轉TaPK-R1基因小麥的農藝性狀評價

周淼平， 張增艷， 姚金保， 王化敦， 楊學明， 張 鵬， 余桂紅， 馬鴻翔

(1.江蘇省農業科學院糧食作物研究所，江蘇南京 210014； 2.中國農業科學院作物科學研究所，北京 10081)

小麥紋枯病是一類重要的世界性小麥病害，主要由禾谷絲核菌等侵染小麥莖稈基部引起，造成病苗死苗、花稈爛莖，嚴重時產生枯白穗，導致減產，該病害在我國長江中下游麥區和黃淮麥區頻繁發生，每年造成數億元的經濟損失[1]，培育和應用抗紋枯病小麥品種無疑是防治該病害最經濟有效的途徑。常規抗病品種的培育需要有抗性穩定的抗源用于配制雜交組合，近30年來，我國研究人員對3 000余份小麥種質材料進行了紋枯病抗性鑒定，但未篩選到免疫和高抗材料[2]。研究發現，小麥對紋枯病的抗性是一數量性狀，目前已對部分抗源的抗病數量性狀座位(quantitative trait locus，QTL)進行分子定位，但這些QTL對紋枯病抗性的解釋率低，要明顯提高小麥的紋枯病抗性須累積多個抗性QTL，因而對小麥抗紋枯病的分子標記輔助聚合育種帶來諸多困難[3]。

植物基因工程技術為提高小麥的紋枯病抗性提供了新的途徑，通過引入外源抗病基因或提高內源抗病基因的表達等方法可以增強小麥對紋枯病菌的抵御能力。目前，采用該方法已經獲得一批抗紋枯病的種質材料，進一步拓寬了小麥紋枯病抗源的范圍。中國農業科學院作物科學研究所張增艷實驗室采用基因芯片分析技術發現了參與小麥抵御紋枯病菌侵染的重要基因TaAGC1(TaPK-R1)，該基因屬于AGC蛋白激酶，將該基因連接組成型啟動子并導入大面積推廣品種揚麥20中，發現轉基因T2代植株的紋枯病抗性較受體對照揚麥20有顯著提高[4-5]。但該基因的組成型表達對小麥其他農藝性狀如生育期、產量以及籽粒性狀等有無影響尚不清楚。本研究對篩選獲得的4個穩定的T7代轉基因株系在大田環境下與受體對照揚麥20的農藝性狀進行比較，評價TaPK-R1基因的組成型表達對轉基因株系生長發育的影響。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 轉TaPK-R1基因株系PK372、PK394、PK465和PK495由中國農業科學院作物科學研究所張增艷研究員提供；受體對照揚麥20由江蘇省農業科學院糧食作物研究所麥類作物研究室提供。

1.1.2 試劑與儀器 Karroten植物基因組DNA提取試劑盒，購自南京翼飛雪生物科技有限公司；目的基因PCR檢測試劑、RNA提取試劑盒、反轉錄試劑盒以及熒光定量分析試劑盒，購自寶生物工程(大連)有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。試驗所用TP350PCR儀以及TP960熒光定量PCR儀，購自寶生物工程(大連)有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1TaPK-R1基因的檢測 在拔節期對4個轉基因株系和對照揚麥20各取5株葉片，分別混樣，冷凍干燥磨碎后參照植物基因組DNA提取試劑盒操作手冊提取DNA，導入的TaPK-R1基因采用嵌合引物進行擴增，正向引物序列 PK-3F為5′-CATCTAAGGCGGGTCCAT-3′，反向引物序列NOS-2R為5′-AACCCATCTCATAAATAACG-3′。PCR反應體系總體積為20 μL，含10×buffer 2 μL、25 mmol/L MgCl21.2 μL、2.5 mmol/L dNTPs 1.6 μL、10 μmol/L引物1.0 μL、50 ng模板DNA、1 UTagDNA聚合酶(TaKaRa)。PCR擴增條件為：94 ℃預變性5 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火40 s，72 ℃ 延伸45 s，35個循環；72 ℃延伸10 min。PCR產物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳分離。

1.2.2TaPK-R1基因的表達分析 在拔節期對4個轉基因株系和對照各取5株葉片，分別混樣，液氮冷凍磨碎，采用TaKaRa MiniBEST Universal RNA Extraction Kit提取RNA，用PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser試劑盒進行反轉錄，按照SYBR?Premix ExTaqⅡ(Tli RNaseH Plus)試劑盒推薦方法進行熒光定量PCR。Actin基因為內參基因，其特異引物對為TaActin-F(5′-C A C T G G A A T G G T C A A G G C T G-3′)和TaActin-R(5′-C T C C A T G T C A T C C C A G T T G-3′)；TaPK-R1基因特異引物對為TaPK-R1-Q-F(5′-T T T G G A G A G G T G C G T C T T T G T-3′)和TaPK-R1-Q-R(5′-A G G A G G T T T C T T T C G G C T T T G-3′)。熒光定量PCR在TaKaRa TP960熒光定量PCR儀上進行，PCR擴增條件為：95 ℃預變性30 s；95 ℃ 變性5 s，60 ℃ 退火30 s，40個循環。根據熒光定量PCR結果計算相對表達量。

1.2.3 轉基因株系的農藝性狀分析 供試材料于2017年11月28日在江蘇省農業科學院六合轉基因基地(118°38′47″E、32°28′26″N)播種，對照和每個轉基因株系按隨機小區種植，每個小區5行，行長 5 m，行距0.25 m，3次重復。播種后按正常小麥管理。

田間試驗主要對轉基因株系的生長發育和形態特征等主要農藝性狀進行觀察記載，包括播種期、出苗期、抽穗期、開花期和成熟期等生育期；基本苗、高峰苗、有效穗數、株高、產量等重要農藝性狀以及轉基因株系對白粉病、紋枯病和赤霉病等病害的抗性。成熟時，考察主穗穗長、小穗數、不孕小穗數以及每穗粒數的變化。收獲后，測量籽粒大小、千粒質量、籽粒蛋白含量和籽粒硬度等籽粒性狀。籽粒大小測量方法：每小區隨機取100粒籽粒，照相后采用SmartGrain軟件根據像素計算籽粒長度與寬度；籽粒蛋白含量采用Perten DA7200近紅外儀測定；籽粒硬度測量方法：每小區隨機取200粒籽粒，采用Perten SKCS4100單粒籽粒硬度測定儀測定，計算平均值。

1.3 數據處理

所有數據的方差分析和檢驗分析均采用Excel 2016軟件進行。

2 結果與分析

2.1 轉基因株系TaPK-R1基因的檢測結果

此次種植的轉基因株系已經是T7代，在拔節期取轉基因株系和對照葉片，提取DNA，采用嵌合引物對目的基因TaPK-R1進行PCR檢測，結果(圖1)表明轉基因株系均能擴增出886 bp的目的條帶，說明導入的TaPK-R1基因已經整合進小麥基因組并能穩定遺傳。

2.2 轉基因株系TaPK-R1基因的表達分析結果

在拔節期同時取轉基因株系和對照葉片，提取RNA并反轉錄成cDNA，再采用熒光定量PCR檢測TaPK-R1基因的表達，以受體對照揚麥20為基準，計算相對表達量，結果(圖2)表明轉基因株系PK372、PK394、PK465、PK495的TaPK-R1基因表達量分別是對照的9.0、8.9、9.2、5.9倍，說明導入的目的基因不僅可以正常表達，而且表達量較對照有較大提高。

2.3 轉基因株系農藝性狀評價

2.3.1 生長發育部分階段的物候期比較 由于播種時間較正常播種期有所推遲，從播種到出苗的時間延長，但轉基因株系與對照沒有差別，說明TaPK-R1基因的組成型表達沒有影響種子的萌發能力。抽穗后氣溫較高，生育期進程加快，轉基因株系與對照相似，全生育期有所縮短，兩者幾乎沒有區別(表1)。

表1 轉基因小麥生長發育各階段物候期的比較

2.3.2 苗情和產量的比較 與受體對照揚麥20相似，轉基因株系也屬春性小麥，幼苗半直立，株型松散。在基本苗基本一致的情況下，轉基因株系的高峰苗數和有效穗數與對照差異不顯著，說明TaPK-R1基因的組成型表達沒有對小麥的繁茂性和成穗率產生影響。4個轉基因株系的產量均較對照有所降低，但差異沒有達到顯著水平。由于播種推遲，生長期縮短，轉基因株系和對照的株高較往年有較大降低，轉基因株系與對照也未出現顯著差異(表2)。

表2 轉基因小麥部分重要農藝性狀調查結果

注：同列數據后不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著。表3、表4、表5同。

2.3.3 主穗性狀的比較 成熟時每個小區隨機取10株主穗，考察主穗農藝性狀，結果(表3)表明轉基因株系的主穗長度、小穗數、不孕小穗數和粒數與受體對照相比均無顯著差異。

2.3.4 籽粒性狀的比較 籽粒收獲曬干后，每小區隨機取100粒測定籽粒長度和寬度，結果顯示，轉基因株系籽粒的長寬雖有所變化，但與對照相比差異不顯著。采用近紅外測定籽粒蛋白含量發現，轉基因株系籽粒蛋白含量較對照有所提高，但未達到顯著差異水平。籽粒硬度測定結果與之相仿，轉基因株系籽粒硬度比對照稍高，但也沒有顯著差異，同屬于軟質麥。千粒質量的分析結果也表明，轉基因株系與對照差異不顯著(表4)。

對轉基因株系和對照的病害調查顯示，在整個生育期內小麥黃花葉病沒有發生，白粉病和銹病只有輕微發生，兩者差異不明顯。但后期紋枯病和赤霉病的危害情況有顯著差異，揚麥20平均紋枯病病情指數達到50.7%，而轉基因株系只有30.7%～36.7%；赤霉病方面，轉基因株系的病級要低于對照，普遍率也是同樣的趨勢(表5)，說明TaPK-R1基因的組成型表達不僅提高了小麥對紋枯病的抗性，對赤霉病的抗性也有所提高，可能TaPK-R1是激酶基因，該基因參與了小麥抗病的信號傳導，誘導了下游抗病基因的表達，從而提高了小麥對病害的基礎抗性。

3 討論與結論

序列和結構分析表明，TaPK-R1，屬于AGC蛋白激酶家族，該家族是植物蛋白激酶的一個亞家族，家族內的激酶均包含C端的絲氨酸/蘇氨酸特異性的催化結構域。在哺乳動物中，AGC蛋白激酶是細胞生長、新陳代謝和細胞死亡的重要調節因子，但在植物中AGC蛋白激酶的功能還不是十分清楚。在擬南芥中已經發現39個AGC蛋白激酶成員，根據其激酶催化結構域的變化可將它們分為6個亞族，但只有少數幾個AGC蛋白激酶基因的功能得到解析，分別參與植物生長激素的調節、根毛發育以及藍光信號和活性氧信號的傳導。

表4 轉基因小麥籽粒性狀的調查結果

表5 轉基因小麥紋枯病和赤霉病抗性表現

目前參與植物病害防御的AGC蛋白激酶基因除了TaPK-R1(TaAGC1)基因外，報道的只有3個基因分別在擬南芥、水稻和番茄中的功能被解析。如擬南芥的OXIDATIVESIGNAL-INDUCIBLE1(AtOXI1)蛋白激酶基因對模式觸發免疫(PTI，PAMP triggered immunity)和效應蛋白觸發免疫(ETI，effector triggered immunity)等植物免疫反應均有正調控作用[6]。在水稻中，Matsui等發現了與AtOXI1蛋白激酶基因同源的OsOxi1基因，研究結果表明該基因對水稻病害抗性起正調控作用，過表達OsOxi1基因可以增強水稻對稻瘟病(Magnaportheoryzae)的抗性，OsOxi1基因主要通過對OsPti1a的磷酸化，解除OsPti1a對水稻基礎抗性的負調控作用，從而提高水稻的基礎抗性[7]。番茄的細菌性斑點病主要由番茄細菌性斑點病菌(Pseudomonassyringaepv. Tomato)侵染引起，番茄的Pto激酶基因可以識別病原菌菌株種類，從而產生AvrPto效應物，加強番茄對病原菌侵染的抵抗。Devarenne等研究發現，一種屬于AGC Ⅷa的蛋白激酶AvrPto-dependentPto-interactingprotein3(Adi3)可能參與Pto基因的抗病過程，Adi3基因對宿主細胞的程序性死亡起負調控作用，Pto/AvrPto可與Adi3互作，造成病原菌侵染的宿主細胞死亡，從而增加宿主對病原菌的抗性[8]。本研究進一步證實TaPK-R1基因可以提高小麥的抗病性，組成型表達TaPK-R1轉基因小麥的紋枯病和赤霉病抗性都得到明顯提高。

研究表明，在轉基因小麥中組成型表達TaPK-R1基因沒有對小麥的生育期、生長習性、產量性狀、穗部性狀、株高和籽粒性狀產生明顯的影響。