NDRG1通過上皮-間充質轉化與子宮內膜樣癌MELF浸潤模式的相關研究

荊羽萌，趙海潮，白麗娜，肖虹，鄭繪霞

(1.山西醫科大學第一臨床醫學院，太原 030001； 2.山西醫科大學第一醫院病理科，太原 030001)

N-myc下游調節基因1 (N-myc downstream regu-lated gene 1，NDRG1) 是一種在多細胞生物中均高度保守的細胞質蛋白，廣泛存在于人體多種組織中。NDRG1是N-myc下調基因家族的成員，屬于α/β水解酶超家族。在涉及各種人類癌癥的不同檢測報告中均出現了NDRG1的表達失調[1-2]。絕大多數研究表明，NDRG1是一種轉移抑制因子[2-4]。在結直腸癌中，NDRG1被認為是預后較好的預測因子，并可調節肌動蛋白細胞骨架重組，以抑制腫瘤細胞遷移[2]。子宮內膜癌是女性發病率和病死率均極高的惡性腫瘤，有數據表明，子宮內膜癌發病率居女性第四位，病死率居第五位，是危害女性健康的重大問題之一[5-6]。目前雖然采取以手術治療為主的綜合治療，但效果并不盡如人意。晚期子宮內膜癌大部分發生浸潤轉移，導致患者預后不佳。而NDRG1作為一種轉移抑制因子，能夠調控腫瘤進展中不同的信號通路，導致主要轉移相關功能的中斷，包括上皮-間充質轉化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)、細胞骨架重塑以及腫瘤的遷移和侵襲[1,3]。一些有關NDRG1功能的分子通路并不明確，其靶點和伴侶分子仍需進一步探索。現就NDRG1通過EMT與子宮內膜樣癌發生微囊性、延長性及碎片性(microcystic，elongated，fragmented，MELF)浸潤模式的相關研究予以綜述。

1 NDRG1表達的特異性

1.1人體NDRG1的表達 RNA印跡分析和原位雜交發現，正常人體組織中NDRG1在信使RNA水平上普遍表達[7-10]；當用免疫組織化學和蛋白質印跡分析時，一些器官組織(包括腦、心臟、卵巢、骨骼肌、結締組織和血管)在信使RNA水平表達NDRG1，但在蛋白質水平不表達[10-11]。信使RNA和蛋白質水平之間的差異表明，NDRG1表達受轉錄和翻譯水平的調節[10]。雖然NDRG1信使RNA在人體組織中普遍表達，但蛋白質以更具選擇性的方式表達。NDRG1蛋白主要存在于上皮細胞中，在間質細胞和內皮細胞中未觀察到。NDRG1在細胞中的定位很大程度上取決于組織類型，如在腸上皮細胞和哺乳期的乳腺組織中，NDRG1與細胞膜有很強的相關性，而在前列腺上皮細胞中其主要在細胞核中表達[11]。在其他組織類型(如腎的近端腎小管細胞)中，檢測到顆粒狀的細胞質和細胞核中的NDRG1蛋白[10]。考慮到NDRG1在各種組織中發揮多種生理功能，故不同的細胞定位可能與蛋白質的廣泛功能有關。

1.2NDRG1的組織特異性功能 NDRG1基因對多種生物刺激做出反應，包括一氧化氮、細胞內Ca2+濃度、重金屬離子(如Ni2+和Co2+)、缺氧、鐵耗竭、雄激素、維生素A和維生素D3等[12-13]。雖然NDRG1普遍表達，但其可能具有組織特異性功能。NDRG1在睪丸和前列腺中的表達可能與蛋白質在生殖器官發育中的預期作用[13]以及對雄激素的反應有關[14]。在胎盤中發現的NDRG1表達，也可以通過其在滋養層分化和保護免受缺氧誘導損傷中的作用來解釋[15]。Meng等[16]研究發現，NDRG1在胎盤植入過程中的蛻膜形成中起重要作用，且NDRG1的異常表達可能與流產有關。有學者發現，NDRG1表達與缺氧誘導因子-1α(hypoxia inducible factor-1α，HIF-1α)、妊娠特異性β1糖蛋白、增強子結合蛋白α、Y盒結合蛋白1和SMAD7的蛋白表達相關，并提出轉錄因子Sp1(specificity protein 1)與HIF-1α、CCAAT增強子結合蛋白α、Y盒結合蛋白1和SMAD7通過時間依賴性方式調節低氧狀態下膠質瘤細胞中NDRG1的表達，以此進行低氧狀態下的細胞保護作用[17]。NDRG1的表達和功能表明，其可能在正常生理學中發揮組織特異性和多效性作用。

1.3腫瘤中NDRG1的表達 與正常組織相比，腫瘤組織中可觀察到NDRG1的異常表達，具體表現為表達上調或下調[18-22]。癌細胞中，這種異常的表達可能由于NDRG1在遺傳或表觀遺傳水平上的調節[23-25]。已有研究證明，癌基因N-myc和C-myc可通過與NDRG1核心啟動子的相互作用，降低其啟動子活性，間接抑制NDRG1[22-23]。在神經母細胞瘤細胞中，組蛋白修飾因子賴氨酸特異性脫甲基酶1與N-myc/MYCN癌基因共同抑制NDRG1表達[26]。這表明，NDRG1在細胞中的定位可能取決于其在細胞中的功能，從而解釋不同腫瘤中NDRG1的多效性。雖然NDRG1在絕大多數腫瘤(如膀胱癌)中高表達[27]，但在部分腫瘤中NDRG1表達下調，如胃癌[28]、結直腸癌[29-30]、宮頸癌[31]、卵巢癌[32]和前列腺癌[33]等。因此，NDRG1在不同組織中的表達存在爭議。許多研究強調了靶向NDRG1在癌癥中的治療潛力[21，34-36]。NDRG1與多種癌癥轉移相關，其表現出多效活性，可抑制多種類型腫瘤的轉移[35-36]。NDRG1的磷酸化和切割與其功能有關，雖然尚不清楚這些修飾是否在不同類型癌細胞中普遍或選擇性發生，以及是否有助于其多效性[37]，然而已有學者在某些類型的癌癥中報道了NDRG1的促癌基因作用[25,27,38-39]。因此，提出NDRG1的癌癥特異性、多效性功能[18,25，40]。

2 NDRG1與EMT

2.1NDRG1抑制EMT 轉移是腫瘤學中惡性腫瘤的特性之一，導致近90%的癌癥相關死亡；癌細胞經歷EMT以侵入基膜并轉移到遠處器官[41]。EMT是一種重要的生物學過程，參與了胚胎發育、組織重構和切口修復，同時還導致惡性腫瘤轉移[42]。近年來，已經篩選出許多可抑制侵襲-轉移級聯反應過程的轉移抑制基因[43]。NDRG1是一種生長和轉移抑制因子，其已顯示出作為抑制腫瘤轉移治療靶點的潛力[13]。NDRG1可以抑制EMT并導致腫瘤細胞具有更多的上皮表型，從而可能降低腫瘤細胞的侵襲能力[3]。一系列新的縮氨基硫脲抗癌藥物已被證明可以通過HIF-1α依賴和非依賴性機制上調NDRG1[44-45]，并提供了有效治療癌癥轉移的方法[46-49]。因此，進一步研究NDRG1通過抑制EMT抑制腫瘤轉移的機制及藥物標靶具有重要意義。研究表明，NDRG1通過抑制EMT介導其轉移抑制作用[3]。

2.2NDRG1通過轉化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)通路抑制EMT TGF-β通路在誘導EMT中起重要作用，研究表明，NDRG1通過調節TGF-β通路，從而調節TGF-β對EMT的作用，由于EMT在轉移-侵襲級聯中起關鍵作用[50-51]，所以NDRG1調節TGF-β通路是介導腫瘤轉移抑制作用的一種機制。NDRG1可以減少TGF-β誘導的細胞膜上上皮鈣黏素(E-cadherin)和β聯蛋白(β-catenin)的丟失；而在TGF-β存在的情況下，NDRG1過表達維持了細胞膜上的E-cadherin和β-catenin的表達[3]。此外，研究還顯示了NDRG1表達對SMAD蛋白(如SMAD2和磷酸化SMAD3)的抑制作用[48]。由于SMAD蛋白在轉錄中起作用，激活參與EMT的關鍵基因(snail和slug等)[52]，這解釋了NDRG1可通過snail和slug調節EMT的分子機制。已證明，NDRG1對snail和slug具有抑制作用，轉錄抑制E-cadherin[3]。因此，NDRG1可通過抑制TGF-β誘導SMAD信號轉導通路來抑制EMT。研究顯示，NDRG1在結腸腫瘤細胞中的過表達導致E-cadherin的表達上調，以此抑制EMT達到抑制腫瘤侵襲的作用[53]。Kovacevic等[48]發現，胰腺癌中NDRG1上調NEDD4L(neural precursor cell expressed developmentally downregulated 4-like)和GLI樣鋅指蛋白類似物3，并通過TGF-β通路導致兩個關鍵的腫瘤抑制蛋白上調，即人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因和SMAD4的母體。

2.3NDRG1通過Wnt-β-catenin通路抑制EMT Wnt-β-catenin通路在EMT中也起至關重要的作用[54]。NDRG1可以抑制Wnt信號通路，這可能是影響EMT的另一種機制。Chen等[3]的研究證明，通過2，2-吡啶酮-4,4-二甲基-3-縮氨基硫脲(Dp44mT)可以上調NDRG1表達水平，以此阻斷Wnt輔助受體低密度脂蛋白受體相關蛋白(low densitylipoprotein receptor related-protein，LRP)6的作用，從而抑制Wnt信號轉導。有研究證明，NDRG1減弱了Wnt在結腸癌細胞中誘導EMT的能力，從而使上皮標志物(即細胞膜結合的E-cadherin和β-catenin)表達增加，EMT調節因子(如vimentin、fbronectin、twist和slug)表達下調[55]。此外，Jin等[55]一項研究表明，NDRG1可抑制DU145前列腺癌細胞和HT29結腸癌細胞中絲氨酸33/37和蘇氨酸41處β-catenin的磷酸化，并升高質膜上非磷酸化β-catenin的水平；同時，NDRG1可通過抑制β-catenin的核轉運來調節Wnt-β-catenin通路。

總之，NDRG1可以通過調節兩種重要途徑(即TGF-β和Wnt-β-catenin)影響EMT。Liu等[4]證明了腫瘤轉移抑制基因NDRG1通過與Wnt受體LRP6相互作用，阻斷Wnt信號轉導，并通過對臨床隊列數據的分析表明，Wnt+/NDRG-/LRP+信號對于癌癥患者的無復發生存具有很高的預測價值。此外，NDRG1可抑制磷脂酰肌醇-3-激酶和Ras致癌途徑[48]。

3 MELF浸潤模式

3.1MELF浸潤模式的概念 MELF浸潤模式是近年婦科病理學家發現的子宮內膜樣腺癌的一種特殊浸潤方式，其腺癌細胞呈微囊狀、拉長裂隙樣及碎片狀浸潤到子宮肌層，腺腔內襯細胞胞質呈嗜酸性，鏡下呈現鱗狀細胞樣或扁平狀類內皮細胞樣[56]。MELF浸潤模式的判讀標準采用Murray等[56]描述的具體病理學表現：①由特征性腺體構成，這些腺體呈微囊狀、拉長結構，呈擠壓狀，有時呈裂隙樣；②腫瘤細胞具有明顯的嗜酸細胞質、鱗狀細胞或呈扁平狀和類似內皮細胞樣的細胞被覆于腺腔；③特征性腺體被水腫或黏液性基質包繞，常見炎癥細胞，主要為中性粒細胞；④MELF浸潤結構主要位于侵及子宮肌壁的癌巢。關于MELF浸潤模式的臨床病理特征研究發現，MELF浸潤模式多發生于低級別子宮內膜樣癌，與淋巴結轉移、淋巴脈管間隙浸潤及子宮深肌層浸潤等不良病理因素相關[57-59]。

3.2NDRG1和EMT與子宮內膜樣癌MELF浸潤模式的聯系 關于MELF浸潤模式發生的具體機制目前尚未明確，有學者認為，MELF浸潤模式是分化組織在形態學上的退行性改變[56]。有研究對存在MELF浸潤模式的子宮內膜樣癌腫瘤組織進行免疫組織化學檢測發現，MELF浸潤腺體中雌激素、孕激素受體表達缺失，E-cadherin、β-catenin、半乳凝素-3和Ki67的表達下調，細胞角蛋白19表達異常，而fascin、G1/S-特異性周期蛋白D1和p16的表達增加，上述這些變化更具體地將EMT與MELF浸潤模式聯系起來[60-61]。Zaino[62]觀察到同樣的結果，認為MELF浸潤模式與雌激素和孕激素受體的表達相關。Kihara等[57]在52例高級別子宮內膜樣癌患者中均未發現MELF浸潤模式；在低級別子宮內膜樣癌患者中，MELF浸潤模式與腫瘤大小顯著相關，子宮肌層浸潤>1/2，同時伴有淋巴血管間隙浸潤、淋巴結轉移、乳頭狀結構和黏液分化；免疫組織化學分析顯示，子宮內膜樣癌MELF浸潤模式中腫瘤細胞p16和p21呈陽性，而Ki67呈陰性，這表明MELF浸潤模式中腫瘤細胞出現生長停滯、細胞衰老或EMT等現象。大量研究發現，伴有MELF浸潤模式的子宮內膜樣癌經常出現包括E-cadherin、β-catenin等EMT表型的變化，提示子宮內膜癌的MELF浸潤模式與EMT可能存在某些潛在聯系[60-63]。

MELF的變化與宿主基質反應(主要是纖維粘膠樣反應)的存在和血管浸潤有關[56]。有學者研究發現，MELF 浸潤模式與子宮內膜樣癌的臨床分期、子宮肌層浸潤程度、淋巴結轉移、脈管瘤栓、淋巴血管間隙侵犯等因素相關[64]。研究表明，MELF浸潤模式與NDRG1存在一定聯系[61-63]。同時，NDRG1通過促進泛素化和蛋白酶體降解減少子宮內膜樣癌細胞中caveolin-1蛋白的表達；此外，caveolin-1的表達介導NDRG1的改變，進而使腫瘤發生EMT和轉移，并導致子宮內膜樣癌發生MELF浸潤模式[62]。

3.3其他組織中的MELF浸潤模式 有研究發現，MELF浸潤模式在其他上皮腫瘤中也可出現，如在胰腺導管內乳頭狀黏液性腫瘤的周圍也觀察到類似的組織學特征；單因素分析顯示，具有MELF樣特征的胰腺導管內乳頭狀黏液性腫瘤患者的整體生存率和疾病特異性生存率較低；同時，在高度不典型增生的胰腺導管內乳頭狀黏液性腫瘤中，MELF浸潤模式的腺體中常見SMAD4的缺失和p53的過表達[65]。在MELF浸潤模式的腫瘤組織中可以觀察到E-cadherin和β-catenin表達的變化，因此NDRG1對腫瘤細胞的上皮標志物(即膜結合的E-cadherin和β-catenin)產生抑制作用，以此抑制MELF浸潤模式，但其相關機制還需要進一步驗證。

4 NDRG1在腫瘤治療中的應用

4.1針對NDRG1的靶向治療 相關文獻報道，鐵螯合劑可消耗細胞攝取的Fe2+/Fe3+，從而導致NDRG1的表達顯著上調[44-46]。同時也有文獻報道了幾種新型縮氨基硫脲鐵螯合劑，如Dp44mT和Di-2-吡啶基酮-4-環己基-4-甲基-3-縮氨基硫脲(DpC)等，通過上調NDRG1顯示出顯著的抗腫瘤活性；特別是通過口服或靜脈給藥時，DpC明顯抑制腫瘤細胞的侵襲和遷移，且耐受性良好，無明顯的不良反應[3]。無論是在體外實驗進行細胞系培養還是在體試驗進行腫瘤移植，Dp44mT和DpC均可誘導NDRG1表達[46-49]。Liu等[4]的研究證明，NDRG1上調對于Dp44mT介導的體內轉移抑制至關重要，且顯示了NDRG1作為抗腫瘤新型藥物的化學治療靶點的重要性，并進一步證明了它們作為抑制腫瘤轉移的靶點在臨床治療中的潛力。體外研究還表明，Dp44mT可以抑制TGF-β誘導的EMT，且能夠在細胞與TGF-β共培養后維持細胞膜上E-cadherin和β-catenin的表達，Dp44mT對EMT的抑制作用可能是由于Dp44mT能有效上調NDRG1[3]。

4.2NDRG1的輔助治療功能 Kim等[46]發現，NDRG1、ERBB受體反饋抑制劑1、H19、MPZL3(myelin protein zero-like protein 3)和尿路上皮癌相關1(urothelial carcinoma associated 1，UCA1)的RNA表達在耐放射性直腸癌細胞系中高度增加；另外，短發夾RNA介導的NDRG1沉默可使直腸癌細胞在暴露于放射線時引起更多DNA雙鏈斷裂，從而使放射線對臨床相關劑量的放射致敏。Cen等[47]證明，NDRG1可以下調磷酸化信號轉導及轉錄激活因子3、磷脂酰肌醇-3-激酶、磷酸化蛋白激酶B、基質金屬蛋白酶2、基質金屬蛋白酶9，并激活人第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源基因，NDRG1的上調可能通過抑制信號轉導及轉錄激活因子3和磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號通路來顯著減少胰腺癌的發生，在手術切除后抑制胰腺癌的轉移和復發。同時，NDRG1被證明在缺氧條件下介導了對阿霉素的抗性，表明NDRG1在這些條件下對細胞存活的作用，并發現在常氧下表達NDRG1短發夾RNA的阿霉素處理的細胞凋亡減少，提示在正常氧氣壓力下乳腺上皮細胞凋亡中NDRG1的需求[66]。

5 小 結

NDRG1在正常人體中廣泛表達并存在組織特異性。而在癌細胞中，NDRG1可調節肌動蛋白細胞骨架重塑，以抑制腫瘤細胞遷移。NDRG1是抑制腫瘤侵襲和轉移的重要治療靶點。通過上調NDRG1來抑制腫瘤細胞轉移的新型縮氨基硫脲化學治療劑已在逐步開發，顯示出可以進行靶向癌癥治療的潛力。由于子宮內膜樣癌的EMT導致其發生MELF浸潤，進而導致癌癥轉移，因此可以靶向NDRG1進而通過TGF-β通路或Wnt-β-catenin通路抑制腫瘤的發生、發展，抑制腫瘤細胞的增殖、侵襲和遷移。總之，為了將NDRG1作為藥物靶標開發，需要進行廣泛的研究，以了解該蛋白質抑制腫瘤侵襲和轉移的活性，并明晰其詳細的分子機制。