鹽酸羥考酮通過JNK/p38MAPK信號通路調控異丙腎上腺素誘導的心肌細胞凋亡的機制

萬敏 許美霞

(武漢市第四醫院ICU，湖北 武漢 430030)

心力衰竭屬于心血管疾病發展的終末階段并可促使患者死亡，其主要由心臟重構、體液等異常造成的一種惡性循環〔1〕。研究表明心力衰竭發生過程涉及心肌細胞凋亡、肥大及血管新生等多個病理生理過程，其中心肌細胞凋亡發生時還可通過促進病理性細胞肥大及間質纖維化從而引發心肌重構〔2〕。因而如何抑制心肌細胞凋亡成為延緩心力衰竭的關鍵環節。羥考酮又稱鹽酸羥考酮，研究表明鹽酸羥考酮可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷從而對心肌細胞發揮保護作用〔3〕。羥考酮可能通過調控P53，B淋巴細胞瘤(Bax)和B淋巴細胞瘤-2相關蛋白(Bcl)-2mRNA的水平和VEGF，uPA的表達而抑制肺癌A549細胞增殖及遷移，促進其凋亡〔4〕。但關于鹽酸羥考酮對心肌細胞凋亡的作用尚未可知。異丙腎上腺素(ISO)屬于β受體激動劑，研究表明ISO可增加心肌耗氧量而造成心肌缺血、壞死等，ISO誘導心肌細胞損傷并可促使心肌細胞凋亡，故可用ISO建立體外培養心肌細胞損傷模型〔5〕。抑制p38絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)信號通路激活可減輕缺氧復氧環境下心肌細胞凋亡及氧化損傷〔6〕。研究表明通過抑制c-Jun氨基末端激酶(JNK)/p38MAPK信號通路激活可減輕心肌細胞氧化損傷而保護心肌細胞〔7〕。目前關于鹽酸羥考酮對心肌細胞損傷生物作用機制研究尚未完全闡明。因此，本研究通過檢測鹽酸羥考酮干預ISO誘導的心肌細胞損傷的凋亡相關指標而探討鹽酸羥考酮對損傷心肌細胞的抗凋亡作用，擬從心肌細胞凋亡角度探析鹽酸羥考酮是否對ISO誘導的心肌細胞損傷有抗凋亡作用，并初步探究其可能的作用機制。

1 材料與方法

1.1材料與試劑 大鼠心肌細胞H9c2購自美國ATCC細胞庫。ISO購自美國Sigma公司；DMEM培養基與胎牛血清均購自美國Gibco公司；細胞凋亡檢測試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司；乳酸脫氫酶(LDH)與肌酸激酶(CK)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所；噻唑藍(MTT)購自美國ENZO公司；Bcl-2、Bax抗體均購自美國Santa Cruz Biotechnology公司；磷酸化(p)-JNK、p-p38MAPK、JNK、p38MAPK抗體均購自美國CST公司；辣根過氧化物酶(HRP)標記的免疫球蛋白(Ig)G二抗購自武漢博士德生物工程有限公司；鹽酸羥考酮購自英國Hamol公司(規格：0.5 mg/kg，批號：AW092)；p38MAPK特異性抑制劑SB203580購自美國Sigma公司。

1.2方法

1.2.1藥物處理及實驗分組 取出凍存心肌細胞H9c2，細胞復蘇，置于含有10%胎牛血清的DMEM培養基培養，1 000 r/min轉速離心機離心10 min，放入37℃、體積分數5%CO2培養箱培養，細胞傳代(2～3代)，取對數生長期心肌細胞，胰蛋白酶消化細胞，調整細胞密度為5×103個/ml，接種于6孔板，用10 μmol/L的ISO處理心肌細胞48 h(ISO組)，未進行任何處理的細胞作為對照組〔8〕。1 μmol/L、5 μmol/L、10 μmol/L的鹽酸羥考酮處理心肌細胞2 h〔9〕，用10 μmol/L的ISO處理心肌細胞48 h，分別為ISO+鹽酸羥考酮1 μmol/L組、ISO+鹽酸羥考酮5 μmol/L組、ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組。后續實驗中為探究鹽酸羥考酮是否通過調控JNK/p38MAPK信號通路而發揮作用，用15 μmol/L的JNK/p38MAPK信號通路阻斷劑SB203580預處理24 h〔10〕，用10 μmol/L的ISO處理心肌細胞48 h，作為ISO+SB203580組。

1.2.2MTT檢測細胞增殖 將心肌細胞按照3×105個/ml的密度接種于96孔板，每組設置3個復孔，分別取各組100 μl細胞懸液加入對應培養基內，放入37℃、5%CO2培養箱繼續培養24 h、48 h、72 h，每孔分別加入10 μl MTT溶液，室溫孵育4 h，磷酸鹽緩沖液(PBS)洗滌2次，每孔分別加入二甲基亞砜(DMSO)溶液150 μl，同時設置無細胞的空白孔加入等量DMSO溶液作為對照孔，低速振蕩10 min，酶標儀檢測各孔吸光度(OD 490 nm)細胞存活率(%)=〔(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)〕×100%。

1.2.3流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組心肌細胞，預冷PBS洗滌3次，使用0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集細胞，低速離心后加入100 μl結合緩沖液制備單細胞懸液，依次加入5 μl Annexin V-FITC與PI，室溫避光孵育10 min，加入300 μl結合緩沖液終止反應，充分混勻，應用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.4Western印跡檢測Bcl-2、Bax及JNK/p38MAPK信號通路相關蛋白表達 收集各組對數生長期心肌細胞，棄細胞培養液，加入裂解液裂解，4℃條件下，14 000 r/min轉速離心10 min，吸取蛋白上清液轉移至無菌無酶的EP管內，采用二喹啉甲酸(BCA)法測定蛋白濃度，取蛋白樣品加入等體積的2×加樣緩沖液，100℃煮沸5 min變性，取30 μg蛋白樣品進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)反應，反應結束后將其轉移至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，室溫條件下使用5%牛血清白蛋白封閉1 h，加入一抗(稀釋比1∶800)，4℃反應24 h，加入二抗(稀釋比1∶1 000)，室溫孵育1 h，滴加增強型電化學發光試劑(ECL)顯色，凝膠成像系統采集圖像，應用Quantityone軟件分析蛋白相對表達量(目的蛋白條帶灰度值/內參照條帶灰度值)。

1.2.5檢測細胞上清液中LDH、CK含量 收集各組心肌細胞培養上清液，應用酶標儀檢測LDH、CK含量，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。

1.3統計學處理 采用SPSS19.0軟件進行t檢驗，方差分析，LSD-t檢驗。

2 結 果

2.1鹽酸羥考酮對心肌H9c2細胞存活率的影響 用ISO處理心肌細胞后，與對照組比較，心肌細胞存活率顯著降低(P<0.05)；與ISO組比較，不同濃度的鹽酸羥考酮處理心肌細胞后，心肌細胞存活率顯著升高(P<0.05)，見表1。由于鹽酸羥考酮10 μmol/L處理后心肌細胞存活率相對較高，因此選取鹽酸羥考酮10 μmol/L進行后續研究。

2.2鹽酸羥考酮對心肌H9c2細胞凋亡率的影響 流式細胞儀檢測不同處理條件下心肌細胞凋亡率變化，結果顯示，與對照組比較，ISO組心肌細胞凋亡率顯著增加(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)。Western印跡實驗結果顯示，ISO組心肌細胞中Bax表達明顯上調(P<0.05)，而Bcl-2表達明顯下調(P<0.05)，鹽酸羥考酮處理后ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細胞中Bax表達明顯下調(P<0.05)，而Bcl-2表達明顯上調(P<0.05)，見圖1、表2。

表1 鹽酸羥考酮對培養不同時間心肌H9c2細胞存活率的影響

與對照組比較:1)P<0.05；與ISO組比較:2)P<0.05，下表同

A：流式細胞儀檢測各組心肌細胞凋亡；B：Western印跡法檢測細胞凋亡相關蛋白表達；1～3分別為對照組、ISO組、ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組，圖2同

表2 鹽酸羥考酮對心肌H9c2細胞凋亡及上清液LDH、CK含量的影響

2.3鹽酸羥考酮對心肌H9c2細胞上清液中LDH、CK含量的影響 與對照組比較，ISO組心肌細胞上清液中LDH、CK含量均顯著升高(P<0.05)；與ISO組相比，ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細胞上清液中LDH、CK含量均顯著降低(P<0.05)，見表2。

2.4鹽酸羥考酮對心肌H9c2細胞JNK/p38MAPK信號通路相關蛋白表達的影響 與對照組比較，ISO組心肌細胞中p-JNK、p-p38MAPK蛋白表達水平均顯著升高(P<0.05)；與ISO組比較，ISO+鹽酸羥考酮10 μmol/L組心肌細胞中p-JNK、p-p38MAPK蛋白表達水平均顯著降低(P<0.05)，見表3、圖2。

表3 鹽酸羥考酮對心肌H9c2細胞JNK/p38MAPK信號通路相關蛋白表達的影響

圖2 Western印跡法檢測各組心肌細胞中JNK/p38MAPK信號通路相關蛋白表達

2.5阻斷JNK/p38MAPK信號通路對心肌H9c2細胞存活率及凋亡率的影響 與對照組比較，ISO組心肌細胞存活率顯著降低，而細胞凋亡率顯著升高，Bcl-2表達顯著下降，Bax表達顯著上調，差異有統計學意義(均P<0.05)。與ISO組比較，ISO+SB203580組心肌細胞存活率顯著升高，差異有統計學意義(P<0.05)，而細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，Bcl-2表達上調，差異有統計學意義(P<0.05)，而Bax表達下調，差異有統計學意義(P<0.05)，見表4、圖3。

表4 阻斷JNK/p38MAPK信號通路對心肌H9c2細胞存活率及凋亡率的影響

1～3：對照組、ISO組、ISO+SB203580組

3 討 論

心肌細胞凋亡與心室重構均可加重心力衰竭，并可影響心房肌細胞凋亡及纖維化，細胞凋亡是心血管疾病、自身免疫性疾病等多種疾病發生的重要機制之一〔11〕。心肌細胞本身不具有增殖能力，隨著心肌細胞凋亡數量增加明顯減弱心臟收縮功能甚至誘發心力衰竭〔12〕。因此，通過某些措施干預心肌細胞凋亡過程中的相關信號通路或轉導途徑可為心血管疾病治療提供新方向。

鹽酸羥考酮屬于阿片類藥物，其可通過激活μ受體、κ受體而發揮鎮痛作用，并可通過調控細胞因子或趨化因子等表達而調控機體免疫功能〔13〕。研究表明阿片類藥物可通過調控癌細胞增殖及凋亡等途徑進而發揮抗癌作用〔14,15〕。本研究結果與相關文獻報道相似〔16〕。說明鹽酸羥考酮可促進ISO誘導的心肌細胞存活而抑制其凋亡，其可能通過調控細胞凋亡相關蛋白表達進而發揮作用。提示鹽酸羥考酮可有效抑制心肌細胞凋亡并促進其存活。研究報道指出心肌細胞或組織壞死時LDH、CK釋放量增加，活性增強，預示心肌細胞損傷程度加重〔17〕。說明ISO可促使心肌細胞發生嚴重損傷，鹽酸羥考酮可有效減輕ISO誘導的心肌細胞損傷。提示鹽酸羥考酮具有抗氧化及減輕ISO誘導的心肌細胞損傷的作用。

心肌缺血再灌注損傷發生后心肌細胞內JNK/p38MAPK信號通路激活，各種炎性細胞因子生成量明顯增加，進一步促進心肌細胞凋亡而加重心肌缺血再灌注損傷〔18〕。JNK/p38MAPK信號通路激活后可通過與底物結合而影響組織炎癥反應、細胞增殖及凋亡等過程，研究表明JNK/p38MAPK信號通路活化與細胞凋亡有關〔19,20〕。本研究結果提示鹽酸羥考酮可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的活化進而減輕ISO誘導的心肌細胞損傷后炎癥反應及細胞凋亡。進一步研究發現ISO誘導的心肌細胞中加入JNK/p38MAPK信號通路阻斷劑，結果發現其對ISO誘導的心肌細胞損傷及細胞凋亡的作用與鹽酸羥考酮的作用效果相似。提示鹽酸羥考酮可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的激活，抑制ISO誘導的心肌細胞氧化損傷，減少細胞凋亡，從而發揮對ISO誘導心肌細胞損傷的保護作用。

綜上，鹽酸羥考酮通過降低氧化應激水平及抑制ISO誘導的心肌細胞凋亡而保護心肌細胞，其可能通過抑制JNK/p38MAPK信號通路的激活而發揮作用，為臨床治療心力衰竭藥物的研發及應用提供理論依據。