襄陽(yáng)大頭菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的多樣性

吳進(jìn)菊，李宇昂，王梓杭，鄭婷婷，于 博，余海忠

（湖北文理學(xué)院食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院g化學(xué)工程學(xué)院，湖北 襄陽(yáng) 441053）

湖北襄陽(yáng)大頭菜歷史悠久，相傳是三國(guó)時(shí)期諸葛亮所發(fā)明，因此又叫孔明菜、諸葛菜。襄陽(yáng)大頭菜在2007年獲得“國(guó)家地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品”，是我國(guó)四大名腌菜之一[1]。襄陽(yáng)大頭菜制作周期長(zhǎng)，需經(jīng)歷長(zhǎng)達(dá)數(shù)月至數(shù)年的發(fā)酵過(guò)程才能成熟。在漫長(zhǎng)的發(fā)酵過(guò)程中，有大量的微生物參與其中，蘊(yùn)藏了豐富的微生物資源。

近年來(lái)，很多研究人員把目光轉(zhuǎn)向發(fā)酵食品的微生物多樣性研究，取得了很大的成果，如Liang Huipeng等[2]研究發(fā)現(xiàn)榨菜發(fā)酵初期乳酸菌生長(zhǎng)迅速，然后達(dá)到穩(wěn)定的發(fā)酵水平，弧菌、鹽單胞菌、明串珠菌、魏斯氏菌在發(fā)酵過(guò)程中數(shù)量減少，片球菌數(shù)量增加。而家庭制作的泡菜中耐酸乳桿菌和短乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌屬[3]。青菜泡菜發(fā)酵過(guò)程中主要菌屬為乳酸菌屬、假單胞菌屬、弧菌屬和鹽單胞菌屬。大多數(shù)隸屬于變形菌門(mén)或擬桿菌門(mén)的細(xì)菌菌屬在發(fā)酵前期檢測(cè)頻率較高，而乳酸菌（隸屬于厚壁菌門(mén)）在發(fā)酵后期占主導(dǎo)地位[4]。Zhou Qi等[5]研究發(fā)現(xiàn)東北酸菜發(fā)酵過(guò)程中優(yōu)勢(shì)微生物為乳桿菌屬、明串珠菌屬、腸桿菌屬、熱袍菌屬、假單胞菌屬等，隨著發(fā)酵的進(jìn)行，乳酸菌逐漸增多，而腸桿菌逐漸減少。趙慧君[6]、郭壯[7]等對(duì)襄陽(yáng)大頭菜腌制液膜醭中的微生物菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究，結(jié)果表明，細(xì)菌中變形菌門(mén)和硬壁菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，屬水平上鹽單胞菌、色鹽桿菌屬、海桿菌屬、鹽厭氧菌屬、四聯(lián)球菌為優(yōu)勢(shì)種屬；真菌中子囊菌門(mén)平均含量高達(dá)99.99%，屬水平上合囊菌屬、畢赤酵母屬、念珠菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，平均相對(duì)含量分別為56.10%、40.96%和2.32%。另外，研究人員對(duì)發(fā)酵魚(yú)類(lèi)[8-9]、酒類(lèi)[10-14]、發(fā)酵乳制品[15-20]、發(fā)酵豆制品[21-24]、發(fā)酵蔬菜[25-30]等發(fā)酵食品中微生物多樣性方面也進(jìn)行了大量的研究。

目前針對(duì)傳統(tǒng)發(fā)酵大頭菜發(fā)酵過(guò)程中微生物方面的研究較少，早期研究基本是建立在傳統(tǒng)純培養(yǎng)技術(shù)研究方法上，只能獲得微生物總量中極少的一部分，存在很大的局限性和片面性，從而對(duì)發(fā)酵過(guò)程中微生物群落結(jié)構(gòu)變化和種群多樣性了解不夠清楚，限制了大頭菜標(biāo)準(zhǔn)化和工業(yè)化生產(chǎn)。本研究采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)考察了大頭菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌的多樣性和菌群結(jié)構(gòu)的演替規(guī)律，全面揭示了大頭菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)變化，為今后大頭菜生產(chǎn)的改進(jìn)提供了一定的研究基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

24 份大頭菜發(fā)酵液樣本 湖北孔明菜食品有限公司；FastPfu聚合酶 北京全式金生物技術(shù)有限公司；土壤基因組提取試劑盒 美國(guó)MP Biomedicals公司；DL2000 DNA Marker 寶生物工程（大連）有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

MiSeq高通量測(cè)序平臺(tái) 美國(guó)Illumina公司；Quanti Fluor?-ST藍(lán)色熒光定量系統(tǒng) 美國(guó)Promega公司；9700型聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）儀 美國(guó)ABI公司；臺(tái)式冷凍離心機(jī) 德國(guó)Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集

實(shí)驗(yàn)樣本采自湖北孔明菜食品有限公司，大頭菜采用“三腌、五鹵、六曬”的傳統(tǒng)工藝進(jìn)行生產(chǎn)，按照加工工序的特點(diǎn)，在每一道腌制和鹵制工序完成后取樣，共采集了8 個(gè)不同發(fā)酵時(shí)期的大頭菜發(fā)酵液樣本，分別編號(hào)為1_1～1_8。每個(gè)發(fā)酵時(shí)期平行取3 個(gè)發(fā)酵液樣本，編號(hào)分別為a、b和c。樣本采集后快速運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室，置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 Illumina MiSeq測(cè)序和數(shù)據(jù)分析

將24 份大頭菜發(fā)酵液樣本送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行測(cè)序。以微生物總DNA為模板，以338F（5’-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3’）和806R（5’-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3’）為上下游引物擴(kuò)增細(xì)菌16S rRNA基因的V3-V4可變區(qū)序列。將PCR產(chǎn)物純化后進(jìn)行熒光定量，進(jìn)一步構(gòu)建MiSeq文庫(kù)后進(jìn)行雙端測(cè)序，測(cè)序讀長(zhǎng)300 bp。數(shù)據(jù)分析采用美吉I-Sanger云平臺(tái)進(jìn)行在線(xiàn)分析。對(duì)優(yōu)化序列提取非重復(fù)序列，按照97%相似性水平對(duì)非重復(fù)序列（不含單序列）進(jìn)行可操作分類(lèi)單元（operational taxonomic units，OTU）聚類(lèi)，去除嵌合體，獲得OTU代表序列。利用Mothur軟件計(jì)算各樣本的α多樣性，表征細(xì)菌群落的豐富度和多樣性。采用群落Bar圖和Heatmap圖反映樣本在各分類(lèi)學(xué)水平上的物種組成。主成分分析（principal component analysis，PCA），采用降維的方法對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行簡(jiǎn)化分析，利用物種豐度表，基于歐氏距離進(jìn)行作圖，樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離越近。根據(jù)β多樣性距離矩陣進(jìn)行層級(jí)聚類(lèi)分析，使用非加權(quán)組平均法（unweighted pair-group method with arithmetic mean，UPGMA）算法構(gòu)建樹(shù)狀結(jié)構(gòu)，可視化呈現(xiàn)不同環(huán)境樣本中微生物進(jìn)化的差異程度，距離算法采用Bray-Curtis，樣本層級(jí)聚類(lèi)方式為Average。采用R語(yǔ)言（版本號(hào)3.2.5）vegan包進(jìn)行相似性分析（analysis of similarities，ANOSIM）。ANOSIM又稱(chēng)為置換多因素方差分析或非參數(shù)多因素方差分析，是一種非參數(shù)檢驗(yàn)，用來(lái)檢驗(yàn)組間的差異是否顯著大于組內(nèi)差異，從而判斷分組是否有意義。

1.3.3 樣本序列的提交及序列號(hào)

將本研究中所有fastq序列文件提交到美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心SRA數(shù)據(jù)庫(kù)，序列號(hào)為PRJNA524770。

2 結(jié)果與分析

2.1 測(cè)序結(jié)果和α多樣性分析

通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序，24 份大頭菜發(fā)酵液樣本共獲得1 158 752 條優(yōu)化序列，平均長(zhǎng)度為448 bp，各樣本抽平多樣性指數(shù)如表1所示。采用RDP classifier貝葉斯算法對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析，按最小樣本序列數(shù)進(jìn)行抽平分析（每個(gè)樣本27 407 條有效序列），結(jié)果表明，所有樣本序列歸屬于19 個(gè)門(mén)、32 個(gè)綱、67 個(gè)目、133 個(gè)科、293 個(gè)屬、482 個(gè)種、658 個(gè)OTU，每個(gè)樣本的OTU分類(lèi)信息見(jiàn)表1。

表1 樣本信息表和α多樣性指數(shù)分析Table 1 Bacterial community composition and alpha diversity estimators of pickle juice samples

由表1可知，每個(gè)樣本的Coverage值均為0.996以上，表明測(cè)序深度良好，覆蓋率高，可以真實(shí)展示樣本中的絕大多數(shù)細(xì)菌。通過(guò)Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)分析可知，在所有樣本中，1_1的細(xì)菌多樣性最高，而1_2細(xì)菌多樣性相對(duì)較低。這從各樣本門(mén)、目、屬、OTU的個(gè)數(shù)也能看出，1_1在各分類(lèi)學(xué)水平的數(shù)目均高于其他樣本，而1_2低于其他樣本。1_1、1_5和1_7中，Chao 1指數(shù)和ACE值較高，表明樣本中群落的豐富度較高?？傮w來(lái)說(shuō)，發(fā)酵前期和發(fā)酵后期樣本的細(xì)菌多樣性沒(méi)有呈現(xiàn)出整體的差異性，在8 個(gè)不同的發(fā)酵時(shí)期，樣本細(xì)菌多樣性有的時(shí)期高，有的時(shí)期低，呈現(xiàn)不規(guī)律變化。

稀釋曲線(xiàn)通常是在97%的相似水平下，從樣本中隨機(jī)抽取一定數(shù)量的個(gè)體，以測(cè)序深度為橫坐標(biāo)，以各個(gè)樣本中的細(xì)菌多樣性指數(shù)為縱坐標(biāo)，在二維水平建立坐標(biāo)系，將樣本內(nèi)細(xì)菌的多樣性隨著測(cè)序程度加深的變化情況清楚的展示出來(lái)。由圖1可知，24 個(gè)樣本隨著抽取的reads條數(shù)的增加，曲線(xiàn)平坦，已接近直線(xiàn)，說(shuō)明此次取樣的樣本測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠大，能比較全面地反映樣本中絕大多數(shù)細(xì)菌的多樣性信息。

圖1 稀釋曲線(xiàn)Fig. 1 Rarefaction curves

2.2 門(mén)水平細(xì)菌群落組成分析

24 個(gè)樣本中共檢測(cè)出19 個(gè)細(xì)菌門(mén)，包括變形菌門(mén)（Proteobacteria）、放線(xiàn)菌門(mén)（Actinobacteria）、擬桿菌門(mén)（Bacteroidetes）、厚壁菌門(mén)（Firmicutes）、螺旋菌門(mén)（Spirochaetae）、螺旋體菌門(mén)（Saccharibacteria）、綠彎菌門(mén)（Chloroflexi）、梭桿菌門(mén)（Fusobacteria）、軟壁菌門(mén)（Tenericutes）、棲熱菌門(mén)（Deinococcus-Thermus）、疣微菌門(mén)（Verrucomicrobia）、酸桿菌門(mén)（Acidobacteria）、熱袍菌門(mén)（Thermotogae）、FBP、浮霉菌門(mén)（Planctomycetes）、芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）、互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes）等。其中變形菌門(mén)、厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、螺旋菌門(mén)為優(yōu)勢(shì)菌門(mén)，其他14 個(gè)菌門(mén)相對(duì)豐度較低，在任一發(fā)酵時(shí)期中的相對(duì)豐度均在1%以下。不同發(fā)酵時(shí)期大頭菜樣本細(xì)菌群落組成如圖1所示。在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)占據(jù)了絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，兩者相對(duì)豐度之和在1_1中達(dá)到75.0%（平均值，下同），在其他發(fā)酵時(shí)期均達(dá)到了90%以上，這與大頭菜腌制液膜醭中的微生物菌群組成相似[6]。1_1中，變形菌門(mén)相對(duì)豐度最高，為67.7%，厚壁菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)、擬桿菌門(mén)三者相當(dāng)，分別為7.32%、13.1%和10.4%。而在1_2中，厚壁菌門(mén)占據(jù)了絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，相對(duì)豐度達(dá)到了66.2%，變形菌門(mén)、放線(xiàn)菌門(mén)和擬桿菌門(mén)的相對(duì)豐度均明顯下降。在后續(xù)的發(fā)酵過(guò)程中，變形菌門(mén)的相對(duì)豐度都高于厚壁菌門(mén)。

圖2 門(mén)水平上細(xì)菌群落組成分析Fig. 2 Bacterial community composition at the phylum level

2.3 屬水平細(xì)菌群落組成分析

圖3 屬水平上細(xì)菌群落組成Heatmap圖Fig. 3 Heatmap of bacterial community composition at the genus level

Heatmap圖根據(jù)物種和樣本間豐度的相似性進(jìn)行聚類(lèi)，使高豐度和低豐度的物種分塊聚集，通過(guò)顏色變化與相似程度反映不同樣本在分類(lèi)學(xué)水平上群落組成的相似性和差異性。對(duì)屬水平總豐度排在前35的物種進(jìn)行層級(jí)聚類(lèi)，物種和樣本層級(jí)聚類(lèi)方式均采用平均聚類(lèi)方式，得到的群落Heatmap如圖3所示。24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣本中共檢測(cè)出293 個(gè)細(xì)菌屬，其中有46 個(gè)菌屬相對(duì)豐度在1%以上，相對(duì)豐度排在前5 位的菌屬有鹽厭氧菌屬（Halanaerobium）、弧菌屬（Vibrio）、鹽單胞菌屬（Halomonas）、乳桿菌屬（Lactobacillus）和色鹽桿菌屬（Chromohalobacter）。在發(fā)酵的前3 個(gè)時(shí)期，弧菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，相對(duì)豐度為27.6%～42.4%，而在發(fā)酵的后5 個(gè)時(shí)期，弧菌屬相對(duì)豐度急劇下降，均在3%以下，而鹽厭氧菌屬相對(duì)豐度迅速增加，發(fā)酵前3 個(gè)時(shí)期相對(duì)豐度均在0.1%以下，而發(fā)酵后5 個(gè)時(shí)期相對(duì)豐度增加至31.1%～42.0%，占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)。在1_4～1_8中，除鹽厭氧菌屬外，優(yōu)勢(shì)菌屬還有鹽單胞菌屬、色鹽桿菌屬和norank_f_TBZ33，而這3 個(gè)菌屬在1_1～1_3中相對(duì)豐度都非常低，甚至沒(méi)有檢測(cè)出。嗜冷桿菌屬（Psychrobacter）在1_1和1_2中相對(duì)豐度較低，分別為0.61%和0.62%，在1_3～1_8中相對(duì)豐度有所增加，達(dá)到了1.2%～5.3%。

關(guān)于乳桿菌屬，在1_1中相對(duì)豐度僅為1.4%，而在1_2中提高至55.6%，占據(jù)了絕對(duì)優(yōu)勢(shì)，隨后在1_3中又下降至4.0%。在1_5～1_8中，乳桿菌屬相對(duì)豐度下降至1%以下。乳酸菌是發(fā)酵蔬菜中常見(jiàn)的優(yōu)勢(shì)菌屬[1-4]，在蔬菜發(fā)酵過(guò)程中起著非常關(guān)鍵的作用，可以抑制硝酸鹽還原細(xì)菌的作用，從而降低亞硝酸鹽的形成[3]。在發(fā)酵前期，加入的食鹽量相對(duì)較少，所以不耐鹽的弧菌屬、乳桿菌屬等為優(yōu)勢(shì)菌屬。而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，大量的食鹽不斷加入，使發(fā)酵液中的食鹽濃度大大提高，在發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液中的食鹽濃度甚至達(dá)到飽和狀態(tài)，因此，發(fā)酵后期不耐鹽的菌屬相對(duì)豐度急劇下降，而耐鹽菌屬發(fā)展成為優(yōu)勢(shì)菌屬，如鹽厭氧菌屬、鹽單胞菌屬、色鹽桿菌屬等。

由圖3可知，根據(jù)物種間豐度的相似性，總豐度排在前35的細(xì)菌菌屬可聚為4 類(lèi)，鹽厭氧菌屬、norank_f_TBZ33、鹽單胞菌屬和色鹽桿菌屬歸為I類(lèi)，在發(fā)酵前期相對(duì)豐度非常低，而在發(fā)酵后期相對(duì)豐度較高，成為優(yōu)勢(shì)菌屬。魏斯氏菌屬（Weissella）、弧菌屬和乳桿菌屬歸為II類(lèi)，在發(fā)酵前期相對(duì)豐度較高，為優(yōu)勢(shì)菌屬，而在發(fā)酵后期相對(duì)豐度有所降低。III類(lèi)包含了8 個(gè)細(xì)菌種屬，在發(fā)酵前期相對(duì)豐度較低，后期相對(duì)豐度有所提高。IV包含了20 個(gè)細(xì)菌種屬，在發(fā)酵前期相對(duì)豐度中等，后期相對(duì)豐度進(jìn)一步降低。在細(xì)菌屬水平上根據(jù)樣本間豐度的相似性，24 個(gè)發(fā)酵液樣本可以聚為2大類(lèi)，1_1、1_2和1_3的9 個(gè)樣本聚為一類(lèi)，1_4、1_5、1_6、1_7和1_8的15 個(gè)樣本歸為一類(lèi)，由此可將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為2 個(gè)階段，發(fā)酵前期和發(fā)酵后期。

2.4 發(fā)酵過(guò)程中大頭菜發(fā)酵液樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的分析

在對(duì)大頭菜發(fā)酵液中門(mén)和屬分類(lèi)學(xué)水平細(xì)菌菌群相對(duì)豐度進(jìn)行分析的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用PCA和樣本層級(jí)聚類(lèi)分析24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異程度。PCA可以將原有的復(fù)雜數(shù)據(jù)降維，通過(guò)分析不同樣本群落組成可以反映樣本間的差異和距離。樣本物種組成越相似，反映在PCA圖中的距離則越近。由圖4可知，在OTU分類(lèi)水平上，不同樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)信息主要集中在前2 個(gè)主成分，其中PC1的貢獻(xiàn)率為62.9%，PC2的貢獻(xiàn)率為25.4%，累計(jì)方差貢獻(xiàn)率為88.3%，因此可以認(rèn)為PC1和PC2包含了樣本的原始大量細(xì)菌組成數(shù)據(jù)信息，可以反映樣本的整體細(xì)菌組成信息。24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣本呈現(xiàn)出明顯的聚類(lèi)趨勢(shì)，1_4～1_8的15 個(gè)樣本距離較近，處于第2象限，且在PCA圖中沒(méi)有完全區(qū)分開(kāi)，聚為一類(lèi)。1_1和1_3的6 個(gè)樣本距離較近，處于第3象限，聚為一類(lèi)。1_2的3 個(gè)樣本距離較近，處于第1象限，單獨(dú)聚為一類(lèi)。

圖4 OTU水平上樣本細(xì)菌群落PCAFig. 4 Principal component analysis of bacterial communities at the OTU level

在PCA基礎(chǔ)上，進(jìn)一步采用樣本層級(jí)聚類(lèi)分析大頭菜發(fā)酵液樣本細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的相似性和差異程度。在OTU分類(lèi)水平上，根據(jù)β多樣性距離矩陣進(jìn)行樣本層級(jí)聚類(lèi)分析，距離算法采用Bray-Curtis，樹(shù)狀結(jié)構(gòu)的構(gòu)建使用UPGMA算法，結(jié)果見(jiàn)圖5。24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣本可聚為2 個(gè)大類(lèi)，其中1_4～1_8的15 個(gè)樣本聚為A大類(lèi)，1_1～1_3的9 個(gè)樣本聚為B大類(lèi)，而B(niǎo)大類(lèi)又可分為兩個(gè)小類(lèi)，其中1_2的3 個(gè)樣本聚為B1類(lèi)，1_1和1_3的6 個(gè)樣本聚為B2類(lèi)。這與Heatmap圖和PCA結(jié)果基本一致。由此也可將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為2 個(gè)階段，發(fā)酵前期和發(fā)酵后期。在發(fā)酵的相同階段，細(xì)菌群落組成結(jié)構(gòu)相似。

圖5 OTU水平上樣本細(xì)菌群落聚類(lèi)分析Fig. 5 Cluster analysis of bacterial communities at the OTU level

2.5 不同發(fā)酵階段細(xì)菌菌群共有和獨(dú)有物種分析

為判斷將所有樣本分為兩組是否有意義，采用ANOSIM進(jìn)行分析。樣本間的距離采用Bray-Curtis距離算法，置換次數(shù)設(shè)為999 次，結(jié)果如圖6所示。組間距離最大值為276，最小值為136，中位數(shù)為209。發(fā)酵前期組內(nèi)距離最大值為144，最小值為1，中位數(shù)為123.5。發(fā)酵后期組內(nèi)距離最大值為114，最小值為2，中位數(shù)為62。統(tǒng)計(jì)值R為0.998 1，說(shuō)明組間差異遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于組內(nèi)差異。P＝0.001（＜0.05），說(shuō)明本次檢驗(yàn)的可信度很高。因此，將整個(gè)發(fā)酵過(guò)程分為發(fā)酵前期和發(fā)酵后期兩個(gè)階段是有意義的、可行的。

圖6 距離箱線(xiàn)圖Fig. 6 Distances box plot

進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)分析發(fā)酵前期和發(fā)酵后期樣本中共有的和獨(dú)有的細(xì)菌菌群數(shù)量，研究不同分類(lèi)水平樣本的組成相似性和重疊程度。結(jié)果表明，24 個(gè)大頭菜發(fā)酵液樣本中共檢出19 個(gè)門(mén)，發(fā)酵前期獨(dú)有菌門(mén)有2 個(gè)，為芽單胞菌門(mén)（Gemmatimonadetes）和酸桿菌門(mén)（Acidobacteria），發(fā)酵后期獨(dú)有菌門(mén)為互養(yǎng)菌門(mén)（Synergistetes），且3 個(gè)獨(dú)有菌門(mén)在各樣本中的相對(duì)豐度都極低，兩個(gè)發(fā)酵階段共有菌門(mén)為16 個(gè)，占有效序列條數(shù)的99.9%以上。在屬水平上，發(fā)酵前期獨(dú)有菌屬有22 個(gè)，發(fā)酵后期獨(dú)有菌屬有28 個(gè)，共有菌屬為243 個(gè)。OTU水平上，發(fā)酵前期獨(dú)有OTU數(shù)目為67，發(fā)酵后期OTU數(shù)目為80，共有OTU數(shù)目為511。在發(fā)酵的兩個(gè)不同階段，各分類(lèi)水平上的物種在數(shù)目上差異并不大，而且在各個(gè)階段獨(dú)有的物種相對(duì)豐度非常低，因此發(fā)酵兩個(gè)階段的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在共有物種的組成上。

3 結(jié) 論

通過(guò)Illumina MiSeq高通量測(cè)序，24 份大頭菜發(fā)酵液樣本共獲得1 158 752 條優(yōu)化序列，對(duì)97%相似水平的OTU代表序列進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)，抽平后所有樣本序列歸屬于19 個(gè)門(mén)、32 個(gè)綱、67 個(gè)目、133 個(gè)科、293 個(gè)屬、482 個(gè)種、658 個(gè)OTU。門(mén)水平上，在整個(gè)發(fā)酵過(guò)程中，變形菌門(mén)和厚壁菌門(mén)占據(jù)了絕對(duì)的優(yōu)勢(shì)，兩者相對(duì)豐度之和達(dá)到75.0%～98.3%。在發(fā)酵前期，弧菌屬為優(yōu)勢(shì)菌屬，而隨著發(fā)酵的進(jìn)行，弧菌屬相對(duì)豐度急劇下降，鹽厭氧菌屬成為相對(duì)豐度最高的優(yōu)勢(shì)菌屬。除此之外，鹽單胞菌屬、色鹽桿菌屬和norank_f_TBZ33豐度也顯著提高，成為發(fā)酵后期的優(yōu)勢(shì)菌屬。在發(fā)酵前期和發(fā)酵后期，各分類(lèi)水平上的物種在數(shù)目上差異并不大，而且在各個(gè)階段獨(dú)有的物種相對(duì)豐度非常低，因此發(fā)酵兩個(gè)階段的細(xì)菌菌群結(jié)構(gòu)差異主要表現(xiàn)在共有物種的組成上。本研究揭示了襄陽(yáng)大頭菜發(fā)酵過(guò)程中細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)的動(dòng)態(tài)演替，為進(jìn)一步研制大頭菜發(fā)酵劑、改進(jìn)大頭菜生產(chǎn)工藝提供一定的研究基礎(chǔ)。