上調CaMK Ⅱ抑制蛋白表達對HL-60 細胞增殖的抑制作用及機制研究

朱俊鋒 劉林 吳貽敏 黃志飛 何釗 鄧昌曼 李寧 張鳳（通訊作者）

（1 蚌埠醫學院第一附屬醫院血液科 安徽 蚌埠 230032）

（2 蚌埠醫學院臨床醫學系 安徽 蚌埠 230032）

鈣/鈣調素依賴性蛋白激酶Ⅱ（CaMK Ⅱ）為鈣信號下游的多功能絲/蘇氨酸蛋白酶的一種，一般由α、β、γ、δ 這四種亞單位組成，可以編碼十余種同功酶[1]。研究證實，CaMK Ⅱ在機體大部分的器官組織中廣泛存在，在腦、骨骼肌、肝、腎、腸道等組織以及生殖系統中同樣存在明顯表達，神經組織中的表達水平最為顯著[2]。曾有研究發現，CaMK Ⅱ異常活化與腫瘤的發生發展呈現出明顯的負相關。人內源性CaMKⅡ抑制蛋白（CaMKⅡN）的來源為樹突狀細胞，共包含有79 個氨基酸殘基[3]。在過去，針對哺乳動物的研究證實，這一抑制蛋白能夠利用與已發生自身磷酸化的CaMK Ⅱ發生特異性結合，進而對CaMK Ⅱ與其磷酸化底物相結合產酸有效阻斷，發揮抑制作用[4]。本文以對上調CaMK Ⅱ抑制蛋白表達對HL-60 細胞增殖的抑制作用及機制進行研究分析為目的，展開了如下研究。

1.資料與方法

1.1 一般材料

實驗中所需材料包括：人急性髓系白血病(AML)細胞系HL-60（購自美國ATCC 公司）、質粒載體pcDNA3.1/myc-His(-)B（購自美國Invitrogen 公司）、脂質體 Lipofectamine2000（購自美國Invitrogen 公司）、MTT（購自美國Sigma 公司）、碘化丙錠(PI)（購自美國Sigma 公司）、BCA 蛋白檢測試劑盒（購自法國PIERCE 公司）、抗人CaMK ⅡN 單克隆抗體(單抗)由本實驗室合成、pcDNA3.1/CaMK ⅡN 真核表達質粒前期經本實驗室合成，并通過鑒定。

1.2 實驗方法

將白血病細胞系HL-60 細胞作為本次對象，而后通過Lipofectamine 2000 脂質體法對CaMK1N 基因真核表達載體pcDNA3.1/CaMK Ⅱ N 以及空載體pcDNA3.1/myc-His(-)B 進行分別轉染細胞；利用Westernblot 法對轉染后的HL60 細胞 CaMK ⅡN 基因表達進行檢測；利用MTT 法對轉染 CaMK Ⅱ N 基因的細胞增殖情況進行檢測；采用半固體培養法對轉基因HL-60 細胞集落形成情況進行分析；利用Hoechst33342 熒光染色，對細胞凋亡進行觀察。

1.3 統計學方法

采取SPSS22.0統計學軟件進行數據處理，計量資料用（）表示，采取t檢驗，計數資料用（%）表示，采取χ2檢驗，P＜0.05差異具有統計學意義。

2.結果

2.1 CaMK Ⅱ N 基因轉染的HL-60 細胞的目的基因表達情況統計

試驗結果顯示，人CaMK Ⅱ N 基因能夠穩定轉染HL-60 細胞。在相對分子質量11000 處，轉染pcDNA3.1/CaMK ⅡN 的HL-60 細胞存在一個條帶，而轉染空載體pcDNA3.1 的細胞、未轉染的細胞者未觀察到相應條帶，反映出CaMK Ⅱ N 基因穩定轉入HL-60細胞內無有效表達蛋白。

2.2 上調CaMK Ⅱ N 基因表達對HL-60 細胞增殖的影響

經MTT 法檢測證實，轉染CaMK Ⅱ N24 小時的HL-60 細胞增殖水平相對于對照組，發生顯著降低（P＜0.05），見表1。

表1 上調CaMK Ⅱ N 基因表達對HL-60 細胞增殖的影響

2.3 CaMK Ⅱ N 基因過表達對HL-60 細胞凋亡的影響

CaMK Ⅱ N 轉染24 小時HL-60 細胞發生明顯皺縮的情況，粘附性明顯降低，經熒光染色后可發現，轉染CaMK Ⅱ N 基因的HL-60 細胞發生了明顯的凋亡，并且隨著時間的推移，凋亡的比例會繼續增加，轉染72 小時細胞凋亡率顯著增加，顯著高于空載體轉染組、未轉染組（P＜0.05），見表2。

表2 CaMK Ⅱ N 基因過表達對HL-60 細胞凋亡的影響

3.討論

鈣離子為一種重要的第二信使，鈣/鈣調素能夠磷酸化多種酶，在細胞周期的轉變中發揮了重要作用[5]。研究發現，CaMK Ⅱ N 為Ca2+/CaM 調節蛋白家族的重要成員之一，為多功能絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，其底物特異性較差，可對諸多蛋白、酶磷酸化產生催化作用，在各種信號的轉導中，均有廣泛參與，為Ca2+/CaM 在細胞周期不同時期轉變過程中，均發揮了重要的靶分子作用[6]。

研究證實，CaMK Ⅱ抑制劑可對CaMK Ⅱ活性產生特異性的抑制作用，能夠有效促進腫瘤細胞凋亡與壞死[7]。CaMK Ⅱ抑制劑還能夠使腫瘤細胞對缺氧的敏感性降低，造成腫瘤細胞微環境血管生成受到抑制，使腫瘤細胞對、放化療的敏感性予以增強。現階段，針對CaMK Ⅱ抑制劑的研究多為化學性合成抑制劑，這一機制多利用抗CaMK Ⅱ與Ca2+/CaM 結合區相結合，造成CaMK Ⅱ無法磷酸化，進而處在失活狀態[8]。但化學合成性抑制劑僅可以對無自身磷酸化的CaMK Ⅱ活性產生有效抑制，對自身磷酸化的CaMK Ⅱ活性不會產生明顯影響。相對于化學性抑制劑而言，CaMK ⅡN 屬于內源性CaMK Ⅱ抑制劑，能夠產生對CaMK Ⅱ活性產生特異性抑制的效果，并且僅會與活化的CaMK Ⅱ發生相互作用[9]。

本文中，以對上調CaMK Ⅱ抑制蛋白表達對HL-60 細胞增殖的抑制作用及機制進行研究分析為目的，通過研究證實，人CaMK Ⅱ N 基因能夠穩定轉染HL-60 細胞；呈現出CaMK Ⅱ N 基因過表達的HL-60 細胞相對于空載體轉染組、空白對照組，增殖明顯受到抑制；細胞集落形成能力顯著降低；轉染72h，細胞凋率明增高。這一結果與相關文獻[10]報道結果相似，由此證實，上調CaMK Ⅱ基因表達，可對HL-60 細胞增殖產生有效抑制，并誘導其凋亡。