不同產地佛手的揮發油成分比較分析

趙永艷 張軍銀 彭騰 何沛煜 匡宇

摘 要 目的：比較不同產地佛手揮發油成分的差異。方法：采用水蒸氣蒸餾法提取10個不同產地佛手揮發油并計算得率;采用氣質聯用法分析不同產地佛手揮發油中化學成分;通過NIST 14.L數據庫進行化合物檢索并鑒別;采用峰面積歸一化法測定各化學成分的相對質量分數;采用SPSS 20.0軟件對樣品進行聚類分析。結果：10個不同產地佛手揮發油得率為0.10%～1.75%，其中以四川樂山市犍為縣樣品最高（1.75%）。不同產地佛手揮發油共鑒別出66個成分，相對分子量為126.20～392.66，以C10和C15化合物居多;相對分子量為136、154的同分異構體所占比例較大，主要為環烴基單萜烯類成分。不同產地佛手揮發油有12個共有成分，按相對質量分數由大到小依次為檸檬烯（24.90%）、萜品烯（14.71%）、（-）-4萜品醇（2.88%）、檸檬醛（2.33%）和α-沒藥烯（2.33%）、香葉醇（1.52%）、α-蒎烯（1.37%）、反式佛手柑油烯（1.16%）、異松油烯（1.13%）、棕櫚酸甲酯（1.12%）、芳樟醇（1.09%）、乙酸香葉酯（1.04%）;其中8個為單萜烯類成分，2個為倍半萜烯類成分，2個為酯類成分。不同產地佛手可聚為4類，即S2、S4、S6聚為一類，S1、S3、S7、S8聚為一類，S5、S10聚為一類，S9為一類。結論：不同產地佛手的揮發油成分存在一定的差異，同一成分的含量在不同產地佛手揮發油中也存有差異。

關鍵詞 佛手;揮發油;產地;氣質聯用法;成分

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To compare the difference of the components of volatile oil in Citrus medica from different producing areas. METHODS： The volatile oil of C. medica from 10 different producing areas was extracted with steam distillation， and the yield was calculated. The components of the volatile oil of C. medica from different producing areas were analyzed by GC-MS. The compounds were retrieved from NIST 14.L mass spectrum database and identified. Relative mass fraction of chemical component was determined by? peak area normalization method. Cluster analysis of samples were performed by using SPSS 20.0 software. RESULTS： The yields of volatile oil of C. medica from 10 different producing areas were 0.10%-1.75%， among which sample from Qianwei county in Leshan city of Sichuan province was the highest （1.75%）. A total of 66 components were identified in the volatile oil of C. medica from different producing areas， with a relative molecular weight of 126.20-392.66. The majority was C10 and C15 compounds; isomers with relative molecular weight of 136， 154 took up the great proportion， which were mainly cycloalkane monoterpenes. There were 12 common components in the volatile oil of C. medica from different areas， which were limonene（24.90%）， terpinene（14.71%）， （-）-4 terpineol（2.88%）， citral（2.33%）， α-myrrhene（2.33%）， geraniol（1.52%）， α-pinene（1.37%）， trans bergamot olene（1.16%）， isoterpinene（1.13%）， methyl palmitate（1.12%）， linalool（1.09%） and geranyl acetate（1.04%） according to relative mass fraction; 8 of them were monoterpenes， 2 were sesquiterpenes and 2 were esters. There were 4 categories of C. medica from different producing areas， i.e. S2， S4， S6 clustered into one; S1， S3， S7， S8 clustered into one; S5 and S10 clustered into one; S9 as one. CONCLUSIONS： There are some difference of the components in volatile oil of C. medica from different producing areas， and the content of the same component also has great difference in the volatile oil of C. medica from different producing areas.

KEYWORDS? ?Citrus medica; Volatile oil; Producing area; GC-MS; Component

佛手為蕓香科植物佛手（Citrus medica L. var. sarcodactylis Swingle）的干燥果實，其味辛、苦、酸，性溫，歸肝、脾 、胃、肺經，具有疏肝理氣、和胃止痛、燥濕化痰之功，可用于治療肝胃氣滯、胸脅脹痛、胃脘痞滿、食少嘔吐、咳嗽痰多等癥[1]，是一種藥食同源的中藥[2]。根據佛手產地的不同，可分為川佛手（四川產）、廣佛手（廣東產）、浙佛手（浙江產）、云佛手（云南產）和閩佛手（福建產）等[3]。近年來，佛手在全國各地進行了大面積的種植，但由于受氣候、土壤等因素的影響，其質量也存在一定差異[4]。有研究發現，佛手揮發油中的有效成分檸檬烯具有抗炎[5-6]、抗焦慮[7]、抑制細胞增殖[8-9]等作用;α-蒎烯具有抗抑郁[10]、抗炎[11]等作用;β-蒎烯具有抗抑郁[12]、抗菌[13]等作用;α-松油烯具有抗氧化的作用[14];γ-松油烯具有抗菌、抗氧化的作用[15];芳樟醇可抗癲癇[16-17]、抗焦慮[18]、鎮痛[19]等。目前，雖然有研究對不同產地佛手揮發油的含量和化學成分進行了比較研究[20-24]，但這些研究檢測的指標較少且缺乏對不同產地佛手揮發油共有成分的總結，具有一定的局限性。基于此，本研究采用水蒸氣蒸餾法提取不同產地的佛手揮發油，并對其得率進行比較;同時，采用氣質聯用法（GC-MS）比較了不同產地佛手揮發油的成分差異，并通過面積歸一化法計算其揮發油中共有成分的相對質量分數，旨在為其質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型GC-MS儀，包括5975C inert型惰性MS檢測器、7890A型GC系統、NIST 14.L數據庫（美國Agilent公司）;FA2004N型十萬分之一電子天平（成都市計量監督檢定測試院）;200T型多功能粉碎機（永康市鉑歐五金制品有限公司）;ZDHW型調溫電熱套（北京中興偉業儀器有限公司）;5 mL輕油型揮發油提取器（凌云實驗室裝備有限公司）。

1.2 藥材與試劑

10批佛手樣品（編號：S1～S10）均購自中藥材天地網，經成都中醫藥大學藥學院龍飛副教授鑒定為蕓香科植物佛手（C. medica L. var. sarcodactylis Swingle）的干燥果實，其樣品信息來源見表1。無水硫酸鈉、二氯甲烷、正己烷、氯化鈉均為分析純，水為蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 佛手揮發油的提取

按2015年版《中國藥典》（四部）通則2204“甲法”[25]提取佛手揮發油。將佛手樣品干燥后粉碎，過四號篩。稱取粉末100 g，置于圓底燒瓶中，加入水1 000 mL，浸潤30 min后用電熱套加熱，從第1滴冷凝水滴入油水分離器中開始計時，隨后向冷凝管中滴入二氯甲烷1 mL輔助提取，蒸餾提取8 h至揮發油不再增加。提取結束冷卻后將二氯甲烷層移出，水相加入氯化鈉至飽和，用少量二氯甲烷萃取3次，合并二氯甲烷層，經適量無水硫酸鈉脫水后，轉移至于棕色玻璃瓶中，于40 ℃下水浴除去二氯甲烷，即得佛手揮發油。

2.2 佛手揮發油得率的測定

按公式計算佛手揮發油得率（W）：W=m/M×100%[26]。式中，m為揮發油質量，M為藥材樣品質量。不同產地佛手揮發油得率見表2。由表2可知，四川樂山市犍為縣樣品（S2）的揮發油得率最高（1.75%），云南沐陽市樣品（S10）的揮發油得率最低（0.10%）;四川雅安市（S1）、重慶市石柱縣（S4）、深圳市寶安區（S6）、廣東韶關市（S7）和廣西賀州市（S8）的佛手揮發油得率均不低于0.50%，提示不同產地佛手揮發油的含量存在較大差異。

2.3 GC-MS檢測條件

2.3.1 GC條件 色譜柱：19091S-433-Agilent HP-5ms毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）;進樣溫度：280 ℃;載氣：氦氣;分流流量：50 mL/min;程序升溫：初始溫度60 ℃保持3 min，以10 ℃/min升至280 ℃并保持5 min;進樣口溫度：325 ℃;分流進樣，分流比：50 ∶ 1;進樣量：1 μL。

2.3.2 MS條件 離子源：電子轟擊離子源;離子源溫度：230 ℃;四極桿溫度：150 ℃;電子能量：70 eV;溶劑延遲時間：3 min;質量掃描范圍：質荷比（m/z）35～550。

2.4 供試品溶液的制備

取“2.1”項下10個不同產地佛手揮發油各0.1 mL，加正己烷定容至1 mL，經0.22 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液，用于GC-MS分析。

2.5 佛手揮發油成分分析

取“2.4”項下供試品溶液適量，按“2.3”項下檢測條件進樣測定，得總離子流圖（圖1）。根據GC-MS得到的質譜信息、相對保留時間，同時參考相關文獻[26-27]，經NIST 14.L數據庫進行檢索，并與數據庫中的標準圖譜進行對照。結果，不同產地佛手揮發油中，四川雅安市樣品（S1）共分離出92個成分，鑒別出35個;四川樂山市犍為縣樣品（S2）共分離出59個成分，鑒別出35個;四川成都市金堂縣樣品（S3）共分離出69個成分，鑒別出29個;重慶市石柱縣樣品（S4）共分離出92個成分，鑒別出51個;浙江金華市樣品（S5）共分離出81個成分，鑒別出35個;深圳市寶安區樣品（S6）共分離出58個成分，鑒別出36個;廣東韶關市樣品（S7）共分離出109個成分，鑒別出39個;廣西賀州市樣品（S8）共分離出92個，鑒別出37個;廣西桂林市樣品（S9）共分離出92個成分，鑒別出42全;云南沐陽市樣品（S10）共分離出73個，鑒別出34個。不同產地佛手揮發油中共鑒別出66個成分，其中單萜烯類成分24個、倍半萜烯類10個、二萜類2個、醇類2個、酮類2個、酯類11個、酚類3個、烷烴類2個、羧酸類1個、醚類2個、芳香烴1個、酚類3個、烷烴類3個。不同產地佛手的揮發油成分見表3。采用面積歸一化法計算其相對質量分數，結果見表4。

由表3可知，10個產地佛手揮發油中鑒別出的66種化學成分的相對分子量為126.20～392.66，以C10和C15化合物居多，相對分子量為136、154的同分異構體所占比例較大，主要為環烴基單萜烯類成分。

由表4可知，不同產地佛手揮發油中有12個共有成分，其平均相對質量分數由大到小依次為檸檬烯（24.90%）、萜品烯（14.71%）、（-）-4-萜品醇（2.88%）、檸檬醛（2.33%）和α-沒藥烯（2.33%）、香葉醇（1.52%）、α-蒎烯（1.37%）、反式佛手柑油烯（1.16%）、異松油烯（1.13%）、棕櫚酸甲酯（1.12%）、芳樟醇（1.09%）、乙酸香葉酯（1.04%）;其中8個為單萜烯類成分，2個為倍半萜烯類成分，2個為酯類成分。

2.6 聚類分析

以12個共有成分的相對質量分數為原始數據，采用SPSS 20.0軟件，以歐氏距離為測度對10個不同產地佛手進行聚類分析，結果見圖2。由圖2可知，10個不同產地的佛手可聚為4類：S2、S4、S6聚為一類，S1、S3、S7、S8聚為一類，S5、S10聚為一類，S9為一類。

3 討論

本研究結果顯示，10個不同產地佛手樣品中四川樂山市犍為縣樣品揮發油得率最高（1.75%），其次為重慶市石柱縣（1.00%）及深圳市寶安區（0.84%）樣品;其化學成分相對質量分數均以檸檬烯和萜品烯較高，其中以深圳市寶安區樣品揮發油中檸檬烯（33.28%）和萜品烯（22.23%）的相對質量分數最高。但此結果與部分已有研究不一致，如趙磊等[24]研究發現，佛手揮發油中的主要化學成分為檸檬烯、P-傘花烴、檸檬烯、松油烯;Leggio A等[27]研究表明，十六酸和亞油酸為佛手揮發油的主要成分，其中川佛手揮發油主要化學成分為檸檬酸和3-蒈烯;陳菲等[28]研究認為，D-檸檬烯、（+）-2-蒈烯為其主要成分;黃海波等[29]研究則認為，浙佛手揮發油的主要成分為檸檬烯和3-蒈烯，金佛手的主要成分為乙酸乙酯和油酸。筆者推測造成各研究間差異的原因可能與佛手采收時間、產地不同有關，但仍有待后續研究進一步探討。

本研究中，同一成分在不同產地佛手揮發油中的相對質量分數存在較大差異，有21個成分的相對質量分數>1.00%，其中12個為單萜烯類成分、3個為倍半萜類成分、3個為酯類成分、1個為芳香烴類成分、1個為醇類成分、1個為烯烴類成分。不同產地佛手揮發油的主要成分雖然基本一致，但也存在一定的差異。比如，四川樂山市犍為縣和重慶市石柱縣佛手揮發油中可檢測到甲基庚烯酮，其他產地樣品則未檢出;重慶市石柱縣佛手揮發油中可檢測到莰烯、（+）-反式檸檬酸、6-欖香烯，其他產地樣品則未檢出;重慶市石柱縣和廣西桂林市佛手揮發油中檢測到檸檬烯乙二醇，其他產地樣品則未檢出;廣西賀州市佛手揮發油中檢測到茴香腦，其他產地樣品則未檢出。其原因可能與其遺傳基因或生長的環境有關[4]。

佛手揮發油中的檸檬烯、γ-松油烯、α-蒎烯、佛手柑油烯是其香氣成分[29-30]，因此從佛手揮發油香氣方面，可以檸檬烯、α-蒎烯、異松油烯和反式佛手柑油烯的相對質量分數作為評價其質量的指標。結果顯示，以深圳市寶安區、重慶市石柱縣、四川樂山市犍為縣、四川雅安市佛手揮發油中上述4種成分的相對質量分數較高，但深圳市寶安區佛手揮發油中其他單萜烯類成分的相對質量分數也較高（因其他單萜烯類成分可降低佛手揮發油的香氣），這在一定程度上會降低揮發油的質量，由此筆者推測四川、重慶地區佛手揮發油在香氣方面的質量優于其他地區樣品。有研究報道，佛手揮發油中的檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、松油烯、芳樟醇等成分是其發揮藥理作用的主要成分[6，24]，因此從佛手揮發油藥理作用方面，可將上述5種成分作為評價其質量的指標。結果顯示，以深圳市寶安區佛手揮發油中檸檬烯、α-蒎烯、β-蒎烯、松油烯、芳樟醇的相對質量分數較高，由此筆者推測深圳市寶安區佛手揮發油在藥理作用方面的質量優于其他地區樣品。

聚類分析結果顯示，10個不同產地佛手可聚為4類：S2、S4、S6聚為一類，S1、S3、S7、S8聚為一類，S5、S10聚為一類，S9為一類。提示佛手的聚類結果與樣品產地距離遠近無關，但其原因有待進一步研究。

綜上所述，不同產地佛手的揮發油成分存在一定的差異，同一成分的含量在不同產地佛手揮發油中也存在差異。

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（收稿日期：2019-08-08 修回日期：2020-01-03）

（編輯：陳 宏）