超高效液相色譜-串聯質譜法同時測定水果中10 種保鮮劑殘留量

曹雪琴，楊 飛，陳國通，毛瓊玲，李 芳，楊 中,*

（1.新疆維吾爾自治區分析測試研究院，新疆 烏魯木齊 830011；2.中國科學院新疆理化技術研究所，新疆 烏魯木齊 830011）

果蔬是需求量僅次于糧食的農產品，水果采摘后由于含水量高，不易貯存運輸，腐敗變質后，不僅營養價值喪失，還會引起食物中毒、資源損失以及環境污染等問題[1]。果蔬保鮮是其貯存、運輸、流通過程中必需解決的問題。為保證果蔬的貯藏品質，延長貯藏期限，常在貯運前對果蔬進行保鮮處理，目前常用的保鮮方法有物理保鮮和化學保鮮，物理保鮮包括低溫、輻射、臭氧、減壓及熱處理方式等[2]。與其他保鮮方式相比，化學保鮮劑有設備簡單、投資小、成本低、節能降耗等優點，因此在農業生產和農產品貯藏中使用較為廣泛。但化學保鮮劑大多有毒性和殘留，對人體健康產生不利影響[3]，其使用量與殘留量需要保持在一定范圍內才能保證食品安全。

苯并咪唑類是高效、廣譜的內吸性殺菌劑，對植物病害具有很強的抗菌活性，可用于植物真菌等病蟲害的防治[4-5]。常用的苯并咪唑類殺菌劑有苯菌靈、甲基硫菌靈、噻菌靈和多菌靈，基于這些殺菌劑的危害性，美國、日本等國家現已嚴格控制食品中該類物質的殘留量，我國也已將食品中苯并咪唑類殺菌劑的殘留量列為重要監測項目。抑霉唑、嘧霉胺是常用的廣譜高效殺菌劑，具有強效的抑霉作用，被廣泛用于采收后的各種水果和蔬菜，以防止果蔬在運輸和貯存過程中腐爛變質，起到防腐保鮮的作用。它們對果蔬中常見的青霉病、綠霉病等有很好的防治作用。

目前針對水果中防腐保鮮劑的檢測方法主要有高效液相色譜法[6-11]、氣相色譜法[12-14]、氣相色譜-質譜聯用法[15-18]和液相色譜-質譜聯用法[19-29]，研究基質主要為水果和蔬菜。其中抑霉唑[12-14,17-18]、百菌清[30-31]、異菌脲[30-31]等化合物大多采用氣相色譜法或氣相色譜-質譜聯用法檢測，鮮見采用液相色譜-串聯質譜法同時測定腐霉利、抑霉唑、百菌清、異菌脲。

本實驗利用超高效液相色譜-串聯質譜（ultrahigh performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析技術，對水果中咪鮮胺、多菌靈、甲基硫菌靈、噻菌靈、異菌脲、抑霉唑、苯菌靈、腐霉利、百菌清、嘧霉胺10 種保鮮劑殘留量檢測方法進行研究，采用QuEChERS方法萃取凈化，樣品前處理方法操作簡單，能夠滿足水果中10 種保鮮劑殘留同時定量分析的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

水果樣品（葡萄、蘋果、紅棗）購于市場。

10 種植物保鮮劑標準品：咪鮮胺、多菌靈、甲基硫菌靈、噻菌靈、異菌脲、抑霉唑、苯菌靈、腐霉利、百菌清、嘧霉胺（純度均≥98%） 德國Dr. Ehrenstorfer Gmbh公司；乙腈（色譜純） 德國Merck公司；甲酸（色譜純） 美國Tedia公司；無水硫酸鎂、氯化鈉（均為分析純） 天津市大茂化學試劑廠；C18填料（40 μm）、N-丙基乙二胺吸附劑（primary secondary amine，PSA，40 μm） 上海安譜實驗科技股份有限公司；實驗用水Milli-Q系統純化水。

1.2 儀器與設備

Xevo TQ-MS UPLC-MS/MS儀（配有電噴霧離子源）美國Waters公司；Milli-Q超純水器 美國Millipore公司；3K15高速離心機 德國Sigma公司；MS3 basic渦旋混合器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 標準儲備液和工作溶液的配制

分別精密稱取10 種化合物各10.0 mg，用甲醇溶解并定容至50.00 mL。此標準溶液質量濃度為0.20 mg/mL，貯存于棕色玻璃瓶中，-20 ℃下避光保存。作為標準儲備液。

精密吸取10 種標準儲備液適量，配制混合標準工作液，用甲醇稀釋并定容。其中咪鮮胺、多菌靈、噻菌靈、異菌脲、抑霉唑、嘧霉胺質量濃度為0.5 μg/mL，腐霉利、甲基硫菌靈、苯菌靈和百菌清質量濃度為5.0 μg/mL。-20 ℃下避光保存。

分別用相應的水果（葡萄、蘋果、紅棗）空白基質將標準工作溶稀釋，配制成適當質量濃度的混合標準品標準曲線，現配現用。

1.3.2 色譜條件

Waters Acquity UPLC BEHC18色譜柱（100 mmh2.1 mm，1.7 μm）；流速0.3 mL/min；柱溫30 ℃；進樣量3.0 μL；流動相A為乙腈；流動相B為0.1%甲酸溶液；洗脫程序：0～4.0 min，30%～90% A；4.0～6.0 min，90% A；6.0～10.0 min，30% A。

1.3.3 質譜條件

電噴霧離子源，正離子模式；掃描方式為多反應監測；毛細管電壓3.0 kV；離子源溫度150 ℃；脫溶劑氣（N2）溫度500 ℃；脫溶劑氣流量1 000 L/h；錐孔氣流量50 L/h；碰撞氣（Ar）流速2.5 L/h。在正離子監測模式下，對質譜參數進行優化，見表1。

表1 10 種化合物質譜參數Table 1 UPLC-MS/MS parameters of 10 analyte compounds

1.3.4 樣品前處理

取新鮮水果樣品，用粉碎機粉碎混勻，密封冷凍（-20 ℃）保存。

稱取試樣10 g（精確至0.1 g）于50 mL塑料離心管中，加入10 mL含1%乙酸-乙腈溶液，勻漿2 min后，加入4 g無水硫酸鎂和1 g醋酸鈉，劇烈振搖1 min，于4 ℃、10 000 r/min離心4 min，取上清液5 mL于預先加有75 mg C18、400 mg PSA及1.0 g無水硫酸鎂的離心管，渦旋振蕩1 min，靜置10 min，于10 000 r/min離心5 min，準確吸取1.0 mL上清液于10 mL試管中，40 ℃水浴中氮氣吹至近干，加入1 mL初始流動相復溶，經0.22 μm有機濾膜過濾后，用于測定。

試樣液經UPLC-MS/MS分析，根據保留時間定性，外標峰面積法定量。

1.4 數據處理

圖譜采集采用MassLynx 4.0，數據處理采用TargetLynx，均為美國Waters公司軟件。所有實驗數據以平均值表示，采用Excel 2016軟件進行統計分析和繪圖。

2 結果與分析

2.1 質譜條件的優化

在一級質譜全掃描模式下，同時采集正負離子信號，結果發現目標物在正離子模式下的響應值較好。在正離子監測模式下，分別對毛細管電壓、錐孔電壓、碰撞能量和選擇離子等質譜參數進行優化，選取碰撞后所得豐度較高的2 個子離子作為特征離子。然后在子離子掃描模式下，選擇離子響應最高的子離子作為定量離子，響應次高的子離子作為定性離子，最后在多反應監測模式下，對目標物的碰撞能量進行優化（表1）。其中腐霉利的特征母離子有2 個，分別為[M+H]+（m/z284）及其同位素峰[M+H+2]+（m/z286），且同位素峰的響應較高，因此選擇m/z286為定量母離子，m/z284為定性母離子，其產生的子離子均可能為[M-CO]+，腐霉利多反應監測色譜圖見圖1。

圖1 腐霉利多反應監測色譜圖Fig. 1 MRM chromatograms of procymidone

2.2 色譜條件的優化

圖2 10 種化合物多反應監測色譜圖Fig. 2 MRM chromatograms of 10 preservatives

考察甲醇-水、乙腈-水2 種常見流動相體系對目標化合物的影響，結果發現，所有目標化合物在乙腈-水體系中的峰形較好。在流動相中分別添加少量甲酸，能提高目標化合物的離子化效率，并能得到較好的峰形。本實驗選用乙腈-0.1%甲酸溶液作為流動相。10 種化合物多反應監測色譜圖見圖2。

2.3 樣品預處理條件的優化

圖3 提取溶劑的回收率Fig. 3 Comparative recoveries of analytes using different extraction methods

以回收率為指標，比較乙腈和1%乙酸-乙腈溶液2 種溶劑的提取效果，如圖3所示。以1%乙酸-乙腈溶液為提取溶劑時，回收率普遍高于以乙腈為提取溶劑時的回收率。因此，最終選擇1%乙酸-乙腈溶液為提取溶劑。

QuEChERS前處理方法主要應用在果蔬等含水量較多的樣品基質中，方法中的凈化劑主要有C18、PSA和石墨化碳黑吸附劑（graphitized carbon black，GCB）。C18和PSA的實際應用范圍廣，對農藥的回收率影響小[32-33]。GCB主要去除色素等物質。本研究中所要測試的樣品為水果，色素含量較低，因此選擇C18和PSA 2 種凈化劑，并考察吸附劑對回收率的影響。同時提取后采用較高轉速低溫離心，上清液比較澄清，能夠達到更好的凈化效果。按照1.3.4節方法處理對葡萄、蘋果、香梨加標樣品進行凈化，結果表明，經C18和PSA吸附劑凈化后，10 種化合物的回收率為70%以上。

圖4 溶劑對多菌靈和噻菌靈峰形的影響Fig. 4 Effect of solvents on the chromatographic peak shape of thiabendazole and carbendazim

實驗還發現多菌靈和噻菌靈對溶解樣品的溶劑比較敏感，當樣品經預處理后直接進樣分析時，2 個化合物的峰形變寬，會出現雙峰，將樣品用初始流動相溶解時，峰形明顯變好，見圖4。因此，樣品經凈化后，需經氮氣吹干后用初始流動相溶解。

2.4 線性范圍、檢出限和定量限結果

為減小基質效應對定量結果的影響，10 種保鮮劑采用基質匹配-外標法定量分析。分別吸取混合標準工作溶液適量，用空白樣品提取液配制標準系列溶液，進樣前分析時經氮氣吹干后用初始流動相溶解。咪鮮胺、異菌脲、抑霉唑、噻菌靈、嘧霉胺和多菌靈質量濃度分別為0.5、1.0、5.0、5.0、10、50 ng/mL；甲基硫菌靈、苯菌靈、腐霉利和百菌清質量濃度分別為5.0、10、50、100、500 ng/mL；經UPLC-MS/MS分析，采用外標法建立標準曲線。以質量濃度為橫坐標（x，ng/mL），定量離子對峰面積為縱坐標（y），進行線性回歸計算，所得相關系數均大于0.99，線性良好，以3 倍信噪比估算檢出限，以10 倍信噪比對應質量濃度作為定量限，結果見表2。

表2 10 種保鮮劑的線性方程、相關系數、檢出限、定量限Table 2 Regression equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of 10 preservatives

2.5 回收率與精密度結果

對葡萄、蘋果、紅棗3 種樣品進行添加回收和精密度實驗。進行低、中、高3 個添加水平的回收實驗，加標量分別為10、20 μg/kg和30 μg/kg，結果見表3。

表3 10 種保鮮劑的回收率和相對標準偏差（n=6）Table 3 Spiked recoveries and RSDs of 10 preservatives in three real samples (n= 6)

2.6 實際樣品檢測結果

采用優化建立UPLC-MS/MS快速分析方法對市售葡萄、蘋果、紅棗等50 份樣品進行測試。結果顯示，咪鮮胺檢出樣品1 個，為紅棗，檢出值為7.2 μg/kg；甲基硫菌靈檢出樣品1 個，為紅棗，檢出值為4.4 μg/kg；百菌清檢出樣品1 個，為紅棗，檢出值為113 μg/kg；嘧霉胺檢出樣品1 個，為葡萄，檢出值為16.2 μg/kg；多菌靈檢出樣品2 個，均為葡萄，檢出值為1.77 μg/kg和1.10 μg/kg；每個品種抽出1 份樣品加入添加量為10 μg/kg的標準溶液以測定加標回收率考察方法的可靠性和穩定性，10 種化合物的平均回收率為75.0%～112%，相對標準偏差為3.0%～9.5%，完全滿足分析要求。

3 結 論

本實驗建立了UPLC-MS/MS法測定水果中10 種植物保鮮劑殘留量的檢測方法。結果表明：該方法操作簡單，結果準確、重復性好，該方法可同時測定10 種保鮮劑殘留量，且具有操作簡單、回收率高、精密度好、靈敏度好等特點，滿足果蔬中農藥殘留量的分析要求，可為政府行政監督提供檢測技術支持。應用于日常檢測中可降低檢測成本，縮短檢測周期，具有實際應用價值。