慢性肝損傷中的危險信號分子

蘭小勤

作者單位：510515 廣州 南方醫科大學南方醫院感染內科

對病原體和損傷細胞等威脅的檢測對生物體生存至關重要。其中之一的機制是宿主細胞分泌內源性分子到細胞外環境，細胞表面受體識別為危險信號或“警報”，從而必須啟動和保持先天性免疫反應。這些遷移的宿主細胞來源的活化因子，被稱為損傷相關分子模式(DAMPs)[1]。

在損傷、創傷、缺血或感染引起細胞壞死后，細胞被動釋放DAMPs。在肝臟中，被動釋放主要發生在脂過載、受損、凋亡的壞死肝細胞中[2]。在免疫細胞或應激的實質細胞和非實質細胞中，也通過分泌溶酶體主動釋放DAMPs[3]。這些分子通過模式識別受體(PRRs)和nod樣受體蛋白3(NLRP3)或炎癥小體感知，從而觸發趨化因子和其他介質的釋放，引發初始的對抗感染和細胞損傷的促炎反應[2]。雖然這種反應可能是有益的，但持續釋放的DAMPs可能對慢性肝病產生不利影響。

當DAMPs被活性氧(ROS)和活性氮(RNS)激活時，還會導致進一步損傷，從而釋放更多的DAMPs[4]，引發更復雜和更明顯的反應。在肝臟炎癥反應時，庫普弗細胞激活、巨噬細胞(MFs)和中性粒細胞釋放腫瘤壞死因子 (TNF)和其他促炎細胞因子，從而激活NFκB通路，加劇對肝細胞造成的損傷[5]。因此，雖然ROS、RNS和DAMPs的生理水平影響肝臟穩態，但它們不受控制的產生和釋放會激活信號級聯反應，如果任其發展，則會加劇肝臟損傷。

隨著全球肥胖和代謝綜合征的增加，非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)全球患病率日益攀升，已達到約25%，成為全球最常見的慢性肝病。非酒精性脂肪性肝炎(NASH)是NAFLD的一個類型，其特征不僅是肝細胞脂質積累，還包括不同程度的炎癥和纖維化。NASH可導致肝硬化甚至肝癌。肝相關死亡風險隨著肝纖維化程度的增加呈指數級增加。同時NAFLD是一種復雜的代謝性疾病，遺傳和環境因素相互作用。目前最普遍接受的是“多重打擊”假說。這一假設考慮了多種損害共同作用，包括從脂肪組織分泌的激素/脂肪因子、脂肪毒性、氧化應激、線粒體功能障礙、遺傳和表觀遺傳因素以及腸道微生物[6]。

循環中DAMPs水平可反映肝損傷的嚴重程度，這些分子很可能是慢性肝損傷有前景的生物標記物和(或)潛在的治療靶點。然而，針對NAFLD、肝纖維化和肝癌中相關DAMPs的臨床試驗數量非常有限；有必要對這些慢性肝病中相關的主要DAMPs進行梳理。

一、ROS和RNS可誘發慢性肝病相關的損傷和事件

ROS和RNS通常由健康細胞在生物學和代謝過程中產生。肝臟通過線粒體代謝,和膜結合NADPH氧化酶(NOX)的激活、胞質誘導型一氧化氮合酶(iNOS)和微粒體細胞色素P450來產生自由基，并使自身暴露于自由基中。通過維持自由基產生和抗氧化防御之間的平衡，來調節細胞內穩態[7-8]。

然而，自由基的產生也會促進炎癥。在肝臟，氧化過剩和硝化應激不僅有助于DAMPs產生的增加，而且與慢性肝臟疾病如非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、肝纖維化和肝細胞癌的發病機制相關。線粒體功能障礙是脂肪肝發病的關鍵[9]。乙醛，酒精代謝的最終產物，導致線粒體結構和功能的改變，從而降低三磷酸腺苷(ATP)的產生，增加ROS的生成。此外，富含果糖和脂肪的飲食及合并胰島素抵抗可增強游離脂肪酸(FFA)對線粒體的β氧化作用，增加了線粒體膜的通透性，導致質子泄漏和ROS的產生，降低ATP水平[10]。在NASH中，CD4+T細胞中線粒體重量增加，線粒體ROS(mtROS)產生增加，CD4+T細胞耗竭[11]。而抗氧化劑治療可增加CD4+T細胞，從而延緩NAFLD和肝細胞癌的發生。ROS還調節肝星狀細胞(HSCs)的促血管生成和促纖維化反應[4]。

臨床試驗研究了抗氧化劑在NAFLD中的療效。在動物模型中，維生素E單獨或聯合降脂藥物阿托伐他汀可緩解脂肪變性向NASH的進展[12]。另一個減少氧化應激的方法是限制飲食，因為攝入高熱量會導致mtROS增加，抗氧化酶活性降低[13]。

二、肝內DAMPS

在NASH進程中，過量的脂質積累、ROS的產生和內質網(ER)應激損傷肝細胞。這種損傷主要通過細胞凋亡和焦亡引起程序性細胞死亡，導致次級壞死，釋放細胞內物質到細胞外空間，作為模式識別受體(PRRs)識別的DAMPs[14]。在NASH進展過程中，Toll樣受體(TLRs)和NOD樣受體(NLRs)感知到多個DAMPs，從而介導炎癥和纖維化[15]。

線粒體損傷和隨后的細胞死亡釋放免疫原性mtDNA[16]。mtDNA受體TLR9是內化在胞內細胞器如核內體和識別吞噬未甲基化的CpG DNA片段。肥胖患者血清中未甲基化的CpG DNA片段升高，TLR9表達上調[15]。接受TLR9或骨髓細胞特異性敲除處理的小鼠，及TLR9拮抗劑IRS954可降低NASH，提示可能的治療靶點[16]。此外，單鏈RNA (ssRNA)與TLR7結合，Nox4、ROS、NLRP3均可促進NASH的進展[16]。NOX1/4抑制劑GKT137831治療小鼠，可減少ROS和NLRP3的激活，并降低NASH小鼠模型中的炎癥。NLRP3抑制劑MCC950可以改善肥胖糖尿病小鼠的NAFLD和纖維化[15]。

三、肝外DAMPs

過高的膽固醇攝入和高膽固醇血癥是NASH的危險因素。氧化的低密度脂蛋白通過CD36傳遞膽固醇結晶，激活MFs中的NLRP3炎性小體[17]。此外，降膽固醇藥物依折麥布和阿托伐他汀在HFHC小鼠納什模型中抑制NLRP3的表達和炎癥，靶向CD36保護小鼠免于NASH的侵襲[18]。

晚期糖基化終產物(AGE)是通過還原糖(如葡萄糖)與蛋白質、脂質或核酸之間的非酶性葡糖胺反應產生的。群體遺傳學表明，AGE受體基因的多態性和循環可溶性RAGE(AGER編碼)與NASH的風險相關[19]。

四、肝纖維化(LF)中的DAMPs

慢性肝損傷中HMGB1、OPN、HSPs、IL-33和ATP等DAMPs可激活肝星狀細胞(HSCs)，HSCs是膠原的主要來源，也是肝衰竭中主要的細胞外基質(ECM)成分[20]。HMGB1激活HSCs并誘導內質網應激反應。此外，HMGB1通過pmek1/2/perk1/pcJun信號通路在HSCs中通過RAGE信號上調I型膠原的表達[21]。骨橋蛋白(OPN)是一種對氧化應激敏感的基質結合蛋白，在肝損傷中受到高度誘導，通過RAGE增加HMGB1和I型膠原在HSCs中的表達，成為LF發病機制中的關鍵DAMPs。熱休克蛋白(HSP)90參與了HSCs的激活和存活。HSP47是一種膠原特異性分子伴侶，對膠原在纖維化區周圍的沉積起關鍵作用，因此參與了LF的形成。此外，HSP47的抑制劑如乳鐵蛋白和水飛薊素可阻止HSC的活化[21-22]。

五、肝癌中的DAMPS

肝細胞癌(HCC)是常見的慢性肝病終末期。約90%的HCC來自肝硬化，DAMPs在肝癌的起始和進展中都發揮了作用。

(一)HCC的起始 在人類HCC中，HMGB1在肝臟和血清中升高,與腫瘤分期和不良預后相關(薈萃分析)。在二乙基亞硝胺(DEN)肝癌小鼠模型中，HMGB1的表達與腫瘤發生相關。此外，在HCC患者中，OPN表達顯著增加，且與腫瘤和生存率相關[23]。然而，OPN在HCC啟動中的作用尚不完全清楚。S100家族的蛋白作為細胞內Ca2+傳感器和細胞外DAMPs結合RAGE，并在各種癌癥中經常被異常調節。到目前為止，RAGE在HCC啟動中的作用尚不清楚，但可溶性RAGE亞型與人類HBV和HCV感染的HCC風險負相關[24]。除了RAGE, HMGB1還與受體TLR4相互作用。該受體在HCC發生過程中起保護作用。

(二)HCC的進展 HMGB1可誘導HCC細胞增殖、遷移和侵襲。在低氧條件下，HMGB1從細胞核轉移到胞質并與TLR9結合，其結合是通過mtDNA介導的。TLR9激活可幫助腫瘤細胞適應缺氧，導致線粒體生發、腫瘤相關的MF侵襲、腫瘤生長和轉移[4]。研究表明，HMGB1通過激活RAGE誘發HCC進展[25]。

OPN通過激活整合素和CD44在體內和體外誘導腫瘤增殖、侵襲和轉移[26]。重要的是，在人類和小鼠HCC中，OPN與PDL1水平相關，提示其可能在免疫逃避中發揮作用[26]。因此，靶向OPN治療人HCC可能是一種有前景的方法，作為免疫治療后的二線治療。在S100蛋白中，S100A1在人類HCC中上調，并與較低的生存率和凋亡減少相關。間充質基質細胞分泌S100A4，可誘導HCC在人體內增殖、侵襲，上皮-間充質轉化和轉移。S100A8在體內可誘導細胞增殖、遷移、侵襲和腫瘤生長。S100A9還通過RAGE信號誘導細胞增殖和侵襲[27]。

目前研究表明,在NAFLD、肝纖維化和肝癌中，由ROS和RNS誘導產生的DAMPs以及由受損肝細胞或非實質細胞產生的DAMPs，會通過增加氧化應激、脂質積累、炎癥和纖維化，驅動肝損傷。目前NAFLD尚無公認的有效治療手段，且成功地以DAMPs為靶點預防慢性肝病發病和進展的臨床試驗很少。HCC是全球癌癥相關死亡的第二大原因，因此，單獨阻斷或聯合阻斷特異性DAMPs可能將為NAFLD的預防和治療提供有價值的干預靶點，并且可能是未來提高HCC患者生存率的一種有前景的策略。