針刀干預兔膝骨關節炎后血清中TGF-β1和Smads蛋白的差異性表達

楊郁鵬，趙季宇，李佳茹，曹韻茗，閆 婧，郝重耀，金曉飛

（山西中醫藥大學，山西 晉中030619）

膝關節骨性關節炎（knee osteoarthritis，KOA），是一種常見的膝關節退行性損傷疾病，多發于中老年人群。近些年的發病率呈上升趨勢，成為困擾人民生活的重要疾病之一［1］。發病時常伴有膝部的疼痛、腫脹，甚至畸形等癥狀。大量的臨床實踐已經表明針刀治療膝關節骨性關節炎有良好的療效，但是治病機理尚未完全明確［2］。有研究表明，TGF-β1/Smads信號轉導通路與多種軟組織損傷性疾病相關，如KOA等。本研究通過針刀療法治療KOA后，取血清進行轉化生長因子β1（TGF-β1）和Smad蛋白的相應檢測，以探究針刀的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 40只6月齡成年清潔日本大耳白兔，雌雄各半，體質量（2.25±0.1）kg，實驗動物由北京市昌揚西山養殖場提供，中國食品藥品檢定研究院檢測，許可證號SCXK（京）2016-0007，飼養于山西中醫藥大學實驗中心清潔級動物實驗室。溫度20℃，濕度50%～55%，單籠飼養，自由飲水攝食。

1.1.2 材料與試劑 一次性無菌針灸針（0.18 mm×25 mm）、一次性毫針刀（0.35 mm×30 mm）：北京中研太和醫療器械有限公司；華佗牌電子針療儀（SDZ-II）：蘇州醫療用品有限公司；樹脂石膏繃帶：浙江安吉華埠實業有限公司；離心機（HC-3018）：安徽中科中佳科學儀器有限公司；兔TGFβ1酶聯免疫分析試劑盒：上海廣銳生物科技有限公司；兔磷酸化信號轉導分子2（P-SMAD2）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒：上海廣銳生物科技有限公司；兔磷酸化信號轉導分子3（P-SMAD3）酶聯免疫分析（ELISA）試劑盒：上海廣銳生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物造模 適應性喂養1周后將6月齡日本大耳白兔40只，隨機分為空白組、模型組、電針組、針刀組，每組10只。空白組只進行飼養，其余各組采用石膏繃帶對兔左后肢伸直位制動。采用左后肢伸直位固定制動法進行模型的建立［3-5］，除空白組外的其余各組制動達25 d以上，建立KOA模型，本課題組實驗前期已經驗證了實驗模型的穩定。造模期間動物膝關節無破損、無化膿癥狀，動物無死亡，實驗數據完整無脫落。

1.2.2 治療方法 空白組：只進行常規飼養，不進行其他人為的干預措施。模型組：進行造模后常規飼養。電針組：造模成功后1周，取膝部穴位陽陵泉、陰陵泉、內膝眼、外膝眼，行電針疏密波刺激，頻率為2/100 Hz，強度為3 mA，20 min/次。隔日治療，每周3次。針刀組：造模成功1周后，確認模型的穩定，以內側、外側副韌帶，髕韌帶兩端連接點以及中點為進針點，常規消毒，針刀刀口線與韌帶纖維方向平行，垂直進針后旋轉刀體在膝部損傷處掃散松解，出血后按壓止血。每周1次，治療3次。

1.2.3 取材 干預治療結束后，行腹主動脈取血，取血5 mL，緩慢注入離心管，3000 r/min，離心20 min，取上清液。用ELISA方法檢測血清中TGF-β1和p-Smad2以及p-Smad3的含量。

1.3 統計學方法

數據用SPSS 24.0統計軟件進行分析。實驗數據均以均數±標準差（±s）表示，計量資料用單因素方差分析，組間比較用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 治療后各組血清中TGF-β1含量的變化

與空白組相比，模型組TGF-β1水平明顯下降（P＜0.01）。與模型組相比，電針組和針刀組TGF-β1水平顯著上升（P＜0.05）。與電針組相比，針刀組TGF-β1水平顯著上升（P＜0.05）。結果見表1。

表1 各組血清中TGF-β1含量比較 （n g/L，±s）

表1 各組血清中TGF-β1含量比較 （n g/L，±s）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01；與電針組比較，3）P＜0.05

組別 n TGF-β1空白組 10 183.93±8.15模型組 10 169.05±16.841）電針組 10 175.93±6.29針刀組 10 188.20±4.742）3）F值 7.021 P值 0.001

2.2 治療后各組血清中p-Smad2和p-Smad3含量的變化

與空白組相比，模型組p-Smad2和p-Smad3表達顯著上升（P＜0.01）。與模型組比較，電針和針刀組p-Smad2和p-Smad3表達水平顯著下降（P＜0.01）。與電針組相比，針刀組p-Smad2和p-Smad3表達水平顯著下降（P＜0.01）。結果見表2。

表2 各組血清中p-Smad2和p-Smad3含量比較 ng/mL，±s（ ）

表2 各組血清中p-Smad2和p-Smad3含量比較 ng/mL，±s（ ）

注：與空白組比較，1）P＜0.01；與模型組比較，2）P＜0.01

組別 n空白組 10模型組 10電針組 10針刀組 10 F值P值p-Smad2 p-Smad3 1.86±0.29 1.86±0.28 2.31±0.051） 2.32±0.051）2.21±0.061） 2.20±0.071）2.07±0.131）2） 2.08±0.131）2）13.564 13.226 0.000 0.000

3討論

膝關節骨性關節炎，中醫又稱“痹病”“鶴膝風”，作為一種慢性退行性關節病，其疾病的發展可由最初的韌帶以及軟組織損傷到后來的半月板破裂甚至最后的骨的病變，病情逐漸加重。炎癥的范圍也會從病變局部發展到全膝繼而到最終隨血液運行全身。有研究表明，當關節部發生損傷時，炎性的表達會增加，會對產生修復性的因子的表達發生限制與阻礙，導致正常表達的障礙，使得損傷的自我修復進程緩慢，甚至長時間的表達障礙會使得病程遷延持續，進而使得組織分解，生理功能喪失，最終導致不可逆危害［6］。

在人體正常的生理功能中，研究表明有眾多信號轉導通路的參與，在軟骨等組織損傷中TGF-β1/Smads通路的表達參與最為重要。TGF-β1作為一種多功能轉化生長因子，在組織的生長、發育、表達過程中廣泛參與轉化，對肌體產生的損傷進行修復［7］。另外TGF-β1還可以激活帶動下游的相關因子表達，使得組織的修復構建完整。Smads蛋白作為TGF-β1/Smads通路的下游蛋白［8］，其表達調控通過上游的TGF-β1刺激得以激活。Smad2、Smad3占據Smads蛋白的重要成分，其能否正常表達，關系著軟骨等組織的功能的發揮與否。目前，多數學者認為提高TGF-β1的蛋白的表達含量，可以有效改善膝骨關節炎中破壞的軟骨細胞以及細胞基質的合成，進而緩解組織的損傷。楊帆等［9］利用補腎通絡方提高KOA兔的TGF-β1的蛋白的表達含量，可以有效抑制軟骨細胞的損傷。吳紅等［10］發現激活TGF-β1/Smad 2/3途徑，可以促進細胞基質成分的合成和分泌，緩解椎間盤的退變。乙軍［11］在小鼠關節炎中發現注射PARP-1抑制劑可降低膝骨關節中MMP-13的表達，繼而影響Smad2、Smad3的磷酸化水平，使得膝骨關節炎得以緩解。近些年的研究表明，在多種疾病中均可以從血液中檢測出相關因子的變化。因此認為當發生KOA時，血液作為一種周身循環的載體，可以準確反映人體局部的病變，關注其中相關指標的變化可能為疾病的檢測和治療提供一種全新的思路。

針刀療法將傳統針刺以及現代外科手術有效結合，在充分發揮針灸作用的同時，避免了外科手術的創傷。作為一種中醫現代微創手術，針刀在臨床的實踐中得到了廣泛的認可，尤其是在軟組織損傷疾病中充分發揮了其特有的優勢，它通過勾割等手法，可以更好地松解組織的粘連，分解局部的結節、骨贅等，進而改變關節的不均勻受力，使得由軟組織病變導致的失衡得以恢復正常。本研究采用針刀和針灸對KOA疾病進行干預，發現針刀干預后，動物的膝關節活動明顯改善，初次干預后膝部就出現了小范圍的屈曲，但針灸尚未出現。行3次針刀干預后，膝部已經可以大范圍的伸縮屈曲，且膝部關節的血供情況良好，動物活動自如。針刺治療3周后膝部也出現了小范圍的活動，但效果遠不如針刀明顯。因此對不同組別動物血液中的TGF-β1、p-Smad2、p-Smad3的含量進行檢測，發現其也出現了明顯改變。由此可以推斷針刀的作用不僅僅局限于對損傷部位的刺激，還可以通過對損傷處的松解，有效地刺激TGF-β1/Smads信號轉導通路，使得血液中TGF-β1含量上升，p-Smad2、p-Smad3的表達下降。由此也可以進一步推斷針刀的作用機制可能是在對膝周病變組織松解的同時，也對相關的信號通路的表達進行了調控，繼而使得血液中的相關因子也隨之發生改變。

本研究通過對針刀作用下部分蛋白因子的表達進行檢測，有效證明了針刀的作用可以深入因子甚至分子蛋白水平，但實驗檢測時因子的數量有限，且只選取了一條信號通路上的因子，尚未可以完全證明針刀的作用機制，有待后期的實驗可以在TGF-β1/Smads信號轉導通路的基礎上進一步深入研究，為針刀治病機制的闡述提供相關的理論以及實驗依據。