一，其基因定位于染色體12p12.1，可直接結合DNA或其它蛋白調節基因的表達，調節胚胎發育和細胞分化[14]，在多種腫瘤中發揮重要作用。SOX5在非小細胞肺癌[15]和乳腺癌[16]中表達量顯著升高，促進細胞的增殖、遷移和侵襲，體外抑制SOX5可抑制NSCLC腫瘤生長。前列腺癌患者SOX5高表達意味著腫瘤更易發生轉移，無進展生存率和腫瘤特異性生存率也較低[17]。Wang等[18]研究表明，SOX5在肝細胞癌組織和細胞系中明顯上調，其通過Twist1和上皮-間充質轉化促進肝癌細胞遷移和侵襲。本研究發現，SOX5在肝癌細胞Hep3B、Huh7和HCCLM3中表達量顯著升高，敲減SOX5的表達可抑制肝癌Hep3B細胞的活力及遷移和侵襲能力，與Wang等[18]研究結果一致，證實了SOX5在肝癌發展中具有重要作用。

此外，Western blot和雙螢光素酶報告基因檢測系統的結果進一步驗證，miR-485-5p靶向負調控SOX5的表達，過表達SOX5可部分逆轉過表達miR-485-5p對Hep3B細胞活力及遷移和侵襲能力的抑制作用，證實了在肝癌中miR-485-5p和SOX5之間具有調控關系。

本研究闡述了在肝癌Hep3B細胞中過表達miR-485-5p可靶向抑制SOX5的表達，進而抑制Hep3B細胞的活力、遷移和侵襲能力。綜上所述，miR-485-5p和SOX5有望成為肝癌診斷和治療的分子靶點，為肝癌的診斷和治療提供了新的研究方向。