套袋對‘瑞雪’蘋果香氣成分的影響及相關基因表達分析

馮帥帥，閆成太，張天皓，張 莉，吉苗苗，王 帆，高 華*

（西北農林科技大學園藝學院，陜西 楊凌 712100）

‘瑞雪’是由‘秦富1號’ב粉紅女士’雜交選育而成的黃色晚熟蘋果品種，其果實肉質細脆，酸甜適口，汁液多，風味濃[1-2]。特別是‘瑞雪’果實具有的獨特風味被廣泛關注，而果實香氣是風味品質形成的重要因素之一。套袋是蘋果栽培普遍使用的技術，對于改善果實外觀、提高果面光潔度、降低果銹指數和日灼果的發生率有明顯作用，但相關研究表明套袋會降低果實的內在品質，不利于果實整體風味的形成[3]。

套袋會降低‘紅星’和‘長富2號’果肉中酯類、糖、有機酸含量的積累量，以及蘋果果皮中酚類化合物的濃度[4-6]。但套袋如何影響香氣物質的合成，目前的研究報道較少。研究表明脂氧合酶（lipoxygenase，LOX）、醇脫氫酶（alcoholdehydrogenase，ADH）、脂氫過氧化物裂解酶（hydrogen peroxide repressible enzyme，HPL）、醇酰基轉移酶（alcohol acyltransferase，AAT）是影響‘南果梨’香氣物質合成的關鍵酶[7]。自美味番茄以來[8]，在生物信息學方面，果實香氣的研究已經成為當前的熱點。研究表明MdAAT和MdLOX基因在蘋果風味揮發物表達中起重要作用，同時全基因組關聯研究揭示蘋果揮發物質的遺傳與果實質地結構存在互作，證明部分揮發物質與果膠酶基因相互關聯，說明果實質地結構在蘋果香氣釋放中起到關鍵作用[9-10]。這些研究為本實驗提供理論依據。

本實驗在前人研究基礎上，對套袋‘瑞雪’果實和不套袋‘瑞雪’果實香氣成分的差異進行研究，并與基因表達和果袋內外溫濕度差異相結合。為進一步推測套袋如何降低蘋果果實的香氣物質種類和香氣物質總含量，以及提高‘瑞雪’蘋果的風味品質，進一步改良蘋果品質提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

實驗于2018年在陜西省白水縣西北農林科技大學蘋果試驗站進行，選取8 a生M26自根砧栽培的‘瑞雪’蘋果樹3 株，重復3 次。在盛花期后60 d，對果實進行套袋處理。在套袋后165、180、195、210 d 4 個時期采樣，選取無病蟲害、無機械損傷的果實。每次采樣嚴格按照每棵果樹不同部位均勻采摘6 個果實，分別對套袋和不套袋果實進行后期實驗處理。實驗果樹的立地栽培條件、生長勢基本一致，管理水平相同。

1.2 儀器與設備

PAL-1手持數顯折光儀 日本愛拓公司；Fruit Acidzty Meter GMK-835型酸度計 韓國G-WON公司；Trace GC Ultra氣相色譜儀、ISQ & Trace ISQ氣相色譜-質譜聯用儀 美國賽默飛科技有限公司；ABI StepOnePlusTM熒光定量儀器 美國應用生物系統公司；ZDR-20溫濕度記錄儀 浙江大學電氣設備廠。

1.3 方法

1.3.1 溫濕度測定

采用ZDR-20溫濕度記錄儀記錄‘瑞雪’蘋果自套袋開始共128 d的溫濕度數據，具體方法：將2 個ZDR-20溫濕度記錄儀懸掛于樹上，1 個探頭放置于袋內，1 個放置袋外，測量袋內外溫濕度。

1.3.2 乙烯含量測定

根據Nimitkeatkai等[11]的方法進行測定。將6 個蘋果放入密封罐中，并在25 ℃密閉2 h，抽取1 mL氣樣，使用Trace GC Ultra氣相色譜儀測定，重復3 次。

1.3.3 色譜條件

HP-INNOWax毛細管色譜柱（60 mh0.25 mm，0.25 μm）；載氣為高純氦氣，流速1.0 mL/min；進樣口溫度230 ℃；不分流進樣。采用程序升溫，起始溫度40 ℃，保持3 min；以5 ℃/min升至150 ℃，再以10 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

1.3.4 質譜條件

電子電離源；電子能量70 eV；離子源溫度240 ℃；傳輸線溫度240 ℃；開始采集時間2.0 min。

1.3.5 定性與定量

未知化合物質譜圖經計算機檢索同時與NIST 05質譜庫相匹配，確認各種揮發性成分；定量方法按峰面積歸一化法求得各成分相對含量，并選擇2-壬酮為內標進行定量。

1.3.6 總RNA提取和cDNA合成

總RNA的提取采用改良十六烷基三甲基溴化銨法，參照Gambino等[12]的方法，對提取步驟進一步優化改良，然后根據Takara公司提供的PrmieScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒和方法步驟進行cDNA合成。

1.3.7 實時定量聚合酶鏈式反應（polymerase chain reaction，PCR）分析

用于實時定量PCR分析的寡核苷酸引物設計和方法步驟采用Espley等[13]的方法，或采用EST序列信息同源比對設計，或者參考相關文獻[14-15]基礎上引用。所獲得引物核苷酸序列見表1，然后使用Vazyme提供的試劑ChamQTMSYBRR qPCR Master Mix和方法進行定量分析，使用ABI StepOnePlusTM熒光定量儀測定。使用MdActin進行歸一化，重復3 次，同時使用盛花期后165 d套袋‘瑞雪’蘋果的樣本（指定一個任意數量的“1”）作為校準器，計算結果的相對數量。

表1 實時定量PCR引物核苷酸序列Table 1 Nucleotide sequences of primers used for quantitative RT-PCR

1.4 數據處理

本研究通過Excel 2007進行實驗數據的匯總處理，SPSS 21.0軟件進行果實香氣物質的主成分分析，運用SigmaPlot 12.5軟件作圖分析。

2 結果與分析

2.1 套袋對‘瑞雪’果實內在品質的影響

圖1 套袋對‘瑞雪’果實品質的影響Fig. 1 Effect of bagging on the quality of ‘Ruixue’ apples

絕大多數的香氣物質是植物次生代謝的產物，次生代謝的進行是以初生代謝為基礎，而可溶性固形物主要是由植物初生代謝產物構成。圖1A表明，‘瑞雪’蘋果果實可溶性固形物含量隨著采摘時間的延長，逐漸增加，盛花期后210 d數據顯示，不套袋的果實可溶性固形物質量分數可達到18.15%，套袋果實為17.00%，數據分析顯示兩者差異顯著。如圖1B所示，可滴定酸含量隨著時間延長呈現逐漸減少的趨勢，其中在盛花期后180、195 d，不套袋果實和套袋果實差異顯著，但到210 d兩者差異不顯著。如圖1C所示，‘瑞雪’果實糖酸比在逐步增加，在210 d，不套袋果實糖酸比為60.41，套袋果實為59.61，但套袋果實和不套袋果實整體看，差異并不顯著，這與郭夢月等[2]研究結果一致。以上數據表明，雖然在糖酸比上套袋果實和不套袋果實每個采摘時期相對差異不明顯，但在可溶性固形物和可滴定酸方面，每個時期還是有一定差異。整體看不套袋果實可溶性固形物含量高于套袋果實。

2.2 套袋對‘瑞雪’蘋果香氣成分的影響

香氣成分用氣相色譜-質譜檢測，每個時期的樣本分別進行3 次平行檢測，取其平均值，由表2可知，在‘瑞雪’蘋果中共檢測出68 種香氣物質，其中套袋果實有46 種物質，不套袋果實共有62 種物質。套袋果實165 d時香氣種類一共有23 種，到210 d達到36 種，不套袋果實則由165 d的26 種增加到210 d的46 種，說明香氣物質的種類會隨著果實成熟度增加而增加，這與乜蘭春等[16]研究一致。其中14 種香氣物質在套袋和不套袋果實中每個時期都被檢測出，它們分別為正己醛、3-己烯醛，2-己烯醛、反-2-辛烯醛、乙酸己酯、丙酸己酯、辛乙烯二醇單正十二烷基酯、異戊酸己酯、2-甲基丁酸戊酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸-2-甲基丁酯、1-辛烯-3-酮、甲基庚烯酮、α-法呢烯。

表2 套袋處理‘瑞雪’果實揮發性成分的氣相色譜-質譜分析Table 2 GC-MS analysis of volatile compounds in bagged ‘Ruixue’ apples

續表2

由表2可以看出，套袋果實和不套袋果實在香氣物質的種類和相對含量上存在明顯差異，14 種共有物質表明在套袋果實中正己醛、2-己烯醛的組分相對含量遠高于不套袋果實，但是乙酸己酯、丙酸己酯、異戊酸己酯、2-甲基丁酸戊酯的組分相對含量不套袋果實高于套袋果實。同時由圖2可以看出，套袋果實總香氣物質由165 d的775.11 μg/kg上升到210 d的2 960 μg/kg，在180～195 d總香氣物質上升明顯。在165 d醛類占總香氣物質的71.40%，遠高于不套袋果實的37.05%。不套袋果實總香氣物質由165 d的2 113.37 μg/kg上升到210 d的4 488.42 μg/kg，可以看出套袋果實總香氣物質在每個采樣期都低于不套袋果實。同時不套袋果實每個時期的酯類相對含量分別為32.72%、39.73%、46.52%、56.27%，高于套袋果實的17.66%、18.46%、37.26%、41.45%。同時還發現在195 d以前，套袋處理α-法呢烯含量遠低于不套袋果實。相關研究表明，酯類和法尼烯類物質是對蘋果風味貢獻最大的2 類揮發性化合物[17]。本實驗說明套袋會降低總香氣物質含量，延遲醛類物質向酯類物質的轉化。

圖2 套袋對總香氣物質含量和各類香氣組分的影響Fig. 2 Effect of bagging on contents of total aroma substances and various aroma components

2.3 套袋處理對‘瑞雪’香氣合成基因的影響

圖3 套袋對香氣合成基因表達的影響Fig. 3 Effect of bagging on the expression levels of genes related to aroma synthesis

通過對表1的12 個與香氣合成的基因定量分析，由圖3可知，在不套袋‘瑞雪’果實里參與香氣合成的MdBCAT2和MdAADC基因的相對表達量顯著降低，而其他10 個基因的相對表達量要高于套袋果實，特別是MdLOX和MdADH3基因差異最為顯著，不套袋‘瑞雪’MdLOX基因在195 d時的相對表達量是套袋果實的8 倍，而MdADH3基因的相對表達量在180 d是套袋果實相對表達量的90 倍。MdLOX基因是LOX通路的關鍵基因，LOX通路又是脂肪酸形成的重要通路之一[18]。ADH成員基因作為LOX通路和丙酮酸通道的重要組成部分，也參與了酯類的合成。MdArAT、MdACP2、MdMCAT、MdACPD、MdHPL、MdAOS、MdPDC2、MdAAT2這8 個基因在套袋處理中也出現不同程度的下調，它們也是參與香氣合成中的關鍵基因[19]。結果表明雖然在果實的不同采摘時期隨著果實的成熟度增加各個基因的相對表達量都在變化，但綜合分析表明套袋會影響蘋果果實香氣合成的相關基因的表達，從而抑制蘋果香氣物質的合成。

2.4 套袋對‘瑞雪’蘋果乙烯釋放量的影響

圖4 套袋對‘瑞雪’蘋果乙烯釋放量（A）和相關基因表達量（B）的影響Fig. 4 Effect of bagging on ethylene release (A) and related gene expression levels (B) in ‘Ruixue’ apples

蘋果是呼吸躍變型果實，乙烯的釋放量是果實成熟度衡量的標準之一，為此對樣本各時期的乙烯釋放量和乙烯合成基因MdERS2的相對表達量測定分析。圖4A表明，不套袋‘瑞雪’蘋果的乙烯釋放量由165 d的0.43 mg/（kggh）上升到210 d的17.37 mg/（kggh），套袋果實乙烯釋放量則由165 d的0.38 mg/（kggh）上升到210 d的5.70 mg/（kggh）。套袋果實的乙烯釋放量要明顯低于不套袋果實，MdERS2基因定量結果也同樣表明在套袋果實的相對表達量要低于不套袋果實（圖4B）。相關研究表明，乙烯釋放量與MdERS2表達正相關，同時乙烯的釋放也會調控‘南果梨’香氣的產生[20-21]。研究結果表明套袋會減少蘋果果實乙烯的釋放量，負調控蘋果香氣的合成。

2.5 套袋對‘瑞雪’蘋果袋內溫濕度的影響

表3 套袋對果實逆境環境時長的影響Table 3 Effect of bagging on fruit growth under adverse environment h

為探究造成套袋果實和不套袋果實香氣合成的差異的原因，采用ZDR-20溫濕度記錄儀對蘋果果袋內和果袋外溫濕度進行實時測量。自套袋開始，共測量了3 312 h。果袋內與果袋外相比在白天溫度和夜晚濕度兩方面差別較大。套袋果實袋內最高溫度為35.81 ℃，不套袋則為31.82 ℃。特別是在套袋60～90 d時，白天果袋內平均溫度要比果袋外高2～4 ℃。濕度表現在夜間果袋內要比果袋外的高，特別是在套袋后60～90 d時。同時還發現果袋內溫濕度晝夜變化明顯比果袋外溫濕度變化大。由表3可知，果袋外的不良環境時長為336 h，果袋內則為670 h，兩者相差將近2 倍。蘋果在逆境環境下會導致醛類物質積累，特別是溫度對果實酸濃度和糖代謝的降低有明顯的影響，其中年平均溫度、最低溫度和4ü10月平均溫度對果實質量影響較大[22-23]。相關研究表明，低溫會抑制乙烯的生物合成[24]，研究發現果袋內低溫高濕環境時長是195 h，是果袋外的2.75 倍。表明套袋形成了獨特的微域環境，這會給蘋果的生長帶來逆境脅迫，影響蘋果香氣物質的合成。

3 結 論

套袋為蘋果果實的生長發育提供了微域環境，這種環境增加了果實的逆境脅迫時間。這種脅迫對蘋果摘袋后變紅，有促進作用[25]，但本研究表明套袋會抑制蘋果果實香氣物質的產生，降低果實總香氣物質含量和香氣物質種類。根據前人研究報道，芳香生物合成途徑中的某些點受到乙烯的調控，乙烯積累量增加會促進香氣物質的產生[26-32]。本研究表明套袋會明顯抑制蘋果乙烯釋放和相關基因的表達。本實驗對12 個基因做了相關定量表達，結果表明套袋上調的基因有2 個，分別為MdBCAT2和MdAADC，前人實驗證明乙烯處理蘋果果實會下調這2 個基因表達，1-MCP處理會上調這2 種基因的表達[28]。MdArAT、MdACP2、MdMCAT、MdACPD、MdLOX、MdHPL、MdAOS、MdPDC2、MdADH3、MdAAT2這10 個基因在套袋果實中下調。這10 個基因都已被證實會促進香氣物質的產生[28-29]。特別是不套袋果實中MdLOX基因在195 d的相對表達量是套袋果實的8 倍，而MdADH3基因的相對表達量在180 d是套袋果實相對表達量的90 倍。而MdLOX、MdADH3基因是蘋果果實香氣合成中最重要的基因。同時對可溶性固形物的測定發現，套袋會降低果實可溶性固形物含量。由于香氣物質大多是次生代謝產物，而次生代謝產物是在初生代謝基礎上進行，推測這也會影響香氣物質的合成。

根據實驗數據，推測套袋造成的逆境環境包括高溫高濕、高溫低濕、低溫低濕、低溫高濕，這種環境脅迫會抑制蘋果果實乙烯的生物合成，而乙烯調控香氣合成相關基因表達，結果導致套袋蘋果果實香氣物質的合成減少。同時套袋也會導致蘋果果實可溶性固形物含量減少，但目前還沒有直接研究表明可溶性固形物含量的多少與蘋果香氣釋放的直接聯系。可溶性固形物和香氣的關聯原因可以利用代謝組學的知識和方法，有待進一步研究。

目前，蘋果香氣方面的研究隨著分子生物信息學發展有了很大的進步，但對于香氣物質合成的關鍵基因功能驗證并不深入。關于蘋果香氣閾值的測定和各個組分的相互作用，以及探究影響調控的相關基因進而明確香氣物質合成的機理是未來科研的主要方向，這對蘋果品質的改良和遺傳育種具有重要意義。