低溫浸漬對‘關口葡萄’干白葡萄酒風味物質的影響

朱艷霞，楊佳薈，王沙沙，蘇穎玥，常 遠，楊智剛，袁春龍*

（西北農林科技大學葡萄酒學院，陜西 楊凌 712100）

葡萄原料與釀造工藝是決定葡萄酒品質的2 個重要因素。在發酵前采用不同的取汁方法，可以將同一批白葡萄制成具有明顯不同口感特征的葡萄酒。澄清汁發酵是制作白葡萄酒最廣泛的方法，也是干白葡萄酒傳統釀造工藝。由于澄清汁發酵在釀造過程中，不需要進行浸漬，葡萄原料中的芳香物質很難進入到葡萄酒中，為提取葡萄原料中的芳香物質，釀酒師發明了冷浸工藝、超提工藝等。低溫浸漬，也叫冷浸漬，是指在葡萄醪進入乙醇發酵之前，在一段時間范圍內對其進行低于15 ℃的低溫處理，以促進葡萄中色素、酚類以及揮發性香氣物質的浸提作用，進而改善葡萄酒的品質[1]。目前采用低溫浸漬工藝釀造干紅葡萄酒已廣泛應用于實際生產中，僅有部分優質干白葡萄酒采用低溫浸漬技術，且對于低溫浸漬對葡萄酒品質的影響以經驗為主，因此研究低溫浸漬對葡萄酒風味物質的影響具有重要意義。已有研究表明，低溫浸漬處理可使薏斯琳干白葡萄酒香氣成分復雜，質量優于傳統釀造工藝[2]；6 ℃浸漬48 h后再發酵獲得的“玫瑰香”葡萄酒顏色淺于桃紅，果香濃郁，清新爽口，口感均衡，余味較長[3]。通過低溫浸漬處理的Tannat和Merlot葡萄酒總多酚、花青素、原花青素含量顯著增加[4]。通過研究低溫浸漬對梅樂葡萄酒酚類和揮發性化合物含量的影響。結果表明，低溫浸漬顯著提高了酒中酚類化合物的含量，尤其是有助于葡萄酒顏色穩定的錦葵色素3-葡糖苷的含量增加，同時也增加了揮發性化合物的濃度，特別是酯類以及α-松油醇、香葉醇和2-苯基乙醇，使得具有梅樂典型風味的酯類含量增加超過20%[5]。通過采用傳統釀造、低溫浸漬以及浸漬發酵對櫻桃酒的化學成分、揮發性、生物胺和感官特征的香氣物質分析表明，低溫浸漬促進了許多芳香族化合物的生產，包括酯類（己酸乙酯、丁酸乙酯）、醛類（苯甲醛）和萜烯（芳樟醇和β-大馬酮），并增強了櫻桃酒的果香，且低溫浸漬在釀造櫻桃酒中具有更大潛力[6]。但也有研究發現，低溫浸漬會增加因酚類物質而帶來的苦澀味和C6化合物引起的“生青味”，進而影響葡萄酒的口感與香氣質量[7]。

‘關口葡萄’原產于湖北恩施建始縣，該品種不僅果穗碩大、緊湊，且成熟后的整穗顆粒晶瑩剔透，品種香氣濃郁，因產于關口鄉而得名。研究發現[8]，‘關口葡萄’屬歐美雜交種，且果實中有含有較大的肉囊。隨著栽培面積的擴大，僅靠鮮食已不能滿足生產的需求，果酒釀造是可持續發展的首要選擇。前期本課題組對‘關口葡萄’干白葡萄酒的不同加工工藝、多酚氧化酶特性比較及其研究進展進行了系統的研究，解決了釀造過程中出現的易氧化、難取汁等一系列加工難題[9-10]，很好地釀造出了符合該品種特色的干白葡萄酒，發揮其濃郁香氣的優勢，但在生產過程中存在風味物質表現不佳，如苦味強度較高等現象。為此本實驗以清汁發酵工藝為對照（CK），采用發酵前低溫浸漬技術進行‘關口葡萄’干白葡萄酒的生產，通過測定其基本理化指標、酚類物質、氨基酸類以及香氣等風味物質含量以及感官評價，并分析‘關口葡萄’干白葡萄酒苦味強度與苦味化學組分含量之間的關系。旨在探究低溫浸漬時間對‘關口葡萄’干白葡萄酒風味物質的影響，探尋其苦味物質的種類、含量，明確苦味的主要貢獻物質，找出‘關口葡萄’干白葡萄酒適宜的釀造工藝，以期為合理開發和利用‘關口葡萄’資源提供重要的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

‘關口葡萄’（16 °Brix，pH 3.70，可滴定酸質量濃度7.30 g/L），采自湖北恩施建始縣花坪鎮關口鄉。果膠酶（500 U/mg） 日本ROHAVIN Clear公司；乙腈（色譜純） 美國Fisher公司；標準品水楊酸、香草酸、阿魏酸 美國Fluka公司；綠原酸、香豆素、香豆酸、咖啡酸、兒茶素、沒食子酸、表兒茶素、丁香酸、香氣標準品 美國Sigma公司。

1.2 儀器與設備

UV-2450紫外分光光度計、6890GC-5975MS氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；UPLC-Class超高壓液相色譜儀 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 葡萄酒釀造

根據小容器釀造法[11]進行釀造，將篩選后的葡萄進行除梗破碎，裝入玻璃發酵罐中，并添加60 mg/L（6% H2SO3）的SO2和30 mg/L的果膠酶。CK組直接壓榨取汁，將自流汁與壓榨汁混合后加入1 g/L的皂土，放置4 ℃下澄清24 h，分離后接種酵母200 mg/L，啟動發酵，溫度控制在（15f2）℃，發酵結束后調節游離SO2至30 mg/L左右，裝瓶并貯存于冷庫。

低溫浸漬處理，將除梗破碎后的葡萄果實放入玻璃發酵罐后，于4 ℃分別放置12、24 h和48 h，后續發酵工藝與CK組一致。每組處理重復2 次。

1.3.2 酒樣常規理化指標的測定

參照GB 15038ü2006《葡萄酒、果酒通用分析方法》及《葡萄酒分析檢驗》[12]方法分析測定葡萄酒中pH值、殘糖、揮發酸（以乙酸計）、SO2以及乙醇體積分數等基本理化指標。所有指標均重復測定3 次，下同。

1.3.3 酚類物質測定

葡萄酒中總酚含量采用福林-肖卡[13]法測定，略有改動；總類黃酮含量采用蘇鵬飛[14]的氯化鋁比色法測定；總黃烷醇含量采用p-DMACA-鹽酸法[15]測定；單體酚采用張星星等[16]的方法測定。

1.3.4 游離氨基酸含量的測定

參照芮鴻飛等[17]的方法，采用島津氨基酸柱前衍生方法包測定。

1.3.5 香氣成分分析

采用頂空固相微萃取結合氣相色譜-質譜的方法[18]進行香氣成分測定。

頂空固相微萃取操作步驟：1.00 g NaCl、5 mL葡萄酒樣品或標準品溶液于15 mL樣品瓶中，加入磁力攪拌子、4-甲基-2-戊醇溶液后，加熱攪拌30 min，然后將已活化萃取頭插入樣品瓶的頂空部分，40 ℃吸附30 min，立即在氣相色譜進樣口250 ℃條件下解吸8 min。每個樣品重復萃取2 次。

氣相色譜條件：載氣為高純度氦氣（99.999%），流速1.0 mL/min；進樣口溫度250 ℃；不分流；升溫程序：50 ℃保持1 min，以3 ℃/min升至220 ℃，保持5 min。

質譜條件：電子電離源；離子源溫度230 ℃；電離能量70 eV；四極桿溫度150 ℃；質譜接口溫度280 ℃；質量掃描范圍30～350 u。

定性定量方法：采用與香氣標準品的物質保留時間和質譜信息對比、文獻報道中相似色譜條件下該化合保留指數以及NIST 05標準譜庫NIST Chemis比對結果進行半定性分析，采用內標-標準曲線法定量，具體方法參照劉迪等[19]方法。

1.3.6 感官分析

感官品嘗小組成員由15 名接受過專業感官培訓的學生組成。評價小組分別從外觀（15 分，其中顏色10 分、澄清度5 分）、香氣（30 分，其中純正度6 分、濃郁度8分、質量16 分）、口感（44 分，其中純正度6 分、濃度8分、持久性8 分、質量22 分）以及整體平衡性（11 分）4 個方面對葡萄酒進行比較品嘗，總分為100 分[9]。

1.3.7 苦味量化與培訓

參照Gawel等[20]的方法。首先對感官品嘗小組進行0.1 g/L硫酸奎寧溶液訓練識別苦味[21]。利用線性標記法，對質量濃度梯度為0、3、6、9、12、15 mg/L的硫酸奎寧標準溶液進行反復線性定位，確定苦味強度在直線上大致的位置。對酒樣進行苦味定量分析時，以標準溶液為參照，確定其苦味強度。

1.4 數據處理

采用SPSS 20.0統計軟件，運用相關性分析和單因素方差分析對所測的數據進行分析，從中得出低溫浸漬對‘關口葡萄’干白葡萄酒品質的影響。采用主成分分析（principal component analysis，PCA）進行不同處理試樣酒中香氣成分與感官總分影響的研究，分析其中香氣物質氣味活性值（odor active value，OAV），按下式計算。使用Unscrambler 10.1（CAMO，Oslo，Norway）進行偏最小二乘回歸分析，評估苦味物質對苦味強的貢獻，所有數據處理前需進行標準化處理。為了減少偏最小二乘回歸時因多變量帶來的誤差，僅選取與苦味強度呈顯著相關（P＜0.05）的物質進行偏最小二乘回歸分析。最終根據Jack-knife不確定度的分析計算得到估計回歸系數，以此考察酒中苦味強度呈顯著相關的苦味物質。

2 結果與分析

2.1 葡萄酒常規理化指標分析

表1 浸漬時間對‘關口葡萄’干白葡萄酒理化指標的影響Table 1 Physicochemical properties of wines with different PCM times

如表1所示，與CK相比，低溫浸漬會使葡萄酒可滴定酸含量顯著降低，這與相關研究一致[22]；通過測定酒樣中的揮發酸含量，可以了解葡萄是否生病及病害的嚴重程度，不同處理間差異較小，說明低溫浸漬處理與CK相同，均能使乙醇的發酵過程正常進行；通過對比不同處理SO2含量發現，低溫浸漬使SO2顯著升高，表明低溫浸漬處理可能會抑制微生物活動或者降低多酚氧化酶的活性，從而抑制酚類物質的氧化，減少SO2的消耗量。值得注意的是，隨著浸漬時間的延長，pH值逐漸升高，主要是由于在浸漬過程中緩沖離子的釋放所引起的。

2.2 葡萄酒酚類物質分析

圖1 ‘關口葡萄’干白葡萄酒中酚類物質（A）和苦味單體酚（B）含量Fig. 1 Contents of polyphenols (A) and bitter monophenols (B) in wines

酚類化合物是衡量葡萄酒質量的重要參數，酚類物質作為一大類復雜的具有抗氧化性的物質，主要參與形成葡萄酒的味道、骨架、結構和顏色等。研究發現[23]，在白葡萄酒中，酚類物質的濃度遠超過其感官閾值，能夠增加酒體的豐滿度與其抗氧化活性，但過量的酚類物質也會破壞其整體的平衡性。Hernanz等[24]研究發現酚類物質還可以改變白葡萄酒的揮發性成分，進而影響葡萄酒的質量。由圖1A可知，與傳統發酵相比，低溫浸漬工藝使酒樣中酚類物質的溶解受到一定限制，但隨著浸漬時間延長，酚類物質含量隨之增加，進而提高葡萄酒本身顏色的穩定性。這種現象是由于在果皮浸漬、乙醇發酵的過程中，位于果皮、果籽中的酚類物質通過浸提的作用轉移到葡萄酒中。

在葡萄酒中共檢測出12 種主要單體酚，其中類黃酮包括1 種黃烷醇類與3 種黃酮醇類，黃烷醇類中僅檢測到兒茶素一種物質，3 種黃酮醇分別為槲皮素、蘆丁、山柰酚，非類黃酮包括3 種羥基苯甲酸和5 種羥基肉桂酸，羥基苯甲酸為沒食子酸、香草酸、咖啡酸、丁香酸、香豆酸，羥基肉桂酸為阿魏酸、綠原酸以及香豆素。由圖1B可知，低溫浸漬技術使兒茶素含量增加，且隨著浸漬時間的延長，兒茶素含量顯著增加；在黃酮醇類中僅槲皮素物質的質量濃度有一定程度的增加，其余2 種差異不顯著（P＞0.05）；非類黃酮中，沒食子酸、咖啡酸、丁香酸含量受低溫浸漬影響顯著（P＜0.05）。總體說明，低溫浸漬技術能夠一定程度增加‘關口葡萄’干白葡萄酒中單體酚類物質含量，且隨著浸漬時間的延長，單體酚類，特別是兒茶素、沒食子酸、咖啡酸以及丁香酸含量顯著增加（P＜0.05）。

2.3 葡萄酒氨基酸含量分析

圖2 ‘關口葡萄’干白葡萄酒中氨基酸含量Fig. 2 Amino acid contents in wines

氨基酸具有甜、酸、苦、鮮4 種不同的味感，游離氨基酸的含量及種類對葡萄酒口感有較大的影響[25-26]。由圖2可知，‘關口葡萄’干白葡萄酒中共檢測出7 種苦味氨基酸（組氨酸、精氨酸、酪氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、賴氨酸、亮氨酸）、2 種酸味氨基酸（天冬氨酸、谷氨酸）以及4 種甜味氨基酸（甘氨酸、蘇氨酸、丙氨酸、脯氨酸）[27]。與CK相比，低溫浸漬會顯著增加‘關口葡萄’干白葡萄酒中苦味氨基酸含量，減少甜味氨基酸的含量，而酸味氨基酸含量總量無顯著差異，從而會一定程度的增加‘關口葡萄’干白葡萄酒的苦味強度；且隨著浸漬時間的延長趨勢更加明顯。

2.4 葡萄酒香氣物質分析

圖3 ‘關口葡萄’干白葡萄酒中香氣物質含量Fig. 3 Contents of aroma compounds in wines

表2 ‘關口葡萄’干白葡萄酒中香氣成分Table 2 Quantitative analysis of aroma compounds in wines

續表2

‘關口葡萄’干白葡萄酒共檢測到51 種香氣成分，主要香氣成分是酯類、高級醇類、脂肪酸類以及萜類、羰基化合物類等微量化合物。與傳統釀造相比，低溫浸漬技術會使‘關口葡萄’干白葡萄酒香氣物質總含量降低，且隨著浸漬時間的延長，香氣含量顯著降低（P＜0.05），研究結果與Alexicandre等[28]相同。所釀‘關口葡萄’干白葡萄酒中均有16 種香氣成分OAV大于1，但部分香氣成分OAV差異顯著。

醇類物質通常賦予葡萄酒強烈的化學氣味，辛辣味以及草本氣味，但隨著其在葡萄酒中組成和含量的不同，葡萄酒可能具有怡人的果香、花香以及蜂蜜氣味等。相關研究發現，對葡萄酒香氣有貢獻的高級醇為丁醇、異丁醇、己醇、戊醇、苯甲醇、苯乙醇與乙烯醇[29]。

由圖3、表2可知，由低溫浸漬工藝釀造的葡萄酒高級醇總量顯著高于CK，高級醇總量在浸漬W1酒樣中最高，其次為W2、W3。在高級醇中，正己醇與苯乙醇OAV均大于1，對‘關口葡萄’干白葡萄酒香氣貢獻較大，由表2可知，低溫浸漬會降低對葡萄酒香氣有貢獻的正己醇與苯乙醇含量。Rapp等[30]指出高級醇質量濃度低于400 mg/L會促進葡萄酒香氣和口感，在本實驗中不同浸漬時間的葡萄酒中高級醇質量濃度均低于400 mg/L，其中對葡萄酒香氣有顯著貢獻的苯乙醇主要表現為花香、蜂蜜等；正己醇對葡萄酒香氣產生青香等負面影響，低溫浸漬顯著降低正己醇含量，有利于葡萄酒香氣的表現。

酯類是葡萄酒中重要的香氣成分，一般賦予葡萄酒果香與花香。低溫浸漬工藝會顯著影響葡萄酒中酯類物質的總量，在‘關口葡萄’干白葡萄酒中，共有7 種酯類化合物對葡萄酒香氣有貢獻，分別為丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯。其中低溫浸漬會增加OAV較高的己酸乙酯和癸酸乙酯的含量，且隨著浸漬時間的延長呈上升趨勢；丁酸乙酯、乙酸異戊酯、9-癸烯酸乙酯、乙酸苯乙酯總量顯著減少，且隨著浸漬時間的延長呈降低趨勢；而辛酸乙酯的含量，W1顯著的高于CK，W2、W3顯著低于CK。

葡萄酒中一些脂肪酸和有機酸通常是有酵母菌與乳酸菌在乙醇發酵與蘋果酸-乳酸發酵過程中產生的。與CK相比，經低溫浸漬處理的葡萄酒中酸類物質的含量顯著降低。在脂肪酸類物質中，除乙酸外，其余物質OAV均大于1，對葡萄酒香氣貢獻較大。在脂肪酸類物質中通常會給葡萄酒本身帶來一定的腐臭或類似黃油、油脂等負面香氣，低溫浸漬技術減少了干白葡萄酒中脂肪酸類物質的含量，進而減少葡萄酒因脂肪酸帶來的不良風味。

葡萄酒中大約存在50多種萜烯類物質，他們廣泛存在于葡萄果皮與葡萄果肉細胞中，尤其是麝香葡萄品種，一般賦予葡萄酒以花香和果香等感官特征。如表2所示，‘關口葡萄’干白葡萄酒中共檢測到6 種萜烯類物質，包括β-月桂烯、芳樟醇、α-松油醇、脫氫芳樟醇、香茅醇、β-大馬酮。與CK相比，低溫浸漬技術使葡萄酒中的萜烯類物質的含量顯著升高（P＜0.05），且隨著浸漬時間的延長，萜烯類物質總量呈升高趨勢。

此外，還檢測到壬醛、癸醛、苯乙酮以及苯乙烯4 種香氣化合物。其中壬醛、癸醛屬于低級脂肪醛類化合物，在高度稀釋下具有良好的香氣。表2顯示，W1中壬醛的含量顯著高于CK，且隨浸漬時間的延長逐漸減少，但與CK差異不顯著；癸醛在W2中含量最高，但與CK無顯著性差異，且2 種物質的OAV均大于1。苯乙酮為脂肪酮類化合物，在CK中苯乙酮含量最低，低溫浸漬使其含量顯著增加，并隨著浸漬時間的延長顯著上升。苯乙烯為芳香烴類香氣物質，其含量在CK組最高，低溫浸漬會使其含量顯著降低，時間越長降低越多。這些化合物也會隨其在葡萄酒中含量的不同而對葡萄酒香氣產生積極或者負面的影響。

2.5 葡萄酒感官品質分析

圖4 ‘關口葡萄’干白葡萄酒感官分析圖Fig. 4 Analysis of sensory quality of wines

從圖4可以看出，與CK相比低溫浸漬可以增加葡萄酒的澄清度、顏色、口感純正度、口感濃度、口感持久性、口感質量、整體平衡性、整體評分以及苦味強度，但香氣的純正度、濃度以及質量降低。其中W2葡萄酒的澄清度、顏口感持久性、口感純正度以及整體評分最高，W3的口感濃度和整體平衡性最高但整體評分有所下降，因此適當的低溫浸漬技術可提高干白葡萄酒的整體品質質量。值得注意得是，在‘關口葡萄’干白葡萄酒中，隨著低溫浸漬時間的延長顯著增加了本身的苦味強度。

圖5 前2 個主成分上的香氣、口感質量與酒樣分布Fig. 5 Loading plot of PC1 versus PC2 for sensory quality of wine samples

由圖5可知，與CK相比，W1整體評分差異較小，W2整體評分較高，W3酒樣中焦糖、青蘋果、苦杏仁、甘草、黑咖啡的氣味增加，進而影響酒樣的整體感官質量。低溫浸漬會使干白葡萄酒的香氣質量由果香等品種香氣轉化為蜂蜜、青蘋果等特征香氣，但隨著浸漬時間的延長也會使甘草以及苦杏仁味增加，從而影響干白葡萄酒品質。

2.6 葡萄酒苦味相關物質分析

葡萄酒中的苦味主要源于加工過程中的葡萄皮、葡萄籽以及葡萄梗，較低的苦澀味可以增加葡萄酒酒體的復雜性，但是過重的苦澀味會嚴重影響葡萄酒自身的質量。由圖6可知，與CK相比，低溫浸漬W2、W3的苦味強度顯著高于CK，但是W1的酒樣苦味強度有所增高但與CK差異不顯著。

圖6 浸漬時間對‘關口葡萄’干白葡萄酒的苦味強度的影響Fig. 6 Effect of PCM time on bitter intensity of wine

圖7 ‘關口葡萄’干白葡萄酒的偏最小二乘回歸分析圖Fig. 7 Partial least squares regression analysis of bitterness intensity of wine

如圖7a所示，均方根預測誤差為0.133，R2為0.976，模型較好。該模型中，除山柰酚外，所有自變量均與苦味強度呈正相關，這些化學組分對苦味的貢獻度如圖7b所示。在酚類物質中，對‘關口葡萄’干白葡萄酒苦味強度影響較大的為總類黃酮物質，此結果在其他食品中也有發現[44]。相關研究表明[45-46]，總酚對白葡萄酒的苦味影響較小或者無關，與本實驗研究一致。值得注意得是，本實驗中黃烷醇與苦味強度貢獻度較小，此結果與Soares等[47]研究一致，與Narukawa等[48]相反。黃烷醇與苦味強度貢獻度較小，這可能是由于在酒樣釀造過程中，為提高出汁率而進行的果皮浸漬以及果膠酶的添加，使得糖、酸對黃烷醇的掩蔽作用引起的。在單體酚類物質中，兒茶素、槲皮素、咖啡酸、丁香酸、香豆酸以及阿魏酸均對酒樣苦味強度影響較大；在苦味氨基酸中，僅有組氨酸和精氨酸對酒樣苦味影響較大，主要是由于苦味氨基酸閾值較大，使得苦味氨基酸對苦味強度的貢獻較小。

3 結 論

本研究以湖北恩施‘關口葡萄’為原料，發酵前4 ℃分別浸漬12、24 h和48 h。通過低溫浸漬工藝對‘關口葡萄’干白葡萄酒釀酒特性研究發現，與傳統工藝相比，經低溫浸漬處理釀造的‘關口葡萄’干白葡萄酒中酚類物質、氨基酸總量均增加，香氣物質總量減少，但使具有品種香氣的萜烯類化合物含量顯著增加。其中，低溫浸漬導致其香氣總量降低的根本原因有待進一步研究。

PCA和感官評定結果表明，低溫浸漬能夠改善‘關口葡萄’干白葡萄酒的品質。其中低溫浸漬12 h時酒樣感官評分與CK差異較小，低溫浸漬24 h所釀酒樣的感官評分最高，低溫浸漬48 h酒樣因苦杏仁、甘草、黑咖啡等香氣的增加使感官評分有所下降。

值得注意得是，低溫浸漬工藝對酒樣的苦味影響較大，特別是隨著浸漬時間的延長，苦味強度明顯增加。偏最小二乘回歸分析發現：對苦味影響較大的物質有類黃酮、單體酚（山柰酚除外）、組氨酸以及精氨酸。因此應進一步確定此苦味物質在‘關口葡萄’中的主要分布部位，為釀造過程中合理控制苦味強度，促進‘關口葡萄’深加工提供部分理論基礎。