“丹莓1號”草莓脫毒組培快繁技術研究

王 馨 蓋慶巖 焦 驕 付玉杰 劉 婧 王紫瑩

(東北林業大學森林植物生態學教育部重點實驗室，哈爾濱 150040)

草莓(Fragaria×ananassaDuch.)是薔薇科(Rosaceae)草莓屬(Fragaria)多年生草本植物，在世界上大部分國家和地區均有分布[1]。草莓果實營養價值較高，富含維生素C、維生素A、胡蘿卜素、花青素等活性物質，具有保護視力、抗衰老、預防心腦血管疾病、提高免疫力、增強胃腸道蠕動等諸多保健功能，故有“水果皇后”之美譽[2]。此外，據美國農業研究中心研究發現，在8種能夠降低癌死亡率的水果中，草莓居于首位[3]。因此，草莓的種植栽培蘊藏著巨大的經濟價值。

近些年來，我國草莓產業發展迅速，種植面積和產量已躍居世界首位[4]。依據地理位置和自然條件，可將我國的草莓產地劃分為3大主產區，即北方產區、中部產區和南方產區[2]。近些年來，東北地區草莓種植產業發展也較為迅速，例如大連，丹東等地已有較大規模的草莓種植基地。目前，相關科研機構已培育出適宜東北氣候生長的草莓品種，如“丹莓1號”“九九”“章姬”“豐香”“碩豐”“明晶”“星都1號”等品種草莓。其中“九九”草莓最為有名，在丹東地區廣泛栽培種植，年產量已達20萬噸，使丹東成為我國最大的草莓基地，被稱為“草莓之鄉”。

東北位于溫帶季風氣候區，四季分明，秋冬季持續時間長且寒冷干燥，春夏季雖暖熱多雨但持續時間較短。這種氣候條件使得很多作物無法在東北地區更好的生長，即便能夠生長也僅一年一熟，產量較低。草莓是一種喜光、喜水，對溫度有一定要求的作物。受東北地區氣候條件限制，草莓有效生長期短，難以利用傳統匍匐莖繁殖的手段獲得大規模種苗，且即便利用這種傳統方式獲得種苗，也因連作和長期營養繁殖而導致植株體內積累各種病毒，造成種苗優勢退化，生長速度慢，抗逆、抗病蟲害能力減弱，果實產量和品質嚴重下降，進而降低其經濟價值，給農民增產增收造成極大影響[4]。為了滿足市場需要，進一步提高草莓的生產規模及品質，亟需尋求一種可有效解決東北地區優良草莓品種繁育困難的技術手段。

近些年來，植物組培快繁技術在優良作物品種和瀕危植物規模化繁育方面應用廣泛，該技術基于植物細胞具有全能性的這一特點，通過無菌組培技術，在短時間內獲得大量的遺傳性質均一的完整植株。該技術具有不受季節限制、培養周期短、易于規模化生產等優點，尤其在解決植物脫毒方面具有顯著的優勢。目前使用植物莖尖組織脫毒培養技術獲取無病毒苗的方法已在很多作物繁育方面得到了廣泛應用，如馬鈴薯[5]、甘薯[6]、香石竹[7]、菊花[8]等，在全國不少地區已經建立了植物脫病毒苗生產中心及基地。

植物莖尖組織脫毒培養技術不僅可以快速繁殖出大量優質的草莓種苗，更有利于優良品種的提純和更新，減少病毒感染進而提高草莓的產量和品質，是促進草莓產業良性健康發展的有效途徑[9]。

“丹莓1號”草莓適應東北地區的氣候條件，耐寒，抗逆、抗病蟲害能力強，且目前還未有關于該品種草莓的脫毒組培快繁技術研究。本文選擇以“丹莓1號”草莓的莖尖作為外植體進行組織培養，探究其最佳的芽誘導、增殖、生根培養所需的激素種類和濃度，確定最佳移栽基質，以期為“丹莓1號”草莓品種脫毒苗的產業化生產提供技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料來源

供試草莓品種為“丹莓1號”，由遼寧草莓科學技術研究院提供。該品種生長特性、果實品質、平均畝產、種植管理等資料，詳見http://www.lndgcm.com/mshtml/2015-4/343.html。

1.2 材料的消毒處理

剪取長約2 cm的草莓匍匐莖尖，用自來水持續沖洗6 h，之后在超凈工作臺中用75%酒精消毒30 s，無菌水沖洗3次，再用0.1%氯化汞滅菌15 min，無菌水沖洗3次，剝去莖尖外面的幼葉，取出生長點，待接種。

1.3 培養基的配制

以MS培養基為基本培養基，添加不同種類和不同濃度的植物生長激素(NAA、2,4-D、6-BA和IBA)配制培養基。具體如下：誘導培養基[添加固定濃度1.0 g·L-16-BA和不同濃度的NAA(0.05～0.50 mg·L-1)或2,4-D(0.05～0.50 mg·L-1)組合]、增殖培養基[添加固定濃度1.0 g·L-16-BA和不同濃度的NAA(0.1～0.5 mg·L-1)或2,4-D(0.1～0.5 mg·L-1)組合]和生根培養基[添加不同濃度的IBA(0.1～0.4 mg·L-1)]，每種培養基中均加入蔗糖30 g·L-1，瓊脂8 g·L-1，調節培養基pH5.80±0.05，121℃高溫滅菌20 min。

1.4 莖尖誘導培養

切取0.2 mm消毒后的莖尖生長點，接種到添加固定濃度6-BA(1.0 mg·L-1)和不同濃度生長素(0.05～0.20 mg·L-1的NAA或0.05～0.20 mg·L-1的2,4-D)的MS培養基上，置于溫度25±2℃、光照強度2 000 lux、光周期16 h·d-1的環境下進行培養。每個芽誘導培養基接種莖尖數1個，重復6個樣品。

1.5 增殖繼代培養

將莖尖誘導出的叢生不定芽分割成3～4株小的芽叢，轉接到添加固定濃度6-BA(1.0 mg·L-1)和不同濃度生長素(0.1～0.5 mg·L-1的NAA或0.1～0.5 mg·L-1的2,4-D)的MS培養基上進行增殖培養，培養溫度、光照強度和光周期等其他培養條件如1.4中所述，每隔25～30 d繼代1次。

1.6 生根培養

挑選高度2～3 cm，長勢較好的無根苗，將其轉接到添加不同濃度IBA(0.1～0.5 mg·L-1)的MS培養基上進行生根培養，培養溫度、光照強度和光周期等其他培養條件如1.4中所述。

1.7 馴化及移栽處理

將根系發達、生長茂盛的生根苗從培養瓶中取出，去除根部多余的培養基，將其栽入裝有提前滅菌的移栽基質[由苗圃土、蛭石、珍珠巖三者混合制備而成，本研究分別考察了上述材料以3種不同比例(1∶2∶2、1∶2∶1和0∶2∶1)混合而成的基質]的32孔育苗盆中，覆蓋保鮮膜以防水分散失，5 d后去掉保鮮膜，室內馴化10 d后將其移栽入白色方盆中適應環境，最后移栽至室外大田中。

1.8 數據統計

誘導率=誘導出不定芽的外植體數/接種的總外植體數×100%

(1)

增殖系數=增殖的不定芽數量/接種的不定芽數量

(2)

生根率=生根試管苗數/接種試管苗數×100%

(3)

移栽成活率=移栽成活的植株數/移栽植株的總數×100%

首先將高純錫樣品加工至儀器分析要求的尺寸；用車床刨光處理樣品分析面使其待測面光滑平整(能完全遮擋住樣品盒中激發孔并保證無縫隙露出)；用硝酸和超純水配制出5%稀硝酸，將待測樣品進行泡洗后再用超純水反復清洗，之后在干凈環境用普通氬氣將其吹干。

(4)

試驗所得數據采用Microsoft Office Excel 2010程序處理，并用其制表；運用SPSS 19.0軟件進行數據統計分析。實驗結果差異性顯著分析是通過單變量方差分析(ANOVO)結合鄧肯檢驗在P<0.05的顯著水平上實現的。

2 結果與分析

2.1 不同濃度NAA和2,4-D對草莓莖尖不定芽誘導的影響

草莓莖尖在添加固定濃度6-BA(1.0 mg·L-1)的MS培養基中，其誘導率隨著NAA的濃度從0.05 mg·L-1增加到0.2 mg·L-1逐漸從69%升高到82%，然后隨著NAA的濃度從0.2 mg·L-1增加到0.5 mg·L-1，其誘導率從82%降低至60%(圖1a)。草莓莖尖誘導率隨著2,4-D的濃度從0.05 mg·L-1增加到0.1 mg·L-1逐漸從81%升高到92%，然后隨著2,4-D的濃度從0.1 mg·L-1增加到0.5 mg·L-1，其誘導率從92%降低至62%(圖1b)。根據不定芽的最高誘導率，在含有1.0 mg·L-16-BA的MS培養基中添加2,4-D對不定芽的誘導效果要明顯優于NAA。因此，本研究選取MS+1.0 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12,4-D作為“丹莓1號”草莓誘導莖尖分化不定芽的最佳培養基。我們將草莓莖尖外植體接種在該培養基上(圖4:A)培養40 d，可成功誘導莖尖分化出不定芽(圖4:B)。

2.2 不同濃度NAA和2,4-D對于草莓不定芽增殖的影響

將不同濃度的NAA或2,4-D與1.0 mg·L-1的6-BA結合進行草莓不定芽的增殖，增殖效果最佳的是在培養基中添加0.3 mg·L-1的NAA，其增值系數可達22(圖2)。因此，本研究選取MS+1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA為最佳的“丹莓1號”草莓不定芽增殖培養基。將草莓莖尖誘導出的不定芽轉移到該培養基上培養20 d(圖4:C)和30 d(圖4:D)，發現不定芽增殖效果良好，出現了明顯的叢生芽。

圖2 不同濃度NAA(a)和2,4-D(b)對“丹莓1號”草莓不定芽增殖的影響(培養30 d)Fig.2 Effects of different concentrations of NAA(a) and 2,4-D(b) on the proliferation of “Dan Mei 1” strawberry adventitious buds(culture for 30 d)

2.3 不同IBA濃度對于組培苗生根的影響

隨著IBA濃度升高，草莓不定芽生根率呈總體上升的趨勢，最適濃度為0.4 mg·L-1，最高生根率可達90%，當NAA濃度進一步增加至0.5 mg·L-1，草莓不定芽生根率出現了下降趨勢(圖3)。因此，MS+0.4 mg·L-1IBA是誘導“丹莓1號”草莓組培苗生根的最佳培養基。我們將培養了30 d后的草莓叢生芽剝離成單一無根苗，并將其轉移到最佳生根培養基中(圖4:E)，培養30 d后可得生長狀態良好的生根組培苗(圖4:F)。

圖3 不同IBA濃度對于“丹莓1號”草莓不定芽生根的影響Fig.3 Effects of different concentrations of IBA on rootage of “Dan Mei 1” strawberry adventitious buds

2.4 不同移栽基質對于生根苗移栽成活率的影響

我們將長勢較好的“丹莓1號”草莓組培苗從培養基中取出，將其轉移到含有不同比例混合的移栽基質中，考察其成活率情況。實驗結果如表1所示，在苗圃土∶蛭石∶珍珠巖=1∶2∶2,移栽成活率是84%，在苗圃土∶蛭石∶珍珠巖=1∶2∶1,移栽成活率是91%，在苗圃土∶蛭石∶珍珠巖=0∶2∶1，移栽成活率是78%。因此，我們選定移栽成活率最高的基質(苗圃土∶蛭石∶珍珠巖=1∶2∶1)為最佳的草莓組培苗移栽基質。同時，在實驗過程中發現，生長于消毒處理過的移栽基質中的草莓，其生長狀態要優于生長于未經消毒處理的移栽基質中的草莓，成活率也顯著增高(圖4:G)。待適應土壤環境后，我們將植株從穴盤中轉至室外大田中進行栽培，我們發現經莖尖脫毒后的草莓長勢良好，抗病蟲害、抗逆能力顯著增強(圖4:H～I)。

圖4 “丹莓1號”草莓脫毒組培快繁過程 A.接種在誘導培養基上的莖尖；B.莖尖經誘導分化成的不定芽(培養40 d)；C.轉接到增殖培養基上培養20 d的不定芽；D.轉接到增殖培養基上的培養30 d的不定芽；E.接種到生根培養基上的單一不定芽；F.生根組培苗；G.室內煉苗；H～I.移載至室外大田的“丹莓1號”脫毒草莓苗Fig.4 Rapid propagation of “Dan Mei 1” virus-free strawberry using tissue culture technology A.The inoculation of shoot tip on induction medium; B.The differentiation of shoot tip into adventitious buds(culture for 40 d); C.The culture of adventitious buds on proliferation medium for 20 d; D.The culture of adventitious buds on proliferation medium for 30 d; E.The inoculation of a single adventitious bud on rootage medium; F.The rooted plantlet; G.The indoor acclimatization of plantlet; H-I.The field culture of “Dan Mei 1” virus-free strawberry

表1 不同移栽基質對“丹莓1號”草莓組培苗移栽成活率的影響

Table 1 Effects of different transplanting substrates on the survival rate of “Dan Mei 1” strawberry plantlets

處理Treatment基質配比Substrate ratio苗圃土Nursery soil蛭石Vermiculite珍珠巖Perlite移栽成活率survival rateA12284%±3%B12191%±2%C02178%±5%

3 討論

在植物離體組織培養過程中，脫分化和再分化是兩個至關重要的過程。脫分化是指將已分化細胞經過誘導后轉變成未分化細胞的過程，而再分化是將已經脫分化的細胞再經過一定條件的誘導后，經過愈傷組織或胚狀體再分化出芽和根，最后形成完整植株的過程。組培快繁其實就是研究植物離體組織的脫分化和再分化過程。眾所周知，影響植物脫分化和再分化最重要的因素就是植物激素，它分為生長素和細胞分裂素。對于誘導外植體成芽，促進不定芽增殖，誘發不定芽生根，這些階段所需生長素和細胞分裂素的種類、濃度和配比是不同的[10]，在本實驗中，我們選用在MS基本培養基中添加不同類型、不同濃度和不同配比的生長素和細胞分裂素進行草莓莖尖誘導不定芽、不定芽增殖及其生根的研究。根據以往的研究報道發現，1.0 mg·L-1的細胞分裂素6-BA對于植物不定芽的誘導及增殖具有較好的影響。我們前期的預實驗，也證明該濃度的6-BA有利于“丹莓1號”草莓莖尖不定芽的誘導和增殖。基于此，本實驗選擇了使用1.0 mg·L-1的6-BA結合不同濃度的NAA和2,4-D探究不同植物生長素對于“丹莓1號”草莓莖尖不定芽的誘導及增殖的影響。

莖尖分化成不定芽后，需要對不定芽進行增殖培養以進一步擴大不定芽數量和規模。在組織培養過程中，不定芽的增殖系數對組織培養快繁起著制約作用[15]。本研究發現相比較2,4-D，NAA對“丹莓1號”草莓莖尖不定芽增殖效果最佳。此外，隨著NAA濃度的上升，不定芽增殖系數呈現先上升后下降的趨勢，這一現象與前人研究結果較為一致。翟婷婷等研究發現，隨著NAA濃度的升高，“紅顏”草莓不定芽的增殖系數也呈現先升高后降低的趨勢，這說明適宜濃度的NAA對于草莓不定芽的增殖有較好的效果，而高濃度的NAA則不利于草莓不定芽的增殖[16]。陳林晶等在對麗格海棠(Begonia×elatior)組織培養技術的研究發現，在6-BA濃度不變條件下，不定芽增殖率的大小隨著NAA濃度的升高也呈現先升高后降低的趨勢[17]。陳菊等在對6-BA與NAA濃度配比對何首烏不定芽增殖的實驗研究中發現，在相同濃度6-BA條件下，不同濃度NAA對不定芽的增殖的促進作用依次為0.5 mg·L-1>0.2 mg·L-1>1.0 mg·L-1，NAA 0.5 mg·L-1為不定芽增殖最佳濃度，較低濃度NAA不利于不定芽的增殖不假，但較高濃度NAA對不定芽增殖也起到了抑制作用[18]。

不定芽成功增殖后，我們需要對不定芽進行生根培養，只有生根的不定芽才是完整的植株，才能進行后續的煉苗和移栽。相關研究發現IBA對草莓組培苗生根具有顯著的促進作用[19]。本研究發現0.4 mg·L-1IBA對“丹莓1”草莓組培苗誘導生根效果最好。相關研究表明，IBA濃度在0.01～1.0 mg·L-1范圍時，有利于植物組培苗生根,高于或低于該區間濃度，均不利于植物體生根[20]。此外，林萍等研究發現，0.4 mg·L-1IBA有利于“章姬”草莓組培苗生根[21]，這和本實驗研究結果一致。

組培苗的移栽馴化，對于其后期產業化實際應用至關重要。本項研究發現生長于苗圃土∶蛭石∶珍珠巖=1∶2∶1混合的移栽基質中的草莓成活率最高，且其在莖、根、葉片量以及株高等方面，展示出的生長效果都是最好的。這與晁慧娟等對“甜查理”草莓移栽馴化的研究[22]結果類似。

4 結論

脫毒組培快繁技術是保證優良草莓品種種苗優勢，維持其抗逆、抗病蟲害能力，減少草莓病蟲害發生，提高草莓產量與質量的一種合理有效的方法，而且該技術周期短，成本低，便于自動化和工廠化生產應用。不同品種草莓組培快繁過程中所需植物激素類型與濃度是不一樣的，這可能與草莓的基因型、所選外植體類型、植物體生長狀態等都有關系。東北地區氣候條件特殊，對于草莓這種不耐寒的植物來說，有效生長周期太短，傳統營養繁殖方式難以獲得規模化種苗，即便能夠獲得種苗，也因病毒積累而造成草莓種苗優勢退化、果實產量和品質下降等。因此，本研究選擇用適宜在東北地區栽培的優良品種“丹莓1號”草莓的莖尖作為外植體，確定了其組培快繁過程中涉及到的各種培養基，包括最佳不定芽誘導培養基MS+1 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-12,4-D；最佳不定芽增殖培養基MS+1 mg·L-16-BA+0.3 mg·L-1NAA；最佳不定芽生根培養基MS+0.4 mg·L-1IBA以及組培苗移栽馴化最佳基質苗圃土∶蛭石∶珍珠巖=1∶2∶1。本項研究所建立的“丹莓1號”草莓莖尖脫毒組培快繁技術可為東北地區該優良品種草莓的規模化繁育提供技術支撐。