健脾補腎方對再生障礙性貧血患者骨髓增生及相關細胞因子的影響

曹宇峰 張琳琳 呂麗麗 王磊 邊月平

再生障礙性貧血(AA)是臨床常見的造血障礙性疾病，患者由于全血細胞減少而出現貧血癥狀，常合并出血和感染，且易并發中毒性休克等并發癥，對患者生命安全和生活質量造成嚴重影響[1-3]。目前，西醫針對AA尚缺乏特效治療方法，主要采用免疫抑制劑、細胞刺激因子療法及其他對癥處理措施，雖然能夠有效改善患者臨床癥狀，但長期用藥易產生肝腎毒性，患者耐受性差[4-6]。研究發現，中醫藥治療AA能夠顯著提高疾病緩解率，且不具有西藥的毒副作用。本研究采用健脾補腎方治療AA，旨在觀察健脾補腎方對AA患者骨髓造血及相關細胞因子的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 將2016年1月至2018年6月我院收治的90例再生障礙性貧血患者納入研究范圍，按照隨機數字表法隨機分為對照組和治療組，每組45例。對照組中，男25例，女20例；年齡32～61歲，平均年齡(39.12±5.42)歲；病程1～12年，平均(5.12±0.73)年；中醫癥候分型：脾腎陰虛型10例，脾腎陽虛型19例，脾腎陰陽兩虛型16例。治療組中，男23例，女22例；年齡30～65歲，平均年齡(40.00±5.51)歲；病程1～14年，平均(5.78±0.82)年；中醫證候分型：脾腎陰虛型12例，脾腎陽虛型18例，脾腎陰陽兩虛型15例。2組年齡、性別比、病程、中醫證候分型等一般資料比較差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1 2組一般資料比較 n=45

1.2 納入及排除標準

1.2.1 納入標準：①符合《血液病診斷及療效標準》制定的再生障礙性貧血診斷標準，且經臨床癥狀體征、血常規指標、骨髓涂片及病理學檢查確診為AA；②符合《中藥新藥臨床研究指導原則》制定的中醫辨證分型診斷標準；③入組前2周內未接受過激素、化療藥物治療者；④患者均自愿參加本研究，且簽署知情同意書。

1.2.2 排除標準：①合并PNH、白血病等其他血液系統疾??；②合并心、肝、肺、腎等重要臟器功能不全者；③妊娠或哺乳期女性；④對本研究藥物過敏或有禁忌證者。

1.3 治療方法 對照組給予環孢素A治療，口服，4 mg·kg-1·d-1，2次/d；同時根據病情給予抗感染、補血及止血藥物。治療組給予健脾補腎方治療，組成：黃芪 24 g，女貞子 15 g，太子參 24 g，白術芍 15 g，炒丹皮 15 g，制半夏 10g，小薊草 15 g，菟絲子 24 g，炒枳殼 10 g，炙甘草 6 g。1個月為1個療程，共治療2個療程。針對不同中醫辨證分型，健脾補腎方中分別配伍不同中藥，脾腎陰虛型可選擇滋陰生精的藥物，如生地黃、黃柏等；脾腎陽虛型可選擇填精助陽的藥物，如補骨脂、淫羊藿；脾腎陰陽兩虛型可選擇陰陽雙補的藥物，如杜仲、制首烏等。

1.4 觀察指標

1.4.1 骨髓增生程度、非造血細胞百分率：分別于治療前后采用骨髓圖像分析儀評價骨髓增生程度及非造血細胞百分率。根據成熟紅細胞與有核細胞百分率將骨髓增生程度分為活躍、減低、重度減低共3級。

1.4.2 骨髓組織骨髓組織微血管密度(MVD)、血管內皮生長因子(VEGF)表達：分別于治療前后抽取患者髂后上棘部位骨髓活檢標本，甲醛固定后石蠟包埋切片，采用免疫組化SP法判定MVD。低倍鏡下找出每張切片中3個血管最豐富區域，高倍鏡下計數MVD，共計數3次，取均值。VEGF主要定位于細胞漿(膜)中，以檢出棕褐色顆粒為VEGF陽性表達。高倍鏡下隨機選取5個視野，分別計數100個細胞，計算陽性細胞百分率，取均值。

1.4.3 骨髓基質細胞堿性成纖維細胞生長因子(bFGF)、Rho家庭成員A(Rho-A)、Ras相關的C3肉毒桿菌毒素底物(Rac)表達：采用Real time-PCR法測定骨髓基質細胞bFGF、Rho-A、Rac mRNA表達。按照TRizol說明書進行骨髓基質細胞總RNA的提取和逆轉錄，SYBR Green染料法進行目的基因擴增，根據RQ=2-ΔΔCt計算目的基因相對表達量。引物序列由上海生工生物工程有限公司合成。見表2。

表2 Real time-PCR引物序列

1.4.4 骨髓液bFGF、Rho-A、Rac水平：分別于治療前后抽取患者骨髓液3 ml，采用酶聯免疫吸附實驗(ELISA)測定bFGF、Rho-A、Rac水平。

2 結果

2.1 2組骨髓增生程度比較 治療前2組骨髓增生程度比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組骨髓增生程度均明顯好于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組骨髓增生程度好于對照組(P<0.05)。見表3。

2.2 2組非造血細胞百分率比較 治療前2組非造血細胞百分率比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組非造血細胞百分率均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組非造血細胞百分率低于對照組(P<0.05)。見表4。

表3 2組骨髓增生程度比較 n=45，例(%)

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

組別非造血細胞對照組 治療前62.79±8.43 治療后50.62±7.21?治療組 治療前63.48±9.05 治療后36.22±5.14?#

注：與治療前比較，*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.3 2組骨髓組織MVD、VEGF表達比較 治療前2組骨髓組織MVD、VEGF表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組骨髓組織MVD、VEGF表達均明顯高于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組MVD、VEGF表達高于對照組(P<0.05)。見表5。

組別MVDVEGF(%)對照組 治療前0.89±0.114.10±0.56 治療后1.25±0.16?5.99±0.63?治療組 治療前0.92±0.134.12±0.52 治療后1.47±0.20?#7.46±0.87?#

注：與治療前比較,*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

2.4 2組骨髓基質細胞bFGF、Rho-A、Rac表達比較 治療前2組骨髓基質細胞bFGF、Rho-A、Rac mRNA表達比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組骨髓基質細胞bFGF、Rho-A、Rac mRNA表達均明顯高于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組bFGF、Rho-A、Rac mRNA表達高于對照組(P<0.05)。見表6，圖1。

組別bFGF mRNARho-A mRNARac mRNA對照組 治療前1.02±0.160.67±0.080.74±0.11 治療后1.48±0.21?1.12±0.16?1.23±0.17?治療組 治療前1.05±0.180.69±0.100.72±0.10 治療后1.79±0.26?#1.57±0.23?#1.64±0.26?#

注：與治療前比較,*P<0.05；與對照組比較，#P<0.05

圖1 Real time-PCR測定bFGF、Rho-A、Rac mRNA表達

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

2.5 2組骨髓液bFGF、Rho-A、Rac水平比較 治療前2組骨髓液bFGF、Rho-A、Rac水平比較差異無統計學意義(P>0.05)。治療后2組骨髓液bFGF、Rho-A、Rac水平均明顯高于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組bFGF、Rho-A、Rac水平高于對照組(P<0.05)。見表7。

組別bFGF(ng/L) Rho-A(μg/L)Rac(μg/L)對照組 治療前28.62±4.052.33±0.351.38±0.21 治療后49.77±6.82?3.06±0.41?1.99±0.25?治療組 治療前30.21±4.132.30±0.321.42±0.18 治療后68.98±8.34?#4.15±0.54?#3.22±0.47?#

注：與治療前比較,*P<0.05;與對照組比較,#P<0.05

3 討論

AA是一種由于骨髓造血功能進行性衰竭而導致全血細胞減少和造血干細胞缺陷的臨床綜合征，該病病因尚不明確，且病程長，治療難度大，患者預后差。目前，AA的確切發病機制尚不清楚。研究顯示，造血細胞的增殖和分化有賴于造血微環境為其提供支持，其中多種細胞因子是造血過程中重要的免疫調節因子[7]。而AA患者存在造血微環境紊亂和細胞因子調節異常，這是AA發生發展的重要病理機制，并與骨髓造血衰竭嚴重程度呈正相關[7-9]。微血管通過為造血細胞的生長提供血供、氧供及其他營養物質在生理性造血過程中發揮關鍵作用。造血微環境的破壞引起骨髓血管生成減少、血管通透性降低及營養物質供應減少，從而造成骨髓造血組織萎縮，同時脂肪化增加，最終導致造血功能衰竭[10]。VEGF是已知作用最強的促血管生成因子，具有維持造血干細胞增殖、分化、更新及血管新生的作用，AA患者造血微環境中VEGF表達降低可能通過引起血管內皮細胞凋亡等多種途徑影響血管生成及造血干細胞生存[11]。bFGF是一類具有多種生理作用的細胞生長因子，其與表達在血管內皮細胞、成骨細胞表面的bFGFR結合后啟動信號級聯反應，能夠促進骨髓間充質干細胞增殖、分化、血管新生并增加血管通透性[12]。研究表明，Rho-GTP家族通過參與細胞骨架形成和黏附、調節干細胞發育等作用在維持骨髓微環境穩態中發揮重要作用，其中Rho-A、Rac是Rho-GTP家族的重要成員，Rho-A、Rac基因缺失直接導致細胞骨架形成減少，造血微環境紊亂及造血功能下降[13,14]。因此，MVD、VEGF、bFGF、Rho-A、Rac是反映骨髓造血微環境穩態的重要指標，對于判斷AA病情發展及預后至關重要。

近年來，以環孢素A為代表的免疫抑制劑已經成為治療AA的一線治療藥物，對骨髓造血具有顯著改善作用，但藥物產生的肝腎毒性對患者耐受性和預后均造成嚴重影響[15]。中醫將AA歸于“虛勞”、“血枯”范疇，認為AA久治不愈的原因在于脾腎虧虛引起氣血不足、血枯髓空，從而導致AA發病。因此，AA治療應以填髓生血，化生氣血為治療原則[16]。健脾補腎方主要根據AA脾腎虧虛的病機，方中諸藥合用能夠起到補腎填精、養血生髓的功效。現代藥理學研究發現，方中菟絲子、女貞子等多種成分具有改善骨髓微循環、調節免疫功能、增加骨髓網織紅細胞及血小板數量等作用，從而促進骨髓造血功能恢復。本研究前期應用健脾補腎方治療AA患者，療效優于單純西藥治療，但健脾補腎方發揮治療作用的可能機制尚未見報道。

本研究通過觀察骨髓增生程度、骨髓組織MVD、VEGF表達及相關細胞因子等指標變化，探討健脾補腎方治療AA的可能機制。結果表明，治療后兩組骨髓增生程度均明顯好于治療前，非造血細胞百分率均明顯低于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組以上指標改善程度優于對照組(P<0.05)，說明健脾補腎方較單純西藥治療能夠有效促進骨髓增生恢復正常。同時，治療后2組骨髓組織MVD、VEGF表達均明顯高于治療前，組間比較差異有統計學意義(P<0.05)，且治療組以上指標改善程度優于對照組(P<0.05)，提示骨髓血管生成減少及VEGF表達降低與AA發生發展密切相關，應用健脾補腎方治療AA能夠明顯促進骨髓血管新生，從而增強骨髓造血功能。此外，治療組治療后骨髓基質細胞bFGF、Rho-A、Rac表達及骨髓液bFGF、Rho-A、Rac水平均明顯高于對照組(P<0.05)，說明健脾補腎方通過調節骨髓基質細胞bFGF、Rho-A、Rac表達促進骨髓造血功能的恢復。

綜上所述，健脾補腎方治療再生障礙性貧血療效顯著，能夠有效促進骨髓增生，改善造血微環境，從而增強骨髓造血功能，其機制與上調骨髓基質細胞bFGF、Rho-A、Rac表達有關。