胞外三磷酸腺苷對鉛脅迫下植物細胞損傷和過氧化氫及其清除酶水平的調節

曹佳鑫 達夢婷 龐海龍 賈凌云 馮漢青

(西北師范大學生命科學學院，蘭州 730070)

近年來，由于礦產資源大規模開采、富含重金屬污染物的無序排放以及含重金屬的農藥和化肥大量使用等因素，土壤和水體中重金屬的含量水平不斷增加。其中，鉛是當前環境中最為常見且毒性最強的重金屬污染之一[1]。

鉛作為植物的非必需元素能夠對植物產生毒害作用[2]。研究表明，鉛會隨著植物吸收礦物質營養時通過根部進入植物體內[3]，而過量的鉛吸收會抑制植物種子萌發和幼苗的生長，引起植物根部中毒，進而造成發育遲緩并影響植物的形態建成[4]。細胞生物學的研究進一步發現，鉛會抑制植物酸性磷酸酶、酯酶、過氧化物酶等多種酶的活性，并通過增加活性氧(ROS)的產生引起組織中的氧化壓力，進而導致DNA的損傷、基因突變和膜質過氧化等一系列變化[5～6]。而植物也能夠利用體內的抗氧化系統在一定程度上抵抗鉛脅迫對植物造成的上述不良影響[7]。

三磷酸腺苷(adenosine-5′-triphosphate，ATP)是細胞內儲存和供應能量的貨幣分子。傳統觀念認為，三磷酸腺苷通常存在于細胞內部，通過提供能量來維持機體的正常代謝和生存。然而，許多研究表明，動物、植物和微生物細胞內的三磷酸腺苷可以通過通道蛋白、囊泡運輸等方式被釋放到細胞外基質中，因而在細胞外基質中也存在三磷酸腺苷，即胞外三磷酸腺苷(extracellular ATP,eATP)[8]。在動物細胞中發現，胞外三磷酸腺苷能夠通過作用于細胞膜上的特異性受體調控動物細胞或組織的多種生理活動，如平滑肌血小板的聚合、糖原的降解以及激素的釋放等[9]。近年來，植物胞外三磷酸腺苷及其生物學功能的研究也越來越受到關注和重視?，F有的研究表明，植物細胞能夠通過ATP結合轉運載體蛋白或膜泡運輸的方式將細胞內的三磷酸腺苷釋放到胞外[10～11]。進一步研究揭示，植物的胞外三磷酸腺苷也是一種重要的信號分子，能夠通過受體介導的作用來調節植物的細胞活力、生長發育、抗病性、向地性等生理活動[12]；此外，胞外三磷酸腺苷還能夠刺激Ca2+、活性氧、一氧化氮等信號分子的產生，且茉莉酸和乙烯合成相關基因的表達也被受到了胞外三磷酸腺苷的上游調控[13～15]。Choi等[16]已在擬南芥中鑒定出能特異性結合胞外三磷酸腺苷的受體蛋白，進一步明確了胞外三磷酸腺苷在植物中作為信號分子的角色。最新的研究證明，胞外三磷酸腺苷可以緩解鹽脅迫引起的植物細胞死亡和呼吸抑制[17]。然而，在鉛這一常見的毒性重金屬脅迫發生時，植物胞外三磷酸腺苷在植物細胞中的生理學變化以及相應的生物學功能尚未見明確的報道。

基于此，本文以煙草懸浮細胞培養物為材料，探討了在鉛離子脅迫下胞外三磷酸腺苷的水平變化以及其對細胞損傷、H2O2(過氧化氫)含量及H2O2清除酶活性的調節。相信該研究將進一步豐富人們對鉛脅迫下植物細胞內在生理學變化的認識，也有助于進一步了解胞外三磷酸腺苷的生理學功能。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗所用BY-2煙草懸浮細胞(NicotianatabacumL.cv.Bright Yellow-2)由香港中文大學姜里文教授饋贈。

1.2 方法

1.2.1 煙草懸浮細胞培養

將懸浮細胞置于補充了3%(質量百分數)的蔗糖和0.4 mg·L-1的2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-D)的MS[18]液體培養基(pH=5.8)(Sigma-Aldrich公司)中，在25℃黑暗的條件下振蕩培養(振蕩速率為130 r·min-1)。每7天吸取10 mL的細胞培養物轉至100 mL新鮮的MS培養基中進行傳代培養。所有操作均在無菌條件下完成。

1.2.2 懸浮細胞的處理

取一定體積的處于生長對數期的細胞懸液，以1∶5的體積比用去離子水稀釋并搖勻，過濾后用去離子水洗滌1～2次并分別進行如下兩組處理，第一組處理：將細胞分別置于30、100、200或400 μmol·L-1的Pb(NO3)2中，在25℃黑暗條件下振蕩孵育5 h，以等體積去離子水處理的懸浮細胞液作為對照；第二組處理：將細胞分別置于30 μmol·L-1ATP、200 μmol·L-1Pb(NO3)2+30 μmol·L-1ATP或200 μmol·L-1Pb(NO3)2中，在25℃黑暗條件下振蕩孵育5 h，以等體積去離子水處理的懸浮細胞液作為對照。

1.2.3 細胞損傷水平的測定

用伊文思藍(Evans blue)定量檢測細胞的受損程度。取1 mL處理后的細胞懸液，加入100 μL 0.25%(質量百分數)的伊文思藍染液混勻染色8 min，之后在3 000 r·min-1下離心3 min后棄上清，加入1 mL磷酸緩沖液(PBS)洗滌細胞，于3 000 r·min-1離心3 min后棄上清以洗去未與細胞結合的染料。之后向細胞中加入1 mL 1%(質量百分數)的十二烷基磺酸鈉溶液(50%甲醇配制而成)，混勻后在50℃恒溫水浴中放置30 min，使細胞裂解。于10 000 r·min-1條件下離心10 min，取500 μL上清液，用蒸餾水稀釋至3 mL，在595 nm處測定吸光值，以反映細胞的損傷程度[19]。

熒光素雙醋酸酯(fluorescein diacetate,FDA)可與活細胞結合，并在被激發后釋放出綠色熒光；碘化丙啶(Propidium iodide,PI)能穿過破損的細胞膜而對核染色，嵌入雙鏈DNA后釋放紅色熒光。上述兩種染料的雙染可用于進一步定性檢測細胞活力以及受損水平[20]。取415 μL處理后的細胞懸液，加入20 μg·mL-1的FDA和5 μg·mL-1的PI(Sigma-Aldrich公司)，在室溫下黑暗培養10 min，加800 μL磷酸緩沖液(PBS)，在1 600 r·min-1下離心3 min，去上清液，將樣品在激光共聚焦顯微鏡(Leica,sp8)下進行觀察并成像。

1.2.4 胞外及胞內三磷酸腺苷水平的檢測

三磷酸腺苷水平使用螢火蟲尾部提取物(Sigma-Aldrich公司)測定。螢火蟲尾部提取物的主要成分為熒光素和熒光素酶，三磷酸腺苷可與熒光素經熒光素酶催化發生反應并釋放熒光，通過測定發光強弱測定三磷酸腺苷的水平[21]。取處理后的細胞懸液1 mL,在4 000 r·min-14℃條件下離心4 min，吸取上清液，進行胞外三磷酸腺苷水平的測定；在去除上清的細胞中加入100 μL ATP檢測裂解液(Sigma-Aldrich公司)使細胞內ATP釋放，于12 000 r·min-1條件下4℃離心5 min，上清液用于胞內三磷酸腺苷水平的測定。測定方法依照制造商說明書進行。

1.2.5 H2O2含量、CAT酶活性、POD酶活性的測定

H2O2含量、CAT酶活性、POD酶活性的測定分別采用過氧化氫含量檢測試劑盒、過氧化氫酶活性檢測試劑盒、過氧化物酶活性檢測試劑盒(北京索萊寶公司)采用分光光度法定量檢測。具體操作參考說明書進行。

1.2.6 統計學分析

以上測量取4次獨立實驗結果的平均值，并將數值表示為平均值±標準偏差。數據采用雙總體t檢驗，檢驗在P<0.05水平上的差異顯著性。

2 結果與分析

2.1 Pb(NO3)2對細胞損傷水平和H2O2含量的影響

結果顯示，隨著Pb(NO3)2處理濃度的增加，細胞損傷水平呈顯著性上升。其中，30和100 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理分別使得細胞損傷水平較之對照增加了1.21和1.95倍；而200和400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理則使得細胞損傷水平進一步上升，較之對照分別增加了2.84和3.14倍(圖1)。

圖1 不同濃度Pb(NO3)2處理下的細胞受損水平 不同字母表示在P<0.05水平上具有顯著性差異，下同。Fig.1 The level of cellular damage under the treatment with different concentrations of Pb(NO3)2 Different letters indicate significant differences at P<0.05,the same as below.

通過檢測H2O2的含量變化發現，隨著Pb(NO3)2處理濃度的增大，細胞H2O2的含量呈現先升高后降低的趨勢。在30、100 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下細胞H2O2含量較之對照顯著性升高；在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下，H2O2含量達到最大值，在400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下H2O2含量較之峰值有所下降，但仍高于對照(圖2)。

圖2 不同濃度Pb(NO3)2處理下細胞內H2O2水平Fig.2 The level of H2O2 under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖3 不同濃度Pb(NO3)2處理下CAT活性變化Fig.3 The level of CAT activity under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

2.2 Pb(NO3)2脅迫對CAT和POD活性的影響

CAT和POD是植物細胞清除過氧化氫的主要酶類。本研究發現，隨著Pb(NO3)2處理濃度的增加，CAT酶的活性表現出和H2O2含量相似的變化規律：在30、100、200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下，CAT酶的活性不斷增加，在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下達到最大值，較對照提高了5.8倍；而當Pb(NO3)2濃度達到400 μmol·L-1時，CAT酶的活性較之峰值有所下降，但仍顯著性高于對照(圖3)。

POD酶活性則隨著Pb(NO3)2處理濃度的增加不斷下降。與對照相比，在30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理下，POD酶活性分別降低了20%，41.7%，58.1%，65.1%，其差異均達到顯著性水平(圖4)。

圖4 不同濃度Pb(NO3)2處理下POD活性變化Fig.4 The level of POD activity under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖5 不同濃度Pb(NO3)2處理下細胞外三磷酸腺苷含量的變化Fig.5 The level of extracellular adenosine-5′-triphosphate under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖6 不同濃度Pb(NO3)2處理下細胞內三磷酸腺苷含量的變化Fig.6 The level of intracellular adenosine-5′-triphosphate under treatment with different concentrations of Pb(NO3)2

圖7 不同處理下細胞損傷水平的變化 A.伊文思蘭染色法檢測細胞損傷程度；B.FDA/PI染色法檢測細胞損傷和活力程度Fig.7 The level of cellular damage under different treatments A.Detection of cell damage with Evansblue staining; B.Detection of cell damage and viabilityby FDA/PI staining

圖8 不同處理下細胞內H2O2水平Fig.8 The level of H2O2 under different treatments

2.3 Pb(NO3)2脅迫對細胞外及胞內三磷酸腺苷含量的影響

如圖5顯示，隨Pb(NO3)2脅迫濃度的增大，細胞外三磷酸腺苷含量不斷降低。較之對照，30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2分別使細胞外三磷酸腺苷含量降低了24.8%、44.1%、52.6%、77.7%(圖5)。而胞內三磷酸腺苷的含量則因Pb(NO3)2處理而有所增加：較于對照，30、100、200、400 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理分別使細胞內三磷酸腺苷含量升高了0.297、2.73、2.02、2.84倍(圖6)。

2.4 外源三磷酸腺苷對Pb脅迫誘導的細胞損傷和H2O2積累的影響

如圖1～4的結果所示，在200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下，細胞的H2O2含量達到了最大值，提示了該濃度Pb(NO3)2的處理使得細胞處于最大的氧化壓力。因此，本研究選擇了在200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理的細胞中以探究鉛脅迫下胞外三磷酸腺苷對細胞損傷和H2O2以及H2O2清除酶的可能影響。

結果表明，對未經過Pb(NO3)2脅迫的細胞加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷未引起細胞損傷和H2O2含量的顯著性變化(圖7～8)。較之200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理的細胞，在Pb(NO3)2處理的細胞中加入30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷明顯緩解了細胞損傷和H2O2含量的上升。PI和FDA的雙染實驗所得結果和伊文思藍法檢測結果基本一致。

2.5 外源三磷酸腺苷對Pb(NO3)2脅迫下CAT酶和POD酶活性的影響

由圖9可知，對未經過Pb(NO3)2脅迫處理的懸浮細胞中加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷使得CAT酶活性略有上升，但沒有達到顯著性水平；相似的，對未經過Pb(NO3)2脅迫處理的懸浮細胞中加入30 μmol·L-1的外源三磷酸腺苷也沒有顯著改變POD酶的活性。

相較于200 μmol·L-1的Pb(NO3)2處理的細胞，在Pb(NO3)2處理的細胞中加入30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷使得CAT酶活性顯著性下降，并使得POD酶活性顯著性升高(圖9～10)，表明外源三磷酸腺苷對鉛處理下H2O2清除酶活性具有明顯的調節作用。

圖9 不同處理下CAT酶活性的變化Fig.9 The level of CAT activity under different treatments

圖10 不同處理下POD酶活性的變化Fig.10 The level of POD activity under different treatments

3 討論

目前，鉛離子對植物造成的毒害作用是植物生理與生態學研究的重點問題之一[1～4]。本研究發現，在Pb(NO3)2處理下，細胞損傷水平隨鉛離子脅迫濃度的增大而上升(圖1)；同時，細胞H2O2的含量也呈現出增大的趨勢(圖2)。已有研究表明，鉛等重金屬脅迫會引發植物細胞活性氧水平的上升，進而導致細胞膜損傷，以及影響核酸、蛋白質等大分子受損，并進而誘導細胞死亡[4]。而在細胞產生的活性氧當中，H2O2具有最長的半衰期以及穿膜的功能，因而對植物產生的氧化壓力具有范圍廣、持續時間長的特點，其過量產生是許多生物性和非生物性脅迫導致植物細胞損傷的重要原因[22～24]。所以推測在鉛脅迫下細胞損傷程度的上升也和H2O2積累密切相關。

CAT和POD是細胞內主要的H2O2脫毒酶類:CAT能夠在過氧化物酶體、細胞質和線粒體中將H2O2分解為水和氧氣分子[25]；而POD則通過H2O2為電子受體催化酚類等物質氧化從而減少了細胞H2O2的水平[26]。本文通過檢測上述兩種酶的活性變化發現，隨Pb(NO3)2處理濃度增加，CAT酶活性呈現出和H2O2含量變化相同的趨勢；而POD則呈現出不斷減小的趨勢。這與黃金秋等[27]在外源H2O2處理下水稻懸浮細胞中CAT和POD活性變化規律相似。一方面，這表明了在Pb脅迫下，H2O2清除酶的活性發生了明顯的變化，不同的H2O2清除酶對于氧化壓力的敏感程度和響應規律有所不同；另一方面，在Pb脅迫下CAT酶活性和H2O2含量變化的相似性提示了CAT較之POD在細胞調節H2O2水平中可能扮演著更為主要的角色。此外，有研究表明，當植物體內由重金屬及其所誘導的ROS含量達到一定水平時可引起抗氧化酶失活，酶合成減少或者酶亞基裝配發生改變[28～29]。因此，在Pb脅迫下CAT和POD酶活性變化的不同也可能反應了兩種酶對于鉛及其所誘導的氧化壓力的耐受度有所不同。

以前的諸多工作報道，當植物細胞遭受鉛等重金屬脅迫時，植物需要產生更多的能量以增加離子的轉運并產生能夠特異性結合重金屬的多肽以緩解重金屬的毒性[30]。本研究也觀察到Pb(NO3)2脅迫導致了胞內三磷酸腺苷水平的升高(圖6)。然而有趣的是，盡管細胞外三磷酸腺苷來自于細胞內的三磷酸腺苷，但Pb(NO3)2脅迫下胞外三磷酸腺苷水平則呈現出下降趨勢(圖5)。這表明，細胞外和細胞內的三磷酸腺苷的水平至少在Pb脅迫下是被細胞獨立調控的。推測Pb可能是通過影響通道蛋白或是囊泡運輸等方式降低了胞外三磷酸腺苷從細胞內向細胞外的輸送所致。

由于在200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理下細胞處于最大的氧化壓力，我們繼而選擇了在200 μmol·L-1Pb(NO3)2處理的細胞中探究了Pb脅迫下胞外三磷酸腺苷水平的變化是否能影響細胞損傷、H2O2含量及H2O2清除酶的活性。實驗結果顯示，在無Pb離子處理下，對細胞施加30 μmol·L-1外源三磷酸腺苷時，沒有引起細胞損傷、H2O2含量以及CAT、POD酶活性的顯著性變化。而對Pb離子處理的細胞中施加該濃度的外源三磷酸腺苷則明顯緩解了Pb脅迫所引起的細胞損傷、H2O2含量的積累以及CAT活性的上升；同時，Pb脅迫所引起的POD酶活性的減弱也因外源三磷酸腺苷的加入而有所恢復(圖10)。從上述的變化趨勢和生理學參數的相關性分析，在Pb離子脅迫下，細胞外三磷酸腺苷的增加能夠明顯的降低植物細胞的氧化壓力以及細胞損傷，這可能是由于胞外三磷酸腺苷能夠刺激POD酶活性的上升或調動了細胞中其他減少H2O2產生的生理學機制。盡管其具體原因尚需進一步查實，但上述結果表明，胞外三磷酸腺苷水平的變化在鉛離子脅迫誘導的細胞損傷和氧化壓力中扮演著重要的角色。

Chivasa等[31]發現，細胞外三磷酸腺苷的增加能夠有效緩解fumonisin(一種真菌毒素)引起的植物細胞活力的下降。因此，在一些生物性或是非生物性脅迫下胞外三磷酸腺苷對于植物細胞損傷或是活力的調控作用很可能具有一定的廣譜性。期望胞外三磷酸腺苷這種功能將在未來更多學者的工作中得以證實。