CHD心氣虛證與心肌細胞Ca2+濃度變化的相關性研究

王舒生，馬月香

（山東中醫藥大學中醫學院，山東 濟南250355）

冠心病（coronary artery heart disease，CHD）是臨床上最常見和多發的疾病之一，是指因冠脈血管發生動脈粥樣硬化病變，使心血管管腔逐漸狹窄甚至阻塞，增大了血流阻力，引起心肌及其細胞組織的缺血、缺氧甚至壞死，造成心肌的能量代謝障礙，從而導致心功能減退的一種心臟疾病［1］。而能量代謝的實質其實是中醫學“氣”的功能范疇［2］，可見心功能的減退與“氣”的虧虛密切相關，多項現代研究亦表明，心氣虛證是CHD的主要證型［3-4］。研究發現，心功能的減退與心肌細胞Ca2+濃度的變化密切相關［5］。然而，當前對于CHD心氣虛證與心肌細胞Ca2+濃度變化之間關系的相關報道較少，亦未見嚴格設計下的相關實驗研究［6］。因此，課題組擬通過文獻查閱和實驗研究的方法來探討心肌細胞Ca2+濃度的變化與CHD心氣虛證發病的相關性，旨在揭示其微觀機制，為CHD心氣虛證的臨床治療提供理論依據。

1 CHD心氣虛證和心肌細胞Ca2+濃度變化的相關性分析

1.1 心肌興奮收縮藕聯功能的異常與心肌細胞Ca2+濃度變化的相關性

現代研究發現，心肌興奮收縮藕聯功能的異常是CHD主要的病理變化之一［7-8］，而Ca2+參與了心肌肌肉收縮-舒張期間的全過程。Ca2+在機體組織的細胞內分布廣泛，是機體細胞之內最重要的信使分子之一，機體細胞對其濃度變化異常敏感，這也使得Ca2+濃度的變化會迅速導致機體細胞內信號傳導的變化，從而對機體組織造成一定程度的損傷，且這種傳導途徑的異常在疾病的病理變化中起著至關重要的作用［9］。當Ca2+滲入機體心肌細胞內時，肌漿網（SR）內部的RyR2通道會因為RyR2受體的激活而開放，進而SR會釋放出大量的Ca2+［10］。SR是一種細胞內的膜網絡，其圍繞著收縮結構細胞，不僅可以貯存Ca2+，而且可以在心肌的收縮-舒張期間保持Ca2+濃度的動態平衡［11］。當心肌細胞Ca2+的濃度于短時間內突然升高之時，便會引起心肌肌絲的迅速收縮，使心臟舒張期快速結束，從而過早的進入收縮期。此時，高濃度的Ca2+會被SR上的鈣泵（SERCa2）和細胞膜上的鈉鈣交換體（NCX）迅速清除掉，令心肌收縮機制鈍化，從而引發心肌快速舒張，使心臟又迅速地進入舒張期。由此可以看出，Ca2+轉運貫穿于心肌興奮-收縮藕聯的整個過程當中。Ca2+濃度的變化常常可以反映出心臟功能的改變，有研究發現，SR上RyR2基因的異常表達會引起機體細胞胞漿內的游離Ca2+濃度失去平衡，進而導致心肌的收縮、舒張功能異常，最終引發心肌興奮收縮藕聯功能的異常［12］。研究發現，胞漿內Ca2+濃度的改變能夠明顯影響心肌的舒張功能，當其濃度下降時，由于大量的鈣離子被轉運到了胞漿之外，因而胞漿內剩余的鈣離子存儲量大量減少，所以釋放的鈣離子減少，從而降低了心肌的收縮力，相應的，亦降低了心肌舒張力，進而導致心肌興奮收縮藕聯功能的異常［13］。

1.2 心肌損傷與心肌細胞Ca2+濃度變化的相關性

心肌損傷是促發CHD重要的先決條件之一，當心肌受損時，會引起ATP酶活性的降低，而細胞膜上的ATP酶又是維持細胞內環境穩定的基礎，可逆電化學梯度進行Ca2+的轉運［14-15］。ATP酶活性的降低會引起心肌細胞膜結構的損害，從而使得再灌注期間其生成的氧自由基會引發肌膜脂質的過氧化作用，進而加重心肌細胞膜的損傷，導致心肌細胞膜增加了其對Ca2+的通透性，此時心肌細胞Ca2+內流造成的鈣超載又會加重心肌細胞的損傷，甚至凋亡，從而影響心功能的正常發揮，造成心臟能量代謝的異常和負荷的加重，且隨著心功能的降低，心肌損傷的程度又會隨之逐漸加重，形成心功能降低與心肌損傷相互影響的惡性循環［16-17］。趙強等［18］研究表明，導致慢性心力衰竭心功能降低的重要因素之一是Ca2+通道密度的增加，使胞漿內Ca2+濃度升高，從而造成心肌損傷。Zuzana K等［19］研究表明，心功能降低時，心肌細胞內鈣離子的釋放量顯著降低，從而使心肌收縮力下降，肌漿網鈣離子舒張期滲漏增加，導致胞漿內Ca2+濃度升高。以上皆說明了心肌細胞Ca2+濃度的改變與心肌損傷密切相關。臨床研究表明，鈣拮抗劑（即鈣通道阻滯劑）對心血管平滑肌有顯著的擴張和松弛作用，能夠阻斷機體心血管平滑肌上的Ca2+通道，從而抑制細胞外Ca2+的內流，降低細胞內Ca2+的濃度，使心肌耗氧量有效降低，顯著改善心肌缺血和壞死的情況［20］。可見心肌細胞Ca2+濃度的升高與心肌損傷密切相關。

1.3 動脈粥樣硬化程度與心肌細胞Ca2+濃度變化的相關性

CHD患者的冠狀動脈內存在粥樣硬化的斑塊，當心氣虛引起心肌缺血等心功能損傷時，粥樣硬化斑塊便極易破裂，從而導致內膜受損，隨即激活凝血系統，而Ca2+在凝血的全過程中作為凝血因子Ⅳ起到了非常重要的作用。Ca2+在參與此凝血的過程中會有一定的消耗，從而使心血管中血清鈣的含量降低，導致“鈣反常”現象的發生。血清鈣含量降低時，不僅可以增加血管平滑肌的跨膜內流，還可以使增加甲狀旁腺激素的分泌，從而使心肌細胞胞漿內Ca2+濃度的升高，造成了血管中血清鈣含量降低，胞漿內Ca2+濃度升高的反常現象。當冠脈平滑肌細胞處于其胞漿內Ca2+濃度升高的負荷之下時，不僅會增加其收縮敏感性，甚至會誘使其痙攣，從而促使冠狀動脈管壁的粥樣脂質沉著，導致加重動脈粥樣硬化的程度，進而加重CHD患者的病情［21］。另外，吳瑞杰［22］研究亦表明，CHD患者體內血清鈣的含量較正常人低，通過補鈣使血鈣含量升高能有效降低血管張力，抑制血管平滑肌跨膜內流的增加，從而降低胞漿內Ca2+的濃度，有效控制CHD的病情。由此可知，心肌細胞Ca2+濃度的升高可加重動脈粥樣硬化的程度。

綜上所述，CHD心氣虛證的主要病理變化和影響因素等均與心肌細胞Ca2+濃度的變化密切相關。由此，課題組提出科學假說：“心肌細胞Ca2+濃度的升高既是CHD心氣虛證發病的關鍵因素，又能加速其病情進展”。并據此進行了嚴格設計下的實驗研究，以揭示CHD心氣虛證與心肌細胞Ca2+濃度變化的相關性。

2 材料與方法

2.1 實驗材料

2.1.1 實驗動物 SPF級雄性Wistar大鼠70只，體質量（200±20）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SCXK（京）2016-0001。實驗動物飼養于山東中醫藥大學動物實驗室。溫度為（21±3）℃，濕度為（50±10）%，每日光照12 h，自由進食、飲水。

2.1.2 益氣活血方藥的制備 將購自濟南市歷下區人民醫院的中藥飲片，以3∶2∶2∶1的比例分別稱取人參、丹參、黃芪、川芎飲片，飲片與水的比例為1∶5。步驟：①中藥飲片浸泡30 min；②武火加熱沸騰后保持其微沸狀態轉文火慢煎20 min；③濾過藥液，藥罐中留下藥渣，加3.3倍量的水；④重復②的步驟，然后合并兩次的濾過藥液，靜置于室溫下待其濃縮；⑤離心取上清液，定容至生藥1.8 g/mL，-20℃凍存待用。

2.1.3 實驗試劑和儀器 高速低溫離心機（型號MICROMAX RF，生產廠家，Thermo IEC美國），超低溫冰箱（型號725，生產廠家，Thermo Forma美國），手術包（山東中醫藥大學附屬醫院）；左旋硝基精氨酸L-NNA（Sigma公司）；鹽酸地爾硫卓（山東中醫藥大學附屬醫院），Olympus-Au5800，組織勻漿器，全自動生化分析儀。

2.2 實驗方法

2.2.1 造模 大鼠適應性飼養7 d后，先將其隨機分為7組（10只/組），其中1組為空白對照組，1組為假手術組（行冠脈穿線術但不進行左冠狀動脈結扎術），其余均為手術組。手術組大鼠采用“左冠狀動脈結扎術加升壓藥”法制備冠心病心氣虛大鼠模型。麻醉大鼠，在無菌情況下先行氣管切開術，再行氣管插管術，手術期間以動物呼吸機輔助其呼吸。剔除大鼠胸腹部的毛發，消毒手術區皮膚。隨后沿左鎖骨中線縱行切開皮膚2 cm，于第四、五肋間打開胸腔，剪開心包，輕壓右邊胸廓，迅速將心臟擠壓出來。在左冠狀動脈前降支中上1/3處行動脈結扎術后放回心臟。最后逐層關胸，待大鼠蘇醒后拔氣管插管。CHD大鼠模型評價標準為：24 h后心電圖ST段下移和T波改變。術后每只大鼠肌注青霉素10萬U/d以預防感染，并于常規飼養7 d后，手術組大鼠以左旋硝基精氨酸15 mg/（kg·d）兩次腹腔注射，持續4周，空白對照組大鼠和假手術組大鼠則以生理鹽水（1 mL/d）腹腔注射，持續4周。

去除術中及術后死亡的大鼠，術后將造模成功的大鼠進行常規喂養7 d，手術組大鼠給予左旋硝基精氨酸15 mg/（kg·d），3周內每天分兩次腹腔注射，空白對照組大鼠和假手術組大鼠則給予生理鹽水（1 mL/d）腹腔注射，持續3周。

2.2.2 分組與給藥 稱重后，將手術組大鼠按體質量分成隨機模型組、益氣活血方低劑量組［9 g/（kg·d）］、益氣活血方中劑量組［13.5 g/（kg·d）］、益氣活血方高劑量組［18 g/（kg·d）］、鹽酸地爾硫卓組［0.05 g/（kg·d）］5組，每組8只。各給藥組將藥物調至相應體積后灌胃給藥（空白對照組和假手術組腹腔注射等體積生理鹽水），持續2周。于實驗第46天麻醉各組大鼠（10%水合氯醛250 mg/kg），待大鼠麻醉后行心臟剝離術，并將剝離出的心臟迅速貯存于液氮中，待實驗結束后將其轉入-80℃的冰箱中保存待測。

2.2.3 心肌細胞Ca2+濃度測定 全自動生化分析儀測定心肌細胞Ca2+濃度變化：灌胃后46 d于麻醉下開胸，取各組大鼠心臟，洗凈后在冠狀動脈結扎處切取部分心肌組織塊，按1∶9的比例將心肌組織塊和生理鹽水配制后勻漿、離心、取上清液，隨后用全自動生化分析儀測定心肌細胞Ca2+的濃度。

2.3 統計學方法

統計軟件選用SPSS 21.0進行數據的處理分析。計量資料以均數±標準差（±s）來表示，并進行單因素方差分析，P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

與空白對照組比較，模型組大鼠心肌細胞Ca2+濃度升高明顯（P＜0.05）。與模型組比較，益氣活血方高劑量組大鼠心肌細胞Ca2+濃度降低明顯（P＜0.01），益氣活血方中劑量組與鹽酸地爾硫卓組大鼠心肌細胞Ca2+濃度均有降低，且作用相當（P＜0.05）。結果見表1與圖1。

表1 藥物干預對各組大鼠心肌細胞Ca2+濃度變化的影響（±s）

表1 藥物干預對各組大鼠心肌細胞Ca2+濃度變化的影響（±s）

注：與空白對照組比較，1）P＜0.05，2）P＜0.01；與模型組比較，3）P＜0.05，4）P＜0.01

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圖1 藥物干預對各組大鼠Ca2+濃度的影響

4 討論

CHD的病名雖未載于中醫經典古籍之中，但依據其在臨床上表現出來的癥狀與證候特點等因素，現代研究多將其歸屬于“胸痹”“真心痛”等范疇［23］，且古代醫家對其論述頗豐，如《靈樞·五邪》中說：“邪在心，則病心痛”，《素問·舉痛論》中說：“心痹者，脈不通”，認為心氣虛無力推動血運，血流不暢而致瘀，不通則痛，是CHD的主要病因，故為心痹之病。《金匱要略·胸痹心痛短氣病脈證治》中強調“陽微陰弦，即胸痹而痛，所以然者，責其極虛也”，上焦心陽之氣不足，陰血瘀滯而現弦象，因而胸痹心痛的脈象表現為“陽微陰弦”。

相關研究表明，心氣虛是CHD的主要證型和病理因素，氣虛血瘀所導致的心脈“不榮則痛”與“不通則痛”是CHD發病的病理基礎［24-25］。因此，益氣活血、化瘀通絡是CHD的基本治則。

本研究所采用的益氣活血方是全國著名名老中醫張珍玉教授經60余年臨床經驗總結所得的經驗方，其基本方的組成為人參、黃芪、川芎、丹參。方中以人參為君，大補元氣之余，亦能充養心氣，培養脾氣，從而發揮復脈固脫之效。黃芪為臣，補中益氣、固攝血液。二藥相合，既可充養心、脾二經之氣，又寓氣旺血暢之意。川芎、丹參共為佐使之藥，川芎行氣活血、開散郁結；丹參通經活血、祛瘀止痛，二藥既可共助氣運以行血，又可共化瘀血以消滯。四藥相合為用，組方精煉，經臨證加減，在臨床上取得了良好的療效。所以，通過益氣活血方“以方測證”“以方治證”來探尋CHD心氣虛證與心肌細胞鈣離子濃度變化的相關性，及其對CHD臨床治療的指導作用，必然是有效的途徑之一。

本研究結果顯示，模型組大鼠心肌細胞Ca2+濃度較空白對照組明顯升高，與模型組比較，各治療組大鼠心肌細胞內的Ca2+濃度皆發生了改變，益氣活血方高、中劑量組與鹽酸地爾硫卓組大鼠心肌細胞Ca2+濃度均明顯降低，其中益氣活血方高劑量組Ca2+濃度的降低最為顯著。

從中醫學的角度來分析，心屬火，主血脈，《易經》離卦（）與心藏象相應［26-27］。離卦之象為一陰爻藏于二陽爻之內，陰斂于陽，陽護于陰，正如心陽顧護心陰，心氣調控心血，可見心陽之氣是推動血運的基本動力，而充沛的心氣則是心臟搏動正常的基礎，心氣充足方能使血液在脈中循流不息，不滯于脈管，不溢于脈外。而心肌興奮收縮藕聯工作過程的本質其實就是心氣推動心血注于脈中時所產生動能的過程。前期研究提到能量代謝屬于“氣”功能的范疇，當心氣虧虛之時，心臟能量代謝的過程亦必受影響，即能量代謝的動能不足，這種動能不足會使心臟貯存、產生及釋放能量的各個環節發生障礙，從而導致其收縮或舒張功能受到損害，最終導致心肌興奮收縮藕聯功能的異常［28］。

中醫學認為“氣為血之帥”“氣行則血行，氣滯則血瘀”。若心氣虧虛，無力推動血行，可致血流不暢，血運遲緩，日久則血行滯澀，脈道失于通利，血脈瘀阻不通，既可使各臟腑失去血液的濡養而功能異常，引起“不榮則痛”的疼痛癥狀，又可因脈道瘀阻使心臟負壓過重，造成其搏動乏力和心肌能量代謝的異常，從而導致心肌缺血、缺氧，若是治療不當或延誤，隨著氣虛程度的進行性加重，甚至會造成心肌的局部壞死［1］，可見心氣虧虛能導致心肌損傷。

另一方面，中醫學理論中，固攝是“氣”的主要功能之一，其不僅表現在對血液、汗液、唾液、尿液等的約束與調控，亦表現在對各個臟腑經絡之氣的收攝之中。《素問·生氣通天論》中說：“凡陰陽之要，陽密乃固……陽強不能密，陰氣乃絕”，人體的陽氣是生命之基，若是陽氣虛衰，必然會使其固攝失司，陰血和陰津便會損耗，甚至衰竭，從而導致疾病的發生。就CHD而言，心氣的虧虛自然會影響其固攝之功，當粥樣硬化斑塊破裂，內膜受損之時，必然會因為心氣失于固攝，造成凝血障礙，導致內膜受損得不到有效的修復，從而加重動脈粥樣硬化的程度。

從本研究結果可以看出，心肌細胞Ca2+濃度的升高可通過造成心肌興奮收縮藕聯功能的異常、心肌損傷和加重動脈粥樣硬化的程度這三個方面來引發CHD心氣虛證，并能加重CHD心氣虛證患者的病情，說明心肌細胞Ca2+濃度的變化可以作為CHD心氣虛證的評價指標之一，CHD心氣虛證的證候實質在一定程度上，可以用心肌細胞Ca2+濃度的變化來揭示。