肝臟疾病的外泌體治療研究進展

馮帆 江梅 邵勇

作者單位：400016 重慶醫科大學附屬第一醫院婦產科(馮帆，邵勇)；四川省內江市第一人民醫院婦產科(江梅)

肝臟疾病的治療方法較多，但許多慢性肝病仍然無法徹底根治。藥物治療無效時進入終末期的肝臟疾病臨床上常常會選擇肝臟移植等手段，但也面臨很多問題，所以急需新的肝病治療方法。

近年來，外泌體(Exosome)的研究引起了醫學界的廣泛關注。 1983年，外泌體首次于綿羊網織紅細胞中被發現。外泌體是由多種免疫細胞、上皮細胞和腫瘤細胞產生的一種特殊類型的微泡，在多囊體(MVB)內產生，并在MVB與質膜融合之后釋放[1]。外泌體具有脂質雙分子層結構，外泌體中含有豐富的蛋白質、核酸、mRNA和miRNA，而且具有信號傳遞的功能。目前許多研究顯示，外泌體參與多種疾病的發生、發展，并可能用于疾病的治療。本文將外泌體用于肝病治療方面的近年研究進展綜述如下。

一、肝臟缺血再灌注損傷(IRI)的外泌體治療

肝臟缺血再灌注(IRI)損傷一般發生在創傷性休克，肝臟手術或肝移植術后。當缺血組織重新獲得血液供應時，器官功能不但不能恢復，反而會加重功能代謝障礙及結構破壞，這主要是由于恢復血液供應后，過量的自由基攻擊了重新獲得血液供應的組織內的細胞造成的。

目前肝臟IRI的主要防治方法為缺血預處理(IPC)。此方法雖然處理簡單且無藥物副作用，但預處理的條件和程度卻不易控制。因此，必須尋求新的治療方法。

目前研究顯示，用于肝臟損傷治療來源最多的就是間充質干細胞(MSC),因為MSC具有強大的分化和轉分化的能力。Nong等[3]將多能干細胞來源的間充質基質細胞產生的外泌體(hiPSC-MSCs-Exo)注射到大鼠肝臟I/R損傷模型中，與對照組相比，Exo+I/R組肝細胞壞死和肝竇充血明顯受到抑制，再灌注后AST，ALT降低，巨噬細胞和中性粒細胞減少，MPO水平降低，血清腫瘤壞死因子-a和IL-6水平降低，且凋亡蛋白capspase-3細胞數降低而抗凋亡蛋白Bcl-2升高。這些數據都顯示hiPSC-MSCs-exo具有抗炎且誘導肝細胞的抗凋亡作用。

Sun等[4]研究顯示用褪黑素預處理的MSCs衍生的外泌體比單獨注射外泌體處理成年大鼠后在抑制炎癥，降低氧化應激及減少凋亡蛋白方面效果更好。

二、藥物肝損傷的外泌體治療

藥物性肝損傷(drug-induced liver injury，DILI)是指在藥物的臨床應用過程中由各類化學藥物、生物制劑、傳統中藥(TCM)、天然藥(NM)、保健品(HP)、膳食補充劑(DS)及其代謝產物乃至輔料等所誘發的肝損傷，已知全球有1 100多種上市藥物具有潛在肝毒性[5]。目前，外泌體在藥物性肝損傷(DILI)的治療上已取得了一些進展。

(一)胚胎干細胞來源的外泌體治療藥物肝損傷 Tan等[6]將胚胎干細胞中提取出來的外泌體與CCl4腹腔注射給小鼠，用CCl4和外泌體處理的小鼠AST和ALT增加小于對照組且僅發現微量壞死細胞。在體外用乙酰氨基酚(APAP)和過氧化氫(H2O2)誘導肝損傷來測定外泌體對細胞活力的影響，在兩種損傷模型中外泌體處理組細胞活性顯著高于未處理組。外泌體處理組增殖細胞核抗原PCNA和增殖蛋白cyclinD1和cyclinE的肝臟基因表達顯著上調，顯示出外泌體的增殖和再生作用。外泌體還通過上調Bcl-xL蛋白表達抑制APAP和H2O2誘導的肝細胞凋亡。

(二)骨髓間充質干細胞來源的外泌體治療藥物肝損傷 Tamura等[7]從C57B6小鼠骨髓MSC中收集外泌體，靜脈注射到刀豆蛋白-A(ConA)誘導小鼠肝損傷模型中，顯示ALT水平降低且壞死區域減少，促炎細胞因子IL-2降低，轉化生長因子b和肝細胞生長因子表達增加。單鏈DNA(ssDNA)是凋亡細胞的標記，只有注射三次外泌體小組觀察到ssDNA指數的降低。另外，接受三次注射的小鼠組與MSCs在抑制肝損傷的程度上相似。注射外泌體和MSCs組都有Treg數量增加，但注射三次外泌體小組Treg數量百分比最高。外泌體也對誘導的肝損傷有抑制作用，且多次注射外泌體的實驗組中Treg數量增加。

(三)肝細胞來源的外泌體治療藥物肝損傷 Nojima等[8]研究發現只有原代肝細胞來源的外泌體能促進肝細胞增殖，庫普弗細胞來源的外泌體降低了肝細胞增殖。

三、肝纖維化的外泌體治療

肝纖維化 (hepaticfibrosis) 是指肝臟內彌漫性的纖維結締組織沉積，是對炎癥壞死等組織損傷的修復反應。引起肝纖維化常見的疾病包括病毒性肝炎、酒精性肝病、非酒精性脂肪性肝病、膽汁淤積性肝病、自身免疫性肝病等。膽汁淤積(cholestasis)是由于膽汁分泌及排泄障礙引起的一種病理生理過程，，長期持續的膽汁淤積將進展為肝纖維化或肝硬化。目前還沒有特異有效的治療肝纖維化的辦法，治療的主要目的就是阻止肝臟損傷，延緩進一步惡化的進程。臨床上只能針對原發病和抗纖維化進行治療。

(一)臍帶間充質干細胞來源的外泌體治療肝纖維化 Li等[9]用CCL4誘導小鼠肝纖維化，將人臍帶間充質干細胞來源的外泌體(uMSC-Ex)注入小鼠肝臟后顯示I型膠原和III型膠原的表達減少，AST維持在正常水平而對照組AST顯著提高，ALT則與對照組無差異，血清HA降低，血清TGF-b1降低，TGF-b1可以激活Smad2的磷酸化，并在體內導致肝臟EMT。曾韜等[10]通過超速離心收集uMSC-Ex，用雙氧水處理肝細胞系L02和WRL-68建立肝細胞損傷模型，25ng/ml的TGF-b1加0.75mM的ATP刺激肝星狀細胞作為LX2活化模型。結果發現在肝損傷模型中uMSC外泌體能上調肝細胞中凋亡蛋白Bcl-2的表達和減少肝細胞的凋亡，在LX-2激活模型中，加入uMSC外泌體能減少a-SMA的表達。利用特異性的唾液酸糖苷酶從外部將外泌體a-2，6-唾液酸糖結構切除后，再將酶切后的外泌體進行實驗，發現酶切后的外泌體失去作用。說明外泌體中糖蛋白a-2，6-唾液酸糖結構對外泌體的生物學作用有很大影響。

(二)脂肪間充質干細胞來源的外泌體治療肝纖維化 Lou等[11]通過慢病毒介導的前miR-122轉移構建了MIR-122修飾的脂肪來源間充質干細胞(AMSC-122)，腹腔注射到CCL4誘導的小鼠肝纖維化模型中，顯示AMSC-122抑制膠原合成和成熟，抑制肝星狀細胞(HSC)的增殖，血清HA、P-III-P、ALT、AST和肝羥脯氨酸含量降低，Col1A1蛋白水平降低，TGF-b1和a-SMA表達水平下調。Qu等[12]也發現外泌體可以作為載體將miR-181-5p傳遞給HSC-T6，來自miR-181-5p-ADSCs的外泌體下調HSC-T6細胞中STAT3和Bcl-2的表達并激活自噬。與對照組相比，外泌體治療減輕了肝臟損傷，下調了肝臟中的I型膠原、波形蛋白、a-SMA和纖維連接蛋白。

(三)骨髓間充質干細胞來源的外泌體治療肝纖維化 Rong等[13]用人骨髓間充質干細胞來源的外泌體(HBM-MSCs-Ex)治療小鼠肝纖維化模型，發現HBM-MSCs-Ex治療組膠原面積低于HBM-MSCs治療組，同樣Ishak纖維化評分，IL-6,IL-1,羥脯氨酸和丙二醛水平也低于HBM-MSCs治療組，說明HBM-MSCs-Ex的治療效果明顯大于HBM-MSCs，兩治療組均能降低血清AST,ALT,總膽紅素，堿性磷酸酶和g-GT水平。

四、肝衰竭的外泌體治療

肝衰竭是由多種因素引起的嚴重肝臟損害, 導致合成、代謝、解毒和生物轉化功能嚴重障礙或失代償, 出現以黃疸、凝血功能障礙、腹水、肝腎綜合征、肝性腦病等為主要表現的一組臨床癥候群。

(一)脂肪間充質干細胞來源的外泌體治療肝衰竭 Liu等[14]用AMSC-Ex治療ALF小鼠模型發現有明顯的治療效果，而將miR-17敲除后的AMSC-Ex治療效果被取消，說明miR-17在治療ALF中發揮重要作用。miR-17通過靶向TXNIP，減少巨噬細胞中NLRP3的炎癥小體活化，改善GalN/TNF-α誘導的ALF，從而對ALF產生保護作用。王皙等[15]發現AMSC-Ex對ALF小鼠模型有明顯的治療作用，RNA測序發現肝組織內與炎癥反應及趨化因子信號通路相關多種基因顯著下調，從六種miRNAs中篩選出來對抑制炎癥及趨化因子途徑最明顯的miR-19b-3p，miR-19b-3p靶作用于P47phox-ROS抑制活化巨噬細胞內炎癥促進性細胞因子IL-1a、IL-6、TNF-a，促進炎癥抑制性因子IL-10的表達。

(二)臍帶間充質干細胞來源的外泌體治療肝衰竭 Jiang等[16]將臍帶間充質干細胞提取的外泌體用PHK67標記，與巨噬細胞共孵育，在巨噬細胞中發現熒光，表示外泌體可以被小鼠體內巨噬細胞吸收，結果顯示uMSCs-Ex降低脂多糖刺激的RAW-264.7巨噬細胞中的NLRP3和caspase-1、IL-1b和IL-6的表達，逆轉ALF導致的肝臟病理改變和炎性細胞浸潤，AST和ALT也顯著降低。

(三)月經血干細胞來源的外泌體治療肝衰竭 Chen等發現[17]人月經血源性干細胞來源的外泌體(MenSC-Ex)可以減少體外AML12細胞(一種小鼠肝細胞系)的凋亡，也減少LPS/D-GalN誘導的暴發性肝功能衰竭(FHF)小鼠模型中肝臟單核細胞(MNC)和活性凋亡蛋白caspase-3的數量，具有抗凋亡的作用。

五、肝臟腫瘤的外泌體治療

研究顯示，中國每年超過30萬人死于肝細胞癌，占全球肝癌死亡人數的一半，肝移植是全球公認的最有效辦法之一[18]，但肝臟需求遠遠大于供肝數量。

(一)脂肪間充質干細胞來源的外泌體治療肝臟腫瘤 Lou等[19]用miR-122轉染AMSC，提取出來的122-Exo可以改變miR-122-靶基因的表達使癌細胞對化療藥物敏感，瘤內注射122-Exo可以顯著提高索拉菲尼在體內對HCC的抗腫瘤效果，增強HCC化療敏感性。

(二)肝細胞來源的外泌體治療肝臟腫瘤 Cheng等[20]發現肝細胞來源的含有p120ctn(一種在許多實體腫瘤中異常表達的膜蛋白)的exosome通過STAT3途徑抑制HCC細胞的進展。Cheng等[21]用褪黑素處理肝癌來源的外泌體(Exo-MT)，發現處理后的外泌體可以通過STAT3途徑減弱腫瘤細胞導致的巨噬細胞的免疫抑制狀態。Lin等[22]從轉染pEGFP-C3-NSMase1的L02細胞培養液中分離出exosome，發現NSMase活性增加，NSMase1-Exo通過降低鞘磷脂(SM)/神經酰胺(Cer)的比值抑制HCC細胞生長并誘導凋亡。Cho等[23]將暴露于醋氨酚(APAP)中的小鼠的外源性外泌體內化到小鼠肝細胞中或HepG2肝癌細胞中，發現可以顯著降低受體細胞的活力。

(三)樹突狀細胞來源的外泌體治療肝臟腫瘤 Lu等[24]將表達AFP的樹突狀細胞(DEXAFP)的外泌體注入HCC小鼠模型中，發現DEXAFP誘導了強烈的抗原特異性免疫反應，并導致異位、原位和致癌物誘導的具有抗原和病理異質性的肝癌小鼠明顯的腫瘤生長遲緩和延長的存活率。表現為腫瘤部位表達c-干擾素(IFN-c)的CD8+T淋巴細胞明顯增多，IFN-c和白細胞介素-2水平升高，CD25+Foxp3+調節性T(Treg)細胞減少，腫瘤部位白細胞介素-10和轉化生長因子-b水平降低。

外泌體治療肝病雖然已經有一定的進展，但目前尚停留在細胞實驗和動物實驗的階段，臨床應用還有一定的距離。隨著外泌體研究的深入，外泌體提取和純化技術的進步，未來外泌體必定能給肝病治療領域帶來新的希望。