頂空-固相微萃取法與水蒸氣蒸餾法提取山銀花揮發性組分的比較

張鵬云，管 維，李 蓉,*，龍春霞，盧俊文，林淑綿，張 峰

（1.中山海關技術中心，廣東 中山 528400；2.洛陽市疾病預防控制中心，河南 洛陽 471000；3.廣東藥科大學公共衛生學院，廣東 中山 528458；4.中國檢驗檢疫科學研究院食品安全研究所，北京 100176）

山銀花（Flos Lonicerae）為忍冬科植物灰氈毛忍冬、紅腺忍冬、華南忍冬或黃揭毛忍冬的干燥花蕾或帶初開的花[1]，主要分布我國的華南地區，如四川、廣東、湖南、貴州、浙江等[2]。2014年國家衛生健康委員會將山銀花列入藥食同源產品目錄中[3]。山銀花含有黃酮類、有機酸類、皂苷類和揮發油等多種功效成分[4]，在抗炎退熱、抗腫瘤、抗過敏與抗動脈粥樣硬化等方面有很強的生理活性[5]。其揮發油中的檸檬烯具有抑菌、抗腫瘤、抗氧化、抗炎、祛痰平喘、利膽溶石等作用[6]；α-姜黃烯有助于內分泌調節，且具有抗病毒、抗腫瘤、抑癌、抑菌等生理活性[7]；α-松油醇對多種常見病原菌有較強的抑制作用，還具有抗痙攣、抗炎等生理活性[8]；芳樟醇具有鎮痛、抗焦慮、抗炎、抗腫瘤、抗菌、抗氧化等藥理活性，在臨床中應用廣泛[9]。因此，研究山銀花揮發油成分，對其開發利用、質量控制具有重要作用。

目前，對山銀花揮發油的提取多采用水蒸氣蒸餾（steam distillation，SD）法和超臨界CO2流體萃取等方法[10-12]，而頂空-固相微萃取（head space-solid phase microextraction，HS-SPME）技術是近些年發展起來的前處理方法，它集采樣、萃取、濃縮、進樣于一體，提取溫度低、樣品用量少、易實現自動化、操作簡便[13-14]，還未發現其用在山銀花揮發油的提取中。另外，天然植物揮發油的化學成分存在許多同系物或同分異構體，僅憑譜庫檢索容易出現定性錯誤[15]，保留指數作為色譜的定性參數，能夠反映組分與色譜柱固定相間的相互作用，具有標準統一、準確度高和重復性好的優點，可用于鑒定復雜樣品的組分[16-17]。

本研究以山銀花為研究對象，通過正交試驗優化HS-SPME法提取山銀花揮發性成分的條件，并比較HSSPME法和SD法提取物的組成，以期得出兩種手段的共同點和差異性，為山銀花的鑒別與品質評價提供技術保障，為山銀花的進一步研究開發提供數據支持。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

山銀花干花（產地：湖南；批號：160501；水分質量分數9.7%） 湖南省南國藥都中藥飲片有限公司；氯化鈉、無水硫酸鈉、正己烷（均為分析純） 廣州化學試劑廠；正構烷烴混合標準品（C7～C40） 美國o2si公司。

1.2 儀器與設備

TSQ 8000氣相色譜-三重四極桿串聯質譜儀（配電子電離源及Xcalibur數據處理系統、SPME自動進樣手柄） 美國Thermo Fisher公司；7890B-7200氣相色譜-四極桿-飛行時間質譜（gas chromatography-quadrupole timeof-flight mass spectrometry，GC-QTOF MS）儀（配有電子電離源、MassHunter B.07 SP2工作站） 美國安捷倫公司；50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 樣品前處理方法

1.3.1 HS-SPME法

準確稱取1.0 g山銀花置于20 mL頂空瓶中，自動進樣器將頂空瓶放在60 ℃的孵化爐中平衡25 min后，將老化過的50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取頭插入樣品瓶頂空部分進行60 min熱吸附，然后將吸附后的萃取頭插入氣相色譜進樣口，在250 ℃解吸5 min，最后進入氣相色譜-串聯質譜（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）系統進行分離檢測。

1.3.2 SD法

將山銀花剪成約1 cm的小段，準確稱取120.0 g放入2 000 mL的圓底燒瓶中，加入1 200 mL飽和氯化鈉溶液，浸泡過夜，參照揮發油測定法甲法提取6 h，靜置30 min，加入2 mL正己烷萃取[1]，在萃取液中添加適量無水硫酸鈉除水干燥，最后經0.45 μm有機濾膜過濾后作為供試樣品進入GC-QTOF MS系統檢測。

1.3.3 儀器條件

1.3.3.1 GC-MS分析條件

色譜條件：TR-PESTICIDE彈性石英毛細柱（30 mh0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至200 ℃，保持2 min，再以10 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持2 min；分流比10∶1，色譜柱流速1.2 mL/min；進樣口溫度為250 ℃；載氣：99.999%高純度氦氣。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度280 ℃；傳輸線溫度280 ℃；電子轟擊能量70 eV；掃描方式全掃描；質量掃描范圍m/z 40～450 。

1.3.3.2 GC-QTOF MS分析條件

色譜條件：色譜柱為HP-5SILMS毛細管柱（30 mh 0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速為1.2 mL/min（恒流模式），分流比為10∶1；進樣口溫度為250 ℃；程序升溫條件：初始溫度40 ℃，保持2 min，然后以5 ℃/min的速率升溫至250 ℃并保持5 min；進樣量1 μL。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；電子能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；全掃描范圍m/z 35～450；溶劑延遲4.0 min。

1.3.4 保留指數的計算

C7～C40正構烷烴混標在與山銀花樣品相同的氣相條件下得到總離子流圖后，工作站根據保留指數計算公式自動得出各揮發性組分的保留指數。

1.3.5 定性分析

對1.3.3.1節方法得到的總離子流圖通過自動質譜退卷積定性系統（automated mass spectral deconvolut ion and identification system，AMDIS）進行處理，所分辨的質譜在NIST 2.2標準譜庫中檢索，根據匹配度和保留指數進行核對，只記錄正匹配和反匹配均大于800的化合物，并用峰面積歸一化法計算山銀花各揮發性物質的相對含量。

對1.3.3.2節方法得到的總離子流圖根據譜庫檢索結果，結合準確質量測定和保留指數對色譜峰進行定性分析，并運用峰面積歸一化法計算山銀花揮發油各組分的相對含量。

2 結果與分析

2.1 HS-SPME條件的選擇

HS-SPME法的萃取效果受萃取時間、萃取溫度、平衡時間、解吸時間等因素的影響[18]，因此本研究用峰面積代表萃取物質的量，出峰數代表萃取物質的種類，選擇總峰面積和總峰數兩個指標考察各因素的萃取效果，確定HS-SPME山銀花揮發性成分的較優條件。

2.1.1 單因素試驗結果

2.1.1.1 萃取溫度的選擇

圖1 不同因素對山銀花揮發性成分萃取效果的影響Fig. 1 Effect of various factors on the extraction of volatile compounds from Flos Lonicerae

稱取山銀花樣品1.0 g，在萃取時間30 min、平衡時間10 min、解吸時間3 min的條件下，研究不同萃取溫度（50、60、70、80、90 ℃）的萃取效果，每個水平重復3 次，結果如圖1A所示。隨著萃取溫度的升高，山銀花揮發性成分的總峰面積先增大后減小，在70 ℃時達到最大值，而峰數目也呈先增加后減小的趨勢，在80 ℃時達到最大。進一步分析時發現當萃取溫度超過70 ℃時，先出峰的一些組分響應變低，峰面積減小，而這些組分是山銀花揮發性物質的主要成分。這可能是因為溫度升高后加快了分子運動速率，使目標物更易被富集吸附，才出現峰數目和峰面積都增大的現象[19]，但溫度過高時，低沸點組分在競爭吸附中處于劣勢地位，造成部分流失[20-21]。為了能更真實地反映山銀花的香氣組成，本研究選擇70 ℃為較優萃取溫度。

2.1.1.2 萃取時間的選擇

在2.1.1.1節結果的基礎上，研究萃取時間（30、40、50、60 min）對山銀花揮發性成分的影響，每個水平重復3 次，結果如圖1B所示。隨著萃取時間的延長，揮發性成分的總峰面積不斷增大，當萃取時間超過50 min時變化不明顯；而峰數目隨著萃取時間的延長呈先上升后降低趨勢，并在50 min時達到最大值。這是因為萃取時間可以影響頂空和萃取頭纖維涂層之間分析物的平衡[22]。當萃取時間不足時，目標物被吸附不充分；萃取時間過長時，已經被吸附的組分可能出現脫附現象，造成峰數減少[23-24]。綜合考慮，本研究將萃取時間設為50 min。

2.1.1.3 解吸時間的選擇

在2.1.1.1節和2.1.1.2節結果的基礎上，研究不同解吸時間（3、4、5、6、7 min）的萃取效果，每個水平重復3 次，結果如圖1C所示。當解吸時間延長時，揮發性物質的峰數目基本不變，而總峰面積在3～5 min時變化不明顯，超過5 min時略有減小，說明5 min時已解吸完全。若解吸時間不足，不但影響檢測結果，還會污染后續樣品，但解吸時間過長會縮短萃取頭的使用壽命[25-26]。因此，本研究選擇5 min為較佳的解吸時間。

2.1.1.4 平衡時間的選擇

在以上結果的基礎上，研究不同平衡時間（10、15、20、25、30 min）的萃取效果，每個水平重復3 次，結果如圖1D所示。隨著平衡時間的延長，揮發性成分的總峰面積和峰數目均呈上升趨勢，當平衡時間超過25 min時，變化平緩。這說明25 min時揮發性物質在氣相中已達到平衡狀態，因此本研究選擇平衡時間為25 min。

2.1.2 正交試驗結果

在單因素試驗基礎上，選擇萃取溫度、萃取時間和平衡時間作為3 個影響因素，采用L9（33）正交表進行3因素3水平正交試驗，優化試驗參數，試驗設計及結果如表1所示。

表1 正交試驗設計及結果Table 1 Results and analysis of orthogonal array experiments

由表1可知，當以峰數目為萃取效果考察指標時，較優組合為A3B3C2，從極差可知，3 個因素對萃取效果的影響程度為A＞B＞C，即萃取溫度影響最大，萃取時間和平衡時間次之；當以總峰面積為考察指標時，較優組合為A1B3C2，從極差可知，3 個因素對萃取效果的影響大小同樣為A＞B＞C。由此可以看出，萃取溫度對峰數目和峰面積影響均較大，但是2 個考察指標得到的萃取溫度不一致，這可能是因為溫度較高時，高沸點化合物析出被萃取，峰數目增多，但是競爭吸附使低沸點組分被吸附量減少，響應降低，總峰面積減小。而從離子流圖中看出，山銀花揮發性成分主要是低沸點化合物，綜合考慮最終確定HS-SPME法萃取山銀花揮發性成分的較優組合為A1B3C2，即：萃取溫度60 ℃、萃取時間60 min、平衡時間25 min。

2.2 HS-SPME-GC-MS法的結果與分析

按照2.1節得到的HS-SPME條件對山銀花揮發性成分進行萃取并通過GC-MS進行檢測，得到山銀花揮發性物質的總離子流圖（圖2），再利用AMDIS和保留指數進行定性分析。結果顯示，共檢測到73 個峰，鑒定出59 種組分（表2），占揮發性物質總量的97.17%，分別為17 種萜烯類化合物（61.63%）、13 種醇類化合物（12.98%）、9 種醛類化合物（8.23%）、5 種酮類化合物（2.65%）、7 種酯類化合物（2.60%）和8 種其他種類化合物（9.08%）。其中，檸檬烯的含量最高，占揮發性物質總量的51.52%，其次為4-異丙基甲苯（7.46%）、正己醛（4.52%）、β-蒎烯（3.80%）、正辛醇（2.96%）、正己醇（2.37%）、苯乙醇（1.69%）、壬醛（1.67%）、樟腦（1.25%）、β-月桂烯（1.24%）等。

圖2 HS-SPME提取物的總離子流圖Fig. 2 Total ion current chromatogram of HS-SPME extract

表2 HS-SPME提取物的GC-MS分析Table 2 Results of GC-MS analysis of HS-SPME extract

續表2

2.3 SD-GC-QTOF MS法分析

圖3 SD提取物的總離子流圖Fig. 3 Total ion current chromatogram of SD extract

利用GC-QTOF MS檢測SD法提取的山銀花揮發油，得到山銀花揮發油總離子流圖（圖3），并對各色譜峰進行定性分析。結果顯示，共檢測到102 個峰，鑒定出其中68 種組分（表3），占揮發性物質總峰面積的91.69%，分別為20 種醇類化合物（36.44%）、7 種醛類化合物（14.20%）、10 種酮類化合物（10.35%）、6 種酚類化合物（9.54%）、10 種酯類化合物（7.85%）、3 種酸類化合物（1.70%）和12 種其他種類化合物（11.62%）。其中含量最高的組分為α-松油醇（9.45%），其次是芳樟醇（8.23%）、苯甲醛（7.00%）、4-乙烯基-2-甲氧基苯酚（5.54%）、大馬士酮（4.61%）、苯乙腈（4.54%）、脫氫芳樟醇（4.20%）、3-乙烯基吡啶（3.75%）、3-糠醛（2.95%）、順-芳樟醇氧化物（2.83%）等。

表3 SD提取物的GC-QTOF MS分析結果Table 3 Results of GC-QTOF MS analysis of SD extract

續表3

2.4 HS-SPME法與SD法提取物揮發性組分比較

經比較發現，HS-SPME法和SD法提取物的組分種類及含量差異較大。兩種方法共鑒定出116 種化合物，其中有11 種為共有組分，即：(E)-2-己烯醛、D-檸檬烯、芳樟醇、苯乙醇、樟腦、右旋香芹酮、百里酚、α-姜黃烯、雪松醇、2,2’,5,5’-四甲基聯苯基和鄰苯二甲酸二丁酯，共有組分占各自總量的56.48%（HS-SPME法）和12.38%（SD法）。HS-SPME法提取物的主要成分為萜烯類化合物，含量最高的D-檸檬烯占總量的51.52%，其次為醇類化合物，而SD法中僅鑒定出兩種萜烯類化合物，分別為D-檸檬烯和α-姜黃烯且均在HS-SPME法中檢出；SD法提取物的主要成分為醇類化合物，其次為醛類化合物，含量最高的α-松油醇未在HS-SPME法中檢測到。

這可能是因為HS-SPME法提取溫度低，加熱時間短，對一些低分子質量、高揮發性物質有較強的富集作用，組分不易被破壞[27-28]。而傳統的SD法樣品用量大，浸泡和提取時間長，加熱溫度高，所以提取的揮發油組分沸點較高，但這可能會使部分沸點低、揮發性強的組分流失，一些組分甚至發生分解或變性，易破壞山銀花原有的香氣成分[29-30]。由此可知，HS-SPME法對一些低沸點的萜烯類和小極性化合物有較好的選擇性；SD法更適合分析高沸點的酯類及大極性的醇類等化合物。

3 結 論

本研究通過單因素試驗和正交試驗優化了HS-SPME法萃取山銀花揮發性成分的條件，即：50/30 μm DVB/CAR/PDMS SPME萃取頭、1.0 g樣品、萃取溫度60 ℃、萃取時間60 min、平衡時間25 min以及解吸時間5 min。在該優化條件下，鑒定出59 種組分，占揮發性物質總量的97.17%，含量最高的組分為檸檬烯。

比較HS-SPME法和SD法提取物的共性和差異。結果顯示，二者的組分種類及含量差異較大，共鑒定出116 種化合物，有11 種共同組分。其中，HS-SPME法提取物中低沸點、易揮發的萜烯類化合物較多，SD法提取物中酯類及大極性的醇類化合物較多。因此，結合2 種方法共同分析山銀花的揮發性成分能夠得到更加全面的信息。本研究為山銀花藥材及相關產品的質量評價和控制提供了參考價值。