攪拌棒吸附萃取結合氣相色譜-質譜聯用技術分析西湖龍井茶的揮發性成分

王夢琪，朱 蔭*，張 悅，施 江，林 智，呂海鵬*

（1.農業部茶樹生物學與資源利用重點實驗室，中國農業科學院茶葉研究所，浙江 杭州 310008；2.中國農業科學院研究生院，北京 100081）

香氣是評價茶葉品質的重要因子之一。茶香實際上是不同的芳香物質通過不同濃度組合，并對嗅覺神經綜合作用所形成的茶葉特有的香型[1]。迄今為止，人們從茶葉揮發性成分中鑒定出的香氣物質已多達700余種，主要包括醇類、醛類、酸類、酯類、酚類以及雜環類化合物等[2]。茶葉香氣成分的類型復雜，既有來源于茶樹品種本身的香氣物質，又包括加工過程中化學反應及微生物代謝生成的香氣物質，香氣物質類型及含量的差異在很大程度上影響著茶葉的風味品質。長期以來，人們開展了大量的茶葉香氣成分的分析檢測工作，已經取得了較好的研究進展。

目前，茶葉香氣物質的分析一般包括香氣成分的富集和香氣成分的定性定量分析等。在茶葉香氣的富集方面，目前人們廣泛采用的方式主要有吹掃捕集（purge &trap，P&T）、固相微萃取（solid phase microextraction，SPME）、減壓蒸餾萃取、同時蒸餾萃取（simultaneous distillation extraction，SDE）、頂空蒸汽蒸餾萃取等[3-7]。近年來，攪拌棒吸附萃取（stir bar sorptive extraction，SBSE）方法逐漸引起人們的關注，SBSE作為一種新型的樣品前處理技術[8]，其原理與SPME法類似，都以吸附涂層富集樣品中的揮發性成分；但不同的是，SPME技術多采用頂空方式萃取香氣物質，而SBSE技術則主要采用浸沒方式與樣品直接接觸吸附香氣物質。SBSE的富集倍數取決于被測物質在萃取涂層上的吸附量，由于SBSE攪拌棒上的涂層吸附量是SPME的50～250 倍，因此，其富集倍數較SPME高[9]。聚二甲氧基硅烷（polydimethylsiloxane，PDMS）和聚乙二醇-硅樹脂（ethylene glycol-silicone，EG-Silicone）是目前SBSE技術中使用較為普遍的2 種吸附涂層，PDMS主要吸附非極性化合物和極性較弱的化合物，EG-Silicone則主要吸附極性化合物。研究表明，SBSE作為一種環境友好型萃取技術[10]，具有良好的重復性，且能夠降低樣品分析的檢測限[11-12]；目前，該技術已經廣泛應用于水體污染物的檢測[13]、果酒[14]、煙草[15]等行業的香氣物質檢測。因此，可以推斷SBSE技術在茶葉香氣成分的研究領域可能具有很大的優勢和潛力，然而目前尚無系統的相關研究報道。

西湖龍井茶作為我國典型的地理標志茶類產品，素以“色翠、香郁、味醇、形美”四絕聞名中外[16]，其香氣品質高鮮清幽，清香顯著，長期以來備受國內外消費者的喜愛[17]。現有研究已有較多關于西湖龍井茶香氣成分的分析報道，采用的香氣成分萃取方法種類繁多，主要包括SPME、SDE、P&T等[18-20]。基于此，本研究擬選用西湖龍井茶為研究對象，采用SBSE方法富集其香氣成分，同時結合氣相色譜-質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）技術對萃取條件進行優化，分析研究西湖龍井茶的香氣成分組成及含量水平等，并與其他萃取方式的研究結果進行比較分析，以期為SBSE方法在茶葉香氣分析中的應用提供重要的科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

西湖龍井茶樣品5 個，由杭州龍冠實業有限公司于2018年制作；根據GB/T 18650ü2008《地理標志產品龍井茶》，進行香氣感官審評，發現這5 個樣品香氣品質優異，“清香”顯著，具有較好的代表性。從上述5 個茶樣中各取5.00 g，均勻混合后磨成茶粉，制成標準混合茶粉。

正構烷烴（C3～C7、C8～C40） 北京百靈威公司。

1.2 儀器與設備

6890-5975 GC-MS聯用儀、HP-5ms色譜柱（30 mh250 μm，0.25 μm）（配有GC進樣口的熱脫附單元和冷進樣口） 美國Agilent公司；PDMS及EGSilicone涂層磁力攪拌棒（10 mmh0.5 mm，24 μL）德國Gerstel公司；Advanced Multipoint 6/15多位點磁力攪拌器 美國Thermo Fisher公司；AB104-S電子分析天平瑞士梅特勒-托利多集團。

1.3 方法

1.3.1 熱脫附系統條件

溶劑排空模式，初始溫度30 ℃，保留1 min，以100 ℃/s速率升溫至240 ℃，并在此溫度下保持5 min。

1.3.2 冷進樣系統條件

液氮冷卻至-100 ℃，升溫程序：-100 ℃平衡1 min，以12 ℃/s升溫到280 ℃，保持3 min。保留時間3 min。

1.3.3 GC-MS測定條件

GC條件：HP-5ms色譜柱（30 mh250 μm，0.2 5 μ m）；程序升溫：5 0 ℃保持2 m i n，以4 ℃/min的速率升至170 ℃，保持5 min；再以10 ℃/min升至265 ℃，保持5 min。載氣（He）流速為1.6 mL/min，溶劑排空模式。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍33～600 u。

1.3.4 SBSE優化方法

實驗采用吸附材料不同的2 種攪拌棒PDMS、EG-Silicone，使用前將攪拌棒置于熱脫附進樣口中老化45 min。取標準混合的西湖龍井茶粉400 mg，置于20 mL樣品瓶中，10 mL沸水沖泡，平衡1 min后放入攪拌棒，置于多位點磁力攪拌器上攪拌吸附60 min，吸附結束后，取出攪拌棒，用超純水沖洗后再用濾紙吸干水分，后將攪拌棒置于熱脫附裝置中解吸附，進行GC-MS分析。

1.3.5 單因素試驗

采用單因素方法研究攪拌棒類型（PDMS和EGSilicone）、萃取溫度（60、70、80、90 ℃和100 ℃）、萃取時間（30、50、70、90 min和110 min）、轉速（250、500、750、1 000 r/min和1 250 r/min）、NaCl溶液質量分數（0%～30%）、茶水比（20∶1、40∶1、60∶1、80∶1和100∶1（mg/mL））各因素對SBSE優化結果的影響，試驗以化合物總峰面積作為考察指標。設置3 組重復，結果取平均值。

1.3.6 正交試驗優化

根據單因素試驗結果，選取3 個對SBSE效果影響最大的因素，設置3因素3水平的正交試驗L9（33）（表1），確定SBSE的最優萃取條件參數。

表1 SBSE正交試驗因素與水平Table 1 Coded values and corresponding actual values of SBSE parameters used in orthogonal array design

分析結果采用NIST 14標準譜庫檢索結合正構烷烴計算進行香氣化合物的定性；采用峰面積歸一法，即各個化合物的峰面積與總峰面積間的比值計算，對各個化合物進行相對定量分析。

2 結果與分析

2.1 各因素對SBSE萃取效率的影響

2.1.1 攪拌棒類型對萃取效果的影響

研究表明，PDMS作為非極性涂層，具有較好的熱穩定性及良好重復性，但對于低親和力的高極性化合物吸附效果較差[21]；EG-Silicone涂層對于一些極性較高、解吸溫度較低的化合物具有遺留效應，導致化合物難以解吸附[22]。本實驗為考察西湖龍井茶香氣成分分析適用的萃取涂層類型，對以上2 種應用較為廣泛的攪拌棒涂層進行比較。稱取標準混合茶粉400 mg，按上述方法沖泡后分別用PDMS和EG-Silicone 2 種攪拌棒進行萃取，結果表明，PDMS涂層攪拌棒萃取得到的化合物總峰面積為2.50h108，化合物數量為149；EG-Silicone涂層攪拌棒萃取得到的化合物總峰面積為7.89h107，化合物數量為82，對比發現，PDMS涂層萃取得到的化合物總峰面積有EG涂層的3 倍之多，萃取得到的化合物數量接近EG涂層的2 倍。統計分析結果表明2 種攪拌棒的萃取效率之間存在顯著性差異（P＜0.05），因此，PDMS的萃取效果最佳。

2.1.2 茶水比對SBSE萃取效果的影響

圖1 茶水比對SBSE萃取效率的影響Fig. 1 Effect of tea-to-water ratio on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

茶湯的濃度關系到茶湯的黏度，進而影響攪拌棒的攪拌運動。分別稱取不同質量的標準混合茶粉（200、400、600、800 mg和1 000 mg）進行香氣成分的萃取吸附。如圖1所示，茶水比為40∶1（mg/mL）條件下，具有最大的總峰面積；統計學分析表明，40∶1與60∶1、80∶1、100∶1之間無顯著差異（P＞0.05），但過高的濃度將導致茶湯黏稠度的增加，進而影響攪拌棒的工作效率。因此，茶水比在40∶1（mg/mL）左右時SBSE的萃取效率最佳。

2.1.3 萃取時間對SBSE萃取效果的影響

圖2 萃取時間對SBSE萃取效率的影響Fig. 2 Effect of extraction time on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

攪拌棒吸附萃取過程中，樣品萃取時間過短使得揮發性香氣成分無法達到頂空、茶湯及吸附相三者之間的平衡，萃取時間過長則會引起香氣成分在攪拌棒吸附相上的位點競爭，導致化合物含量不準確[23]。如圖2所示，30、50 min與70、90、110 min萃取時間存在顯著性差異（P＜0.05），當萃取時間為90 min時茶湯、頂空及吸附相中的香氣成分基本達到平衡，萃取效率基本達到最佳，而后隨著萃取時間的延長（110 min）并未使總峰面積產生顯著提高，因此，90 min的萃取時間為最佳萃取時間。

2.1.4 萃取溫度對SBSE萃取效率的影響

圖3 萃取溫度對SBSE萃取效率的影響Fig. 3 Effect of extraction temperature on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

如圖3所示，萃取溫度60～80 ℃，香氣成分的總峰面積有明顯的上升趨勢，到80 ℃時香氣成分總峰面積達到最大；而后，隨著溫度的繼續上升，香氣成分的總峰面積則顯著下降，統計分析結果表明80 ℃時化合物的總峰面積與60、70、90、100 ℃之間存在顯著性差異（P＜0.05），推測過高的溫度可能使香氣成分大量逸出，同時導致攪拌棒上香氣化合物解吸附。因此，80 ℃的萃取溫度為最佳萃取溫度。

梁璐身邊的年輕人都知道他故事的梗概，但都是在加盟團隊之后，他們談起未來可能會成為享受分紅的店長，比起那些佛學道理，顯得更有興趣。

2.1.5 攪拌棒轉速對SBSE萃取效果的影響

研究表明，前處理過程中的攪拌可以有效提高萃取效率，減少萃取時間[24]。如圖4所示，高轉速（1 250、1 000 r/min）與低轉速（250、500、700 r/min）間存在顯著性差異（P＜0.05），但1 250 r/min與1 000 r/min間差異不顯著（P＞0.05）；1 000 r/min轉速條件下分析得到的化合物具有最大總峰面積，推測1 000 r/min攪拌條件下，最有利于香氣成分從水相中的溶解，從而更好地被攪拌棒涂層吸附；因此，考慮到適中的轉速又可以避免攪拌棒與樣品瓶底機械摩擦過度造成的機械損傷，因此，轉速為1 000 r/min左右時最有利于SBSE的香氣萃取。

圖4 轉速對SBSE萃取效率的影響Fig. 4 Effect of agitation rate on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

2.1.6 NaCl溶液質量分數對SBSE萃取效果的影響

圖5 NaCl溶液質量分數對SBSE萃取效率的影響Fig. 5 Effect of NaCl concentration on the extraction efficiency of volatile compounds from “XihuLongjing” tea by SBSE

在西湖龍井茶香氣化合物萃取過程中加入NaCl可促進香氣物質的揮發，主要是由于NaCl產生的鹽析作用能夠有效降低極性香氣成分在水相中的溶解度，促進極性香氣成分向氣相擴散，從而提高PDMS的萃取效率[25]。如圖5所示，當NaCl溶液質量分數為5%、20%與25%時，總峰面積較高，與其他質量分數之間存在顯著性差異（P＜0.05）。然而，也有文獻報道稱，過高的NaCl溶液質量分數增大了溶液黏度，從而導致萃取效率減小[22]。因此，質量分數5%左右的NaCl溶液最有利于SBSE的香氣萃取。

2.2 SBSE萃取參數的正交試驗優化

單因素試驗分析結果表明，轉速、NaCl溶液質量分數及茶水比這三者水平的變化對萃取效率影響變化較大。因此，根據正交試驗設計原理，以化合物總峰面積值作為參考指標設計3水平3因素的正交試驗，極差及方差分析結果如表2、3所示。

表2 SBSE正交試驗設計結果Table 2 Orthogonal array design with experimental results

表3 SBSE正交試驗方差分析Table 3 Analysis of variance of the effect of SBSE parameters on the extraction efficiency

由表3可知，轉速、NaCl溶液質量分數及茶水比對SBSE萃取效率的影響均不顯著（P＞0.05），而極差分析結果（表2）表明，5號試驗組結果具有最大的總峰面積平均值，即組合為A3B2C3時，SBSE方法具有最佳萃取效率。同時，極差分析結果表明3 個因素對SBSE萃取效率的影響為茶水比＞轉速＞NaCl溶液質量分數。經過驗證，選擇A3B2C3為最佳實驗組合，即轉速1 250 r/min、質量分數5% NaCl溶液以及60∶1（mg/mL）的茶水比。結合單因素分析的優化結果，最終，選定PDMS轉子、60∶1（mg/mL）的茶水比、80 ℃萃取溫度、90 min萃取時長以及質量分數5% NaCl溶液為本實驗中SBSE的最優萃取方法。

2.3 方法有效性驗證

使用優化后的SBSE方法對標準混合茶粉重復5 次萃取，計算化合物總峰面積及5 次重復之間的相對標準偏差（relative standard deviation，RSD），對方法的重復性進行驗證；利用西湖龍井茶中含量較高、帶有顯著清香特征的正己醛計算實驗方法的加標回收率，在2 組標準混合茶粉中分別定量加入2 種不同質量濃度的正己醛標準溶液10 μL（84.315 0、42.157 5 μg/mL），而后采用已優化后的SBSE-GC-MS方法對其進行萃取分析，通過軟件定性、峰面積計算后，按照加標回收率公式計算，對SBSE實驗方法的有效性進行驗證。

表4 正己醛的加標回收率檢測結果Table 4 Recoveries of n-hexanal in spiked tea

結果表明，5 次樣品重復的化合物總峰面積之間的RSD為8.23%。加標回收率測定結果如表4所示，高添加量條件下（0.843 2 μg），該方法對正己醛的回收率為115.11%；低添加量條件下（0.421 6 μg），該方法對正己醛的回收率為108.99%，均在80%～120%之間，且RSD均小于10%（n=3），說明該方法的重復性及準確度良好，適用于西湖龍井茶的香氣分析。

2.4 西湖龍井茶揮發性香氣成分分析

表5 西湖龍井茶揮發性香氣成分SBSE-GC-MS分析結果Table 5 Volatile aroma compounds of “XihuLongjing” tea identi fi ed by SBSE-GC-MS

續表5

續表5

續表5

通過譜庫檢索并結合正構烷烴，對最優組合茶樣進行分析，由表5可知，共定性出173 種共有香氣成分，其中，相對含量較高的化合物有正己醛、苯甲醛、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、芳樟醇及其氧化物、香葉醇、吲哚、反-β-紫羅蘭酮等。

圖6 西湖龍井茶中揮發性香氣化合物種類及其相對含量Fig. 6 Kinds and relative contents of volatile aroma compounds in“XihuLongjing” tea

根據香氣成分化學結構的差異，對檢測得到的西湖龍井茶中揮發性香氣成分進行分類，各類別化合物的數量和相對含量如圖6所示。可見，通過SBSE-GC-MS分析得到的西湖龍井茶香氣化合物主要包含烯醇類3 種（1.80%）、烯類11 種（3.99%）、烷烴類37 種（16.07%）、醛類15 種（8.96%）、烯醛類4 種（3.34%）、醚類2 種（0.07%）、醇類17 種（21.85%）、酯類22 種（8.65%）、內酯類5種（3.14%）、烯酯類9 種（1.57%）、烯酮類5 種（2.15%）、酮類16 種（6.36%）、有機酸類3 種（0.86%）、含硫化合物3 種（0.24%）、氮雜環化合物3 種（0.52%）、氧雜環化合物3 種（3.61%）、芳香烴15 種（6.66%）。烷烴、酯類及醇類化合物是西湖龍井茶中化合物種類最多的成分，相對含量較高的烷烴類物質有2,2,4,6,6-五甲基庚烷、十四烷。十四烷帶有微弱蠟燭氣味，對綠茶的香氣類型具有關鍵作用[26]；水楊酸甲酯（冬青油氣味）、鄰苯二甲酸二異丁酯（微具芳香氣味）是相對含量較高的酯類物質，它們也是西湖龍井中含量較高的化合物[27]；芳樟醇和香葉醇是含量較高的醇類物質，SBSE-GC-MS方法檢測到的西湖龍井茶樣品中芳樟醇的相對含量為2.06%，而香葉醇的相對含量則達到了13.60%。芳樟醇是茶葉中重要的香氣物質之一，具有木香、花香特征[28]；香葉醇具有玫瑰花香、薔薇香，也是西湖龍井茶中的典型香氣成分[27]。有研究表明，香葉醇與芳樟醇、壬醛、癸醛、β-環檸檬醛等成分一起，對構成綠茶的特征風味同樣具有重要作用[29]。

對比近年來有關西湖龍井茶香氣萃取方法的研究報道，可以發現不同香氣萃取方法分析得到的西湖龍井香氣成分之間也存在較大差異。例如，汪厚銀等[20]采用了微阱捕集法（動態頂空）萃取方法結合GC-MS對西湖龍井茶進行了香氣成分分析，共檢測出了43 種香氣成分，主要香氣成分中烯烴類14 種、醇類9 種、酮類6 種、醛類4 種、雜環類4 種以及硫化物2 種；孫彥等[29]對6 種龍井茶進行SDE-GC-MS分析，共分離出100 個峰，鑒定得到了62 種香氣成分，并發現西湖產區的龍井茶香氣總量占絕對優勢；代毅等[30]采用SPME結合GC-MS技術從西湖龍井茶種鑒定出26 個組分，同時發現己酸-反-2-己烯酯是其西湖龍井樣品中含量最高的成分；此外，肖作兵等[7]采用HS-SDE提取西湖龍井茶的香氣成分，該研究共鑒定出75 種香氣成分，包括醇類24 種、醛類8 種、酮類10 種、酯類6 種、雜環類16 種及其他類11 種。

分析近年有關西湖龍井茶的香氣研究報道存在差異的原因，與不同的萃取方法有直接的關系，這些方法均具有各自優點，也都存在萃取效果及實驗操作上的不足。例如，吹掃捕集方法不需要有機試劑，同時污染小，操作簡單，但其主要針對低沸點揮發性組分的富集[31]；減壓蒸餾萃取法方法可以較好還原茶湯的香氣，但回收率較低[32]；SPME同樣具有分析樣品用量少，方法簡單、快速、費用低等優點，且SPME的萃取涂層種類豐富，選擇性較高，在肉類以及乳制品風味研究中應用廣泛[33-34]；但由于SPME萃取頭吸附相體積的限制，SPME吸附的揮發性香氣成分總量對比SBSE仍較少；SDE方法雖操作簡單，僅需少量樣品，但提取過程中的高溫環境易導致茶葉香氣物質發生氧化、降解等化學反應，繼而造成了茶香與實際不符[35]。

SBSE技術與常見的其他茶葉香氣萃取技術相比，具有不使用有機溶劑、所需樣品量少（本實驗中僅需600 mg）、萃取量大、簡單易操作、茶葉香氣成分還原度高、回收率及重復性較好等特點，因此在西湖龍井茶香氣成分萃取上具有一定的優勢。但值得注意的是，從西湖龍井香氣成分分析結果看，SBSE方法目前仍存在一些技術缺陷：首先，SBSE方法可以大量萃取到茶湯中的揮發性組分，但由于揮發性香氣成分的沸點存在差異，因此存在一部分低沸點揮發性香氣成分萃取初期大量逸出茶湯，無法較好地被攪拌棒吸附；其次，本實驗使用的攪拌棒萃取涂層為單一PDMS，該涂層針對非極性及極性較弱的非揮發性成分富集能力較強，然而該涂層無法較好地富集極性成分；最后，由于本實驗中攪拌棒處于浸沒于茶湯中狀態，這使得茶湯當中一部分極性較小的非揮發性成分也在一定程度上被萃取涂層吸附，因此本實驗條件下的香氣分析結果相對于純揮發性成分較為復雜，后期數據處理時需要更進一步對分析組分進行判別鑒定；鑒于此，在后續研究中考慮改進SBSE萃取方法，如同時使用PDMS及EG-Silicone 2 種攪拌棒進行香氣成分萃取，從而使富集成分極性范圍更廣；采用SBSE結合吹掃捕集方法，從而實現對頂空及茶湯中香氣成分的同時萃取；SBSE攪拌棒頂空處理實現對茶湯上方揮發性成分的富集等。此外，對比GC-MS技術，全二維氣相色譜-飛行時間質譜技術其分析方法的靈敏度更高、峰容量更大、檢測得到的成分更多[36]，因此，本實驗在后續的西湖龍井香氣研究中，將盡可能把SBSE方法與全二維氣相色譜-飛行時間質譜結合，并綜合氣相色譜在線嗅聞技術與香氣活度值分析方法，對西湖龍井茶的香氣成分進行系統全面的分析研究。

3 結 論

本實驗采用SBSE前處理方法萃取西湖龍井茶的香氣成分，并結合GC-MS進行香氣分析；通過優化攪拌棒類型、茶水比、萃取時間、萃取溫度、攪拌棒轉速、NaCl溶液質量分數等萃取參數，確定了適用于西湖龍井茶的SBSE最優萃取條件：PDMS涂層攪拌棒，600 mg茶粉，10 mL 80 ℃熱水沖泡，質量分數5% NaCl溶液，1 250 r/min條件下攪拌萃取90 min，而后進行GC-MS分析。經SBSE-GC-MS分析，從西湖龍井茶中檢測出17 類共173 種揮發性成分，主要包括37 種烷烴類、22 種酯類、17 種醇類、16 種酮類、15 種芳香烴、15 種醛類、11 種烯類、9 種烯酯類、5 種內酯類化合物、烯酮類5種、烯醛類4 種、3 種烯醇類、3 種氧雜環類、3 種氮雜環類、3 種含硫化合物、3 種有機酸類化合物以及2 種醚類化合物；正己醛、苯甲醛、2,2,4,6,6-五甲基庚烷、(E,E)-2,4-庚二烯醛、苯乙醛、芳樟醇及其氧化物、香葉醇、吲哚、反-β-紫羅蘭酮具有較高的相對含量；對比其他香氣萃取方法，SBSE具有萃取量大、操作更簡易、茶葉香氣成分還原度高、回收率及重復性較好等特點，在西湖龍井茶香氣成分萃取上具有明顯的優勢，有望成為今后茶葉揮發性成分分析的重要研究方法之一。