不同成熟期金柑果實酚類物質含量的動態變化規律

陳源 潘鶴立 尤有利 吳玉華 潘東明 余文權

摘?要：探討金柑果實發育過程中總酚含量、總黃酮含量及總酚酸含量的動態變化差異。以尤溪金柑品種金彈為試驗材料，對不同生長發育期金柑果實中總酚含量、總黃酮含量及總酚酸含量進行檢測分析。結果表明：隨著成熟度的增加，花后55～65 d金柑果實中總黃酮含量和總酚酸含量隨著成熟度的增加而急劇減少，花后85 d左右變化平緩，到接近成熟的花后125 d左右，黃酮含量和酚酸含量小幅上升后下降;果皮中的黃酮含量和酚酸含量大于果肉。金柑果實含有豐富的酚類物質，隨著果實的生長發育呈現逐漸降低的趨勢;金柑果實總酚與類黃酮含量呈顯著正相關;金柑幼果比成熟果具有更高的酚類物質和更強的抗氧化能力。

關鍵詞：金柑;果實;酚類物質;不同成熟期

中圖分類號：S666?文獻標志碼：A?文章編號：0253-2301（2020）11-0007-05

DOI： 10.13651/j.cnki.fjnykj.2020.11.002

Abstract： The dynamic changes of total phenol content， total flavonoid content and total phenolic acid content in Fortunella crassifolia during the fruit development were studied. The contents of total phenols， total flavonoids and total phenolic acids in Fortunella crassifolia fruit at different growth stages were determined and analyzed by using the variety of kumquat in Youxi as the experimental material. The results showed that： the contents of total flavonoids and total phenolic acids in the fruit of kumquat decreased sharply with the increase of maturity at 55-65 days after flowering， and changed gently at around 85 days after flowering， and then at about 125 days after flowering， the flavonoid content and phenolic acid content increased slightly and then decreased after 125 days after flowering; The flavonoid content and phenolic acid content in the pericarp was higher than that in the flesh. The fruit of kumquat was rich in phenolic substance and it tended to decrease with the growth and development of the fruit. The content of total phenols and flavonoids in the fruit of kumquat was positively correlated. The young fruit of kumquat had higher phenolic substance and stronger antioxidant ability than the ripe fruit.

Key words： Fortunella crassifolia; Fruit; Phenolic substance; Different mature period

柑橘原產于我國，有4000多年的栽培歷史。柑橘是世界第一大果樹品種，種植面積和產量在世界百果中均居首位[1]。我國柑橘資源豐富，優良品種繁多，與其他水果相比，存在橘皮和種子等廢料多的問題。柑橘加工業產生的大量皮渣如果僅作為動物飼料或肥料是不能完全消耗掉，這對生態環境造成巨大的影響[2]。金柑Fortunella crassifolia Swingle屬蕓香科金柑屬植物，與柑橘屬、枳屬同為蕓香科植物，是我國特有的柑橘類型。近年來，隨著避雨栽培技術的推廣，金柑產業發展迅速。尤溪金柑作為金柑中的一個優良品種獲得良好的市場份額，但其在生產過程中疏除的落花落果常被作為廢棄物丟棄，未能被充分利用，造成資源的浪費。金柑果肉和果皮中均含有多種黃酮類等生物活性成分，金柑中黃酮有良好的抗氧化、促進胃腸道功能、抗油脂化等作用[2-6]。近年來，已有研究人員對柑橘皮中的酚酸類物質進行了深入研究，但大多數是對柑橘不同器官和不同品種的酚類物質研究[7-10]，尚未對不同發育期的金柑活性物質進行研究。本研究對金柑果實不同生長發育期酚酸和黃酮的含量進行分析，分析酚類物質果實成熟度之間的相互關系，同時對不同生長發育期金柑果實各個組織部位的主要黃酮類成分含量進行測定，旨在為金柑果實的深加工及綜合利用提供理論依據。

1?材料與方法

1.1?供試樣品及制備

試驗所用金柑果實采自福建省尤溪縣的金彈Fortunella crassifolia Swing品種鮮果。在金柑第1次開花（6月15日）時，對其進行標記，分別在花后55、65、85、105、115、125、135 d采集，果實中等大小。采摘后立即于-40℃冷凍保存。

制備樣品時將冷凍果實解凍，用清水洗凈，手工剝皮將其分為果皮、果肉兩部分，然后分別打漿均勻，然后取50～100 g 于凍干機冷凍干燥48 h，凍干品經粉碎過60 目篩，儲存于-40℃備用。

1.2?試劑和儀器

11種化合物標準品，包括沒食子酸Gallic acid綠原酸chlorogenic acid、咖啡酸caffeic acid、蘆丁rutin、香豆酸p-Coumaric acid、阿魏酸ferulic acid、芥子酸sinapic acid均購自美國Sigma公司;乙腈、乙酸為色譜純（Merck德國公司）;超純水為自制;其他試劑均為國產分析純。

L2000型高效液相色譜儀（日本日立公司），配有紫外檢測器、四元泵、柱溫箱、自動進樣器等;Sartorius BS224S分析天平（德國賽多利斯公司）;TU1810紫外分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）;BPG9140A電熱鼓風干燥箱（上海一恒科技有限公司）; FW100高速萬能粉碎機（天津泰斯特儀器有限公司）;ALLEGRATM64R高速冷凍離心機（美國BECKMAN公司）。

1.3?試驗方法

1.3.1?樣品溶液的制備?先將金柑樣品果肉與果皮分離冷凍干燥過60目備用;0.1 g樣品用1 mL 70%甲醇混合10 min室溫，9000 r·min-1，15 min 4℃離心，重復3次，合并上清液于容量瓶中，用甲醇定容;用0.45 μm微孔濾膜過濾備用。

1.3.2?總黃酮含量的測定?稱取10 mg蘆丁，用70%甲醇溶解后定容至100 mL。之后將蘆丁溶液用70%乙醇稀釋成0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1，各吸取1 mL于試管中，加70%乙醇1 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉，6 min后加入0.3 mL 10%亞硝酸鋁，6 min后再加入2 mL 2 mol·L-1氫氧化鈉，10 min后于分光光度計波長510 nm下測吸光值OD。以吸光值為縱坐標，蘆丁標準溶液的濃度為橫坐標繪制標準曲線。

從提取液中吸取1 mL，加入1 mL 70%甲醇，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉，靜置6 min后，加入0.3 mL 10%亞硝酸鋁，再靜置6 min后，加入2mL 2 mol·L-1氫氧化鈉，放置10 min后在510 nm下測吸光值。

1.3.3?總酚含量的測定?稱取10 mg沒食子酸，用70%乙醇溶解后定容至100 mL。之后將沒食子酸溶液用70%乙醇稀釋成0、5、10、15、20、25、30、35、40、45、50 μg·mL-1，在避光條件下，取200 μL過濾后的樣品提取液，加入2.5 mL 10%（v/v）福林酚溶液，充分搖勻，在室溫下培養2 min，加入質量濃度為75 g·L-1的Na2CO3溶液2 mL，充分混勻后用蒸餾水定容至10 mL刻度線并振蕩混勻。50℃水浴20 min，快速冷卻至室溫，以相應試劑作空白，在最大吸光值765 nm 波長處測定吸光值。用沒食子酸作標樣制作標準曲線，結果以每克干樣所含沒食子酸總量（mg·g-1）表示。

精確移取提取液1 mL，按照繪制標準曲線的方法進行顯色，于最大吸收波長765 nm處測吸光度，計算金柑幼果總酚含量。金柑幼果總酚質量濃度計算方法為：

A=0.6185C-0.1679

總酚得率（%）=（A+0.1697）×V/1.5 m

式中：A為試樣測定時所得的吸光度;

C為沒食子酸式樣的測定濃度（μg·mL-1）;

V為待測液體積（mL）;

m為試樣的質量（g）。

1.3.4?總酚酸含量的測定?優化后的色譜條件為色譜柱：MerckLiChrospher_100RP18e（250 mm×4.0 mm）;流動相：2%乙酸水溶液和乙腈，流速：0.8 mL·min-1，進樣量：10 μL，柱溫：30℃，檢測波長：280 nm，同時檢測7種酚酸類化合物。流動相梯度洗脫程序見表1。

1.4?統計分析方法

試驗數據采用SPSS 13.0 軟件進行統計分析。其中，主成分分析調用Factor 過程，以總酚酸含量的測定歐氏距離測距，用最長距離法（Furthest neighbor）測量類間距，進行聚類分析。

2?結果與分析

2.1?不同生長發育期金柑果實中總黃酮含量變化

從圖1可以看出，金柑果皮和果肉中總黃酮含量隨著果實的成熟不斷下降，分別從花后55 d到花后135 d含量平穩下降，其中果皮中總黃酮含量在花后115 d到花后125 d期間急速下降。果皮中總黃酮含量在花后45 d時最高，達到19.50 mg·g-1，果肉中總黃酮含量在花后55 d達到12.95 mg·g-1。金柑果實中總黃酮含量表現為果皮>果肉。

2.2?不同生長發育期金柑果實中總酚酸含量變化

不同生長發育期的金柑果皮中總酚酸含量變化趨勢如圖2。從圖2可以看出，金柑果肉和果皮總酚酸含量均呈現下降-上升-下降的趨勢，其中果皮總酚酸含量在花后125 d上升到最高后開始下降，果肉總酚酸含量在花后115 d上升到最高后開始下降。

2.3?不同生長發育期金柑果實中總酚含量變化

從圖3可以看出，果皮和果肉中總酚含量隨著果實的成熟，不斷下降，分別從花后55 d到花后135 d含量平穩下降，其中果皮中總酚含量在花后115 d到花后125 d期間急速下降。果皮中總酚含量在花后55 d時最高達到19.57 mg·g-1，果肉中總酚的含量在花后55 d達到13.36 mg·g-1。金柑果實中總酚含量表現為果皮>果肉。

2.4?聚類分析

分別對金柑果皮和果實不同生長發育期14個樣品的總酚、總黃酮和總酚酸含量進行Q型和R型聚類分析，以每個成分的含量作為變量，由SPSS 13.0軟件利用歐氏距離作為樣品的測定進行聚類分析，結果如圖4、5。Q型聚類結果（圖4）顯示：不同生長發育期的金柑果皮被分為3類：第1類是花后55 d、花后65 d、花后85 d和花后105 d，其中55 d的代謝物含量與其他3個時間點差異較大;第二類是花后115 d、125 d和135 d的果肉。聚類分析結果（圖5）表明，花后105 d到115 d是金柑果實總酚、總黃酮和總酚酸代謝變化的重要時期。果肉中黃酮和酚類物質在花后65～105 d變化不大，花后115～135 d變化對比花后105 d前的代謝物含量變化更大。R型聚類是對黃酮和酚酸含量指標進行聚類。從圖4可知，金柑果皮和果肉中的聚類分析大體一致，果皮中各成分含量之間的差異較果肉的歐氏距離大。金柑果肉和果皮總黃酮和總酚的變化趨勢一致，總酚酸果皮和果肉的總酚酸含量變化不大。

3?結論與討論

黃酮和酚酸是植物自身的次生代謝物，盡管黃酮和酚酸的積累的主要因素是遺傳，然而外界環境如不同季節、植物的營養、光照、微生物侵入等對黃酮的積累也產生一定影響[11]。有關黃酮在果實成熟過程中的積累規律已經在一些物種上做了研究。植株的樹齡和成熟度是黃酮類物質變化的主要決定性因素，但是隨著遺傳和外界環境條件的影響，實際的含量是由黃酮生物合成和分解代謝反應的平衡來決定的。王麗娟等對不同生長發育期草莓果實研究表明，在綠熟期類黃酮含量較高，隨著果實的成熟，含量逐漸下降，至紫紅期又有所升高[12]。查爾酮合成酶（CHS）是將苯丙烷代謝途徑引向黃酮類化合物的合成.該酶催化4香豆酸CoA 和丙二酰CoA 反應，合成查爾酮柚（苷）配基4，5，7三羥黃烷酮[13]。CHS 是苯丙烷系代謝途徑中含量最豐富的酶之一，但該酶的催化效率較低，植物體內CHS的轉錄受到高濃度肉桂酸的抑制及高濃度的香豆酸促進[14]。

對柑橘幼果活性成分的研究表明在幼果期黃酮和酚酸含量很高。黃仁華等以紐荷爾臍橙果實為材料，果皮中黃酮的含量在后期下降與果皮中黃酮含量的變化主要與其合成代謝有關，在果實成熟期，其代謝速率可能高于合成速率[15]。劉英對四季柚的黃酮和酚酸進行研究表明：四季柚果皮中總酚酸含量數是隨成熟度上升而先下降后上升，主要是肉桂酸型酚酸含量上升[16]。徐貴華等研究不同成熟期椪柑、溫州蜜橘、胡柚果實中的主要酚類物質組成，結果表明柑橘果實中的酚類物質含量隨成熟度的提高而減少，其提取液的抗氧化能力也隨之減小。未成熟期的柑橘果實落果尤其適合于提取各種黃酮：椪柑果實可以用于提取橙皮苷、川陳皮素和橘皮素;溫州蜜橘果實可以用于提取橙皮苷;胡柚果實可以用于提取柚皮苷和新橙皮苷[17]。

本研究對不同生長發育期金柑果皮黃酮和酚酸含量進行測定分析，在金柑樣品中均檢測出6種黃酮和5種酚酸類物質。在幼果期（花后45 d），總黃酮和總酚酸含量都很高，其中花后45～85 d，酚酸下降時間比黃酮提早10 d左右。這可能是由于酚酸是黃酮類物質合成的底物。另外金柑果實在花后55～85 d水分含量不斷增加也是原因之一。花后85 d后，總黃酮和總酚酸含量變化趨于平穩。花后105～125 d，果皮中香豆酸含量急劇上升，其他肉桂酸含量下降，促進果皮中查爾酮合成酶的轉錄，將苯丙烷代謝途徑引向黃酮類化合物的合成途徑，是花后125 d金柑果皮黃酮類物質含量有所上升的原因之一。

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（責任編輯：林玲娜）