PCR檢測HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)變異與肝細(xì)胞癌的關(guān)系

李彥偉

肝細(xì)胞癌(HCC)以中低分化程度為主，5年生存率7%至38%，預(yù)后較差[1]。而乙型肝炎病毒(HBV)感染是HCC的重要誘因，其中HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)變異與HCC等病變密切相關(guān)[2]，但臨床對(duì)其引發(fā)HCC的具體機(jī)制尚不明確。本文納入35例HCC和35例HBV攜帶者，對(duì)比分析HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)變異特點(diǎn)，探討其在HCC病變中的作用，報(bào)道如下。

資料與方法

一、 一般資料

納入本院35例HCC與35例HBV感染攜帶者作為研究對(duì)象。HCC設(shè)為觀察組，男、女分別22、13例；年齡18～65歲，平均(48.28±13.19)歲；BMI 17.5～23.0 kg/m2，平均(20.44±2.20)kg/m2；HBeAg陽性6例。HBV攜帶者為對(duì)照組，男、女分別19、16例；年齡18～65歲，平均(47.56±14.24)歲；BMI 18.0～23.5 kg/m2，平均(20.96±1.87)kg/m2；HBeAg陽性7例。兩組患者基本資料比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

二、 納入與排除標(biāo)準(zhǔn)

(一) 納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)本研究納入HCC與HBV攜帶患者診斷標(biāo)準(zhǔn)分別參照指南和防治方案進(jìn)行[3-4]；(2)入選患者均行HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)檢測。

(二)排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并酒精性脂肪肝和代謝性肝病患者；(2)合并有嚴(yán)重心腦血管疾病及甲狀腺功能異常者；(3)合并有惡性腫瘤者；(4)PCR擴(kuò)增不成功者；(5)病歷資料不全者。

三、 檢測方法

(一) 實(shí)驗(yàn)設(shè)備試劑：PCR擴(kuò)增儀為美國賽默飛SimpliAmpTM熱循環(huán)儀梯度PCR儀，基因測序儀為NexSeqCN500基因測序儀，由杭州貝瑞和康基因診斷技術(shù)有限公司提供。Taq DNA多聚酶和DNA純化試劑盒購自北京奧維亞生物技術(shù)有限公司。參照GenBank HBV基因型保守序列進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，引物為PreS2(5′-GGGTCACCATATTCTTGGGAA-3′，2794-2814)和Pol10A(5′-GCAGCAAAGCCCAAAA-GACC-3′)。

(二) PCR擴(kuò)增：以巢式PCR擴(kuò)增檢測HBV前C/C基因，嚴(yán)格按試劑盒說明方法進(jìn)行。抽取血清HBV DNA，后PCR擴(kuò)增，94 ℃預(yù)變性2 min → 94 ℃變性30 s → 55 ℃退火30 s → 72 ℃延伸90 s → 35個(gè)循環(huán) → 72 ℃延伸5 min。后進(jìn)行產(chǎn)物純化及測序。用Seq Man軟件進(jìn)行變異分析，與Gen Bank HBV相應(yīng)基因序列進(jìn)行對(duì)比記錄。

(三)HBV分型：用瓊脂糖凝膠對(duì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行電泳處理，依據(jù)切片長度確定基因分型。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

以SPSS 22.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料以±標(biāo)準(zhǔn)差表示，行t檢驗(yàn)，計(jì)數(shù)資料以百分比表示，行χ2檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、 PCR擴(kuò)增結(jié)果

觀察組HBV前C/C子區(qū)24例發(fā)生變異，其中G1896 17例，G1899 7例，對(duì)照組HBV 前C/C子區(qū)7例，其中G1896 2例，G1899 5例，兩組HBV前C/C子區(qū)變異率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(χ2= 19.586，P=0.000)。

二、 基因型分布結(jié)果

觀察組HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)基因亞型中Ba型7例，C1亞型16例，C2亞型12例，對(duì)照組Ba型4例，C1亞型17例，C2亞型14例。兩組基因型分布無顯著性差異(χ2= 1.002，P=0.606)。

討 論

HBV感染可導(dǎo)致慢性肝炎的持續(xù)性進(jìn)展和肝細(xì)胞異常增殖分化，成為癌變的潛在危險(xiǎn)因素。另外，HBV感染后宿主免疫抵抗力下降，使HBV發(fā)生變異，這可使病毒避免免疫攻擊，為病毒復(fù)制創(chuàng)造條件，最終破壞宿主基因組，發(fā)生癌變。既往報(bào)道認(rèn)為HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)突變是肝功能惡化，HBV復(fù)制活躍的信號(hào)[5]，施海燕等[6]一項(xiàng)報(bào)道則指出HBV前C/C變異是加快慢性乙型肝炎患者肝纖維化病理變化的高危因素。

本研究顯示兩組HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)變異率差異顯著，其中HCC患者以G1896變異為主，這可能是因前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)1896位核苷酸變異可使HBV逃過宿主免疫識(shí)別，破壞宿主原有基因組的平衡狀態(tài)，降低了患者對(duì)HBV感染的耐受性，使宿主肝細(xì)胞更易發(fā)生炎癥壞死，增加癌變風(fēng)險(xiǎn)。另外，G1896位點(diǎn)變異還可使HBeAg翻譯提前終止，進(jìn)而發(fā)生HBeAg轉(zhuǎn)換，影響疾病進(jìn)展。

另外，本研究還顯示HBV前C/C基因啟動(dòng)子區(qū)亞型分布差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這提示HCC的發(fā)生可能與HBV前C/C基因型并無顯著關(guān)系。可能是因HBV前C/C基因啟動(dòng)子突變多發(fā)生于C亞型，而HCC患者亞型亦以C亞型為主。另外，本研究樣本量小，有報(bào)道還顯示HCC基因型分布與年齡、地域等因素有關(guān)[7]。因而，有關(guān)基因型分布與HCC的關(guān)系還有待今后擴(kuò)大樣本量進(jìn)行多因素分析觀察。