千金子脂肪油自組裝膠束對4種千金子素在大鼠體內腸吸收的影響研究

袁曜暉 許晶晶 郭菲 張超 王英姿

摘 要 目的：研究不同千金子脂肪油用量的自組裝膠束對4種千金子素（千金子素L1、L2、L3、L8）在大鼠體內腸吸收的影響。方法：以千金子脂肪油（用量分別為0、0.2、0.4、1、4 g/L）和脫氧膽酸鈉為載體，過量加入4種千金子素（40 mg/L），制備包載4種千金子素的自組裝膠束溶液，作為含藥腸灌流液。取大鼠60只，建立在體單向腸灌流模型，按不同千金子脂肪油用量的含藥腸灌流液分組進行不同腸段（十二指腸、空腸、回腸、結腸）的灌流實驗。采用高效液相色譜法測定灌流前后腸灌流液中4種千金子素的含量;計算在不同腸段中4種千金子素的吸收速率常數（Ka）和小腸表觀吸收系數（Peff）;選擇吸收效果較好的回腸段為對象，考察并計算4種千金子素的累積吸收量。結果：不同千金子脂肪油用量的自組裝膠束均能使4種千金子素在各腸段的Ka值和Peff值呈現不同程度的升高。當千金子脂肪油用量為0.4 g/L時，4種千金子素在各腸段均呈現最大吸收，且與不含脂肪油組比較其Peff值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。按不同脂肪油用量組各腸段的Ka、Peff值排序，4種千金子素在各腸段的吸收效果總體上呈現空腸最好、結腸最差的趨勢。與不含脂肪油組比較，千金子脂肪油用量為0.2～4 g/L時，4種千金子素在大鼠回腸的累積吸收量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且以0.4 g/L脂肪油用量組為最高。結論：不同用量千金子脂肪油與脫氧膽酸鹽形成的自組裝膠束能不同程度地增加千金子素L1、L2、L3、L8在大鼠各腸段的吸收量，且空腸為上述千金子素的主要吸收腸段。

關鍵詞 千金子脂肪油;千金子素;自組裝膠束;大鼠;腸吸收

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of different amounts of Euphorbiae Semen fatty oil in self-assembly micelles on intestinal absorption of 4 kinds of euphorbia （euphorbia L1， L2， L3， L8） in rats. METHODS： The self-assembled micelle solution containing 4 kinds of euphorbia was prepared by adding 4 kinds of euphorbia （40 mg/L） in excess， using the fatty oil of Euphorbia Semen （0.2， 0.4， 1， 4 g/L） and sodium deoxycholate as carriers. Totally 60 rats were collected to establish in-situ one-way intestinal perfusion model. Different intestinal segments （duodenum， jejunum， ileum， colon） were perfused with drug-containing intestinal perfusion fluid according to different dosage of Euphorbiae Semen fatty oil. HPLC method was adopted to determine the contents of 4 kinds of euphorbia in the intestinal perfusate before and after perfusion. The absorption rate constant （Ka） and apparent absorption coefficient （Peff） of 4 kinds of euphorbia in different intestinal segments were calculated. The ileum segment with better absorption was selected as the object to investigate and calculate the accumulative absorption of 4 kinds of euphorbia. RESULTS： The self-assembled micelles formed by different concentrations of fatty oil of Euphorbiae Semen could significantly increase the absorption of 4 kinds of euphorbia in different intestinal segments to different extents. When the dosage of Euphorbiae Semen fatty oil was 0.4 g/L， the intestinal absorption effect of 4 kinds of euphorbia were all the best; the Peff was significantly increased， compared with no fat oil group （P<0.05 or P<0.01）. According to the order of Ka and Peff of each intestinal segment in different fatty oil dosage groups， the absorption effect of 4 kinds of euphorbia in each intestinal segment was the best in jejunum and the worst in colon. Compared with no fatty oil group， when the amount of Euphorbiae Semen fatty oil was 0.2-4 g/L， accumulative amount of 4 kinds of euphorbia in the ileum of rats increased significantly （P<0.05 or P<0.01）， and the highest in 0.4 g/L Euphorbiae Semen fatty oil group. CONCLUSIONS： The self-assembly micelles composed of Euphorbiae Semen fatty oil and deoxycholate can increase the absorption of euphorbia L1， L2， L3， L8 in each intestinal segment to different extent， and the jejunum is the main absorption segment.

KEYWORDS? ?Euphorbiae Semen fatty oil; Euphorbia; Self-assembled micelle; Rat; Intestinal absorption

千金子為大戟科植物續隨子（Euphorbia lathyris L.）的干燥成熟種子，主要含有脂肪油和二萜醇酯類成分（如千金子素）[1]。千金子素L1、L2、L3、L8的母核結構均為千金二萜烷型[2]（見圖1）。其中，千金子素L1、L2具有瀉下作用[1]和抗白血病作用[3-4];千金子素L1、L2、L3、L8具有逆轉腫瘤多藥耐藥的作用[5-6]。這些二萜醇酯類成分發揮生理活性的同時還表現出對胃腸黏膜的強烈刺激性[7]和細胞毒性[8]。千金子歷代炮制方法以去油制霜法為主，即藥材經適當加熱去除部分脂肪油而制成松散粉末，從而達到降低毒性、緩和藥性的目的[9]。有研究認為，對千金子進行去油制霜可除去部分二萜醇酯類成分，從而達到“減量去毒”的目的[8，10-11]。但本課題組在前期急性毒性實驗中發現，分別單獨給予千金子素L1、L3后未引起小鼠死亡;但在同等劑量下，兩者分別與千金子脂肪油同時應用卻可導致小鼠死亡，表現出毒性的增加[12]。由此推斷，千金子的毒性亦與其所含的脂肪油成分有關。千金子脂肪油主要包括脂肪酸及其酯類，其中含量較高的化合物為十八碳-6-烯酸（73.070%）、丙二醇單油酸酯（10.902%）、棕櫚酸（6.301%）等[13]。脂肪油中的脂肪酸酯類成分具有脂肪長鏈，可與體內的膽酸鹽共同作用自組裝形成膠束，而該自組裝膠束可作為千金子二萜醇酯類化合物的載體，增加千金子中該類化合物的溶解度以及體內吸收，從而增加了千金子的毒性[12]。基于此，本研究通過建立大鼠在體腸灌流模型，考察4種千金子素（即千金子素L1、L2、L3、L8）在十二指腸、空腸、回腸、結腸中的藥物吸收速率常數（Ka）和小腸表觀吸收系數（Peff）值，以及其在吸收較好腸段的累積吸收量，旨在明確千金子脂肪油與脫氧膽酸鈉所形成的自組裝膠束對4種千金子素腸吸收的影響，從藥劑學的角度進一步探討千金子去油制霜炮制方法可能的減毒機制。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A型高效液相色譜儀（日本Shimadzu公司）;KQ-250E型醫用超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）;pHS-3C型精密pH計（上海雷磁儀器股份有限公司）;AE240型電子分析天平（瑞士Mettler Toledo公司）; CT15RT型高速低溫離心機[天美（中國）科學儀器有限公司];BT600FJ型蠕動泵（保定創銳精密泵業有限公司）。

1.2 藥品與試劑

千金子素L1、L2、L3、L8單體化合物（本課題組自制，由千金子的石油醚部位經反復硅膠柱層析分離得到;經高效液相色譜法測定、面積歸一化法計算，其純度均大于98.0%[14]）;千金子脂肪油（本課題組自制，取自千金子石油醚部位經硅膠柱層析所得最初的流分，其主要為脂肪酸[13]）;脫氧膽酸鈉（批號：20160626）、磷酸二氫鈉（批號：20150522）、氫氧化鈉（批號：20171110）、氯化鈉（批號：20151207）、氯化鉀（批號：20150618）、碳酸氫鈉（批號：20171116）、六水合氯化鎂（批號：20150526）、葡萄糖（批號：20160615）、氯化鈣（批號：20150119）均購自國藥集團化學試劑有限公司;氯化鈉注射液（石家莊鵬海制藥有限公司，批號：1605302105，規格：500 mL ∶ 4.5 g;用作生理鹽水）;甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為高純水。

1.3 動物

健康Wistar大鼠，雌性，體質量（250±20）g，由山東省朋悅實驗動物有限公司提供，動物生產合格證號：SCXK（魯）20140007。動物均適應性飼養1周后進行實驗。

2 方法

2.1 溶液制備

2.1.1 Krebs-Ringers（K-R）緩沖液 稱取氯化鈉 7.8 g、氯化鉀 0.35 g、碳酸氫鈉1.37 g、磷酸二氫鈉 0.32 g、六水合氯化鎂 0.02 g、葡萄糖1.4 g，加入適量水溶解;另稱取氯化鈣 0.37 g，加適量水溶解;將上述溶液混勻，加水定容至1 L，即得pH 7.4的K-R緩沖液。

2.1.2 包載4種千金子素的自組裝膠束溶液 根據前期研究成果[12]，制備不同千金子脂肪油用量的包載千金子素自組裝膠束溶液。分別稱取相應量的千金子脂肪油和千金子素 L1、L2、L3、L8單體化合物置于圓底燒瓶中，加乙酸乙酯適量使溶解，水浴旋轉蒸發并真空干燥除去有機溶劑，制成脂膜;加入4.96 g/L脫氧膽酸鈉溶液[以pH 7.4 的磷酸鹽緩沖液（PBS）為溶劑制備]適量，水浴下超聲處理;離心，以 0.22 μm 微孔濾膜濾過，即得澄清透明的膠束溶液。在制備過程中，4種千金子素均過量加入（40 mg/L），在離心、膜濾過環節均可除去未被膠束增溶的游離千金子素。按照千金子脂肪油的不同用量（脂肪油在自組裝膠束溶液中質量濃度分別為0、0.2、0.4、1、4 g/L[12]），將所制備的自組裝膠束溶液依次作為不同千金子脂肪油用量組的含藥腸灌流液。

2.2 在體單向腸灌流實驗

大鼠禁食不禁飲18 h后，腹腔注射10%水合氯醛（3 mL/kg）麻醉，背位固定于手術臺上，從腹中線劍突下2 cm打開腹腔，分離不同部位腸段，即十二指腸段（自幽門上行1 cm處起往下10 cm止）、空腸段（自幽門上行15 cm起往下10 cm止）、回腸段（自盲腸上行20 cm起往下10 cm止）、結腸段（自盲腸下行1 cm起往下10 cm止）。在各部位腸段的兩端處各剪一個V 型小口，將硅膠管小心插入并結扎（注意避免傷及血管），將其擺至合適形狀使灌流液能流通順暢為宜，然后用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋傷口保濕，同時以紅外燈保溫，進行灌流實驗。

取大鼠60只，按“2.1”項下不同千金子脂肪油用量的含藥自組裝膠束腸灌流液分為5組，每組12只大鼠，每2只大鼠作為一個小組，每一小組分別測定其中2個腸段，將小組測定數據合并為一組完整的4個腸段測定數據（n=6）。用37 ℃預熱的生理鹽水從大鼠腸段上端開口輕緩沖洗腸道（方向勿反），直至將腸內容物沖洗干凈，再通空氣排凈生理鹽水，接著用37 ℃預熱的K-R緩沖液進行在體單向灌流（灌流方向同腸道內容物沖洗方向一致），以建立灌流體系;然后將“2.1.2”項下不同組別的含藥腸灌流液以1 mL/min的速度灌流2 min，使其充滿腸段，再以0.2 mL/min平衡約45 min。平衡結束后，在每段腸段的進口處放置已稱定質量的小瓶（裝有10 mL含藥腸灌流液）用以進液，出口處放置已稱定質量的小瓶用以收集流出液。在進口處硅膠管插入灌流液小瓶的同時，將出口處的硅膠管插入收集液小瓶。保持0.2 mL/min的流速不變，從出口端硅膠管流出第一滴液體時開始計時，每隔20 min迅速更換下一組進出口處的小瓶，共持續收集120 min。待流出液放冷至室溫后，稱量各灌流液小瓶和流出液小瓶的質量，并計算灌入和流出的腸灌流液質量。實驗結束后，將相應實驗腸段剪下，沿腸管剪開，平鋪于坐標紙上，測量小腸內徑與長度。

2.3 腸灌流液中4種千金子素的含量測定

2.3.1 混合對照品溶液的制備 取千金子素L1、L2、L3、L8單體化合物各適量，精密稱定，置同一5 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得質量濃度分別為544、530、556、568 mg/L的混合對照品溶液。

2.3.2 供試品溶液的制備 “2.2”項下灌流實驗結束后，取各灌流液小瓶和收集液小瓶中的液體置于分液漏斗中，以乙酸乙酯提取3次，每次10 mL;合并提取液，水浴蒸干，殘渣以甲醇溶解并定容至2 mL量瓶中，搖勻，即得。

2.3.3 空白溶液的制備 按“2.2”項下方法建立大鼠在體單向灌流模型，以K-R緩沖液代替含藥腸灌流液進行灌流實驗，收集流出液作為空白腸灌流液，按“2.3.2”項下方法制備空白溶液。

2.3.4 色譜條件 色譜柱：Inertsil ODS-3（250 mm×4.6 mm，5 μm）;柱溫：25 ℃;流動相：甲醇-水（82 ∶ 18，V/V）;流速：1.0 mL/min;檢測波長：275 nm;進樣量：20 μL。

2.3.5 含量測定方法學考察 參照前期研究[12]進行4種千金子素含量測定的方法學考察。取“2.3.1”～“2.3.3”項下混合對照品溶液、供試品溶液（0.2 g/L脂肪油組第20 min取樣液）和空白溶液，按“2.3.4”項下色譜條件進樣，記錄色譜圖，見圖2。結果，空白腸灌流液不干擾4種千金子素成分的測定（圖2）;千金子素L1、L2、L3、L8檢測質量濃度的線性范圍分別為1.088～87.04 mg/L（r=0.999 7）、1.06～84.8 mg/L（r=0.999 8）、1.112～88.96 mg/L（r=0.999 7）、1.136～90.88 mg/L（r=0.999 7）;精密度、穩定性、重復性試驗的RSD均小于3%（n=6）;加樣回收率分別為（101.27±2.15）%、（98.70±1.81）%、（97.77±1.34）%、（102.38±1.58）%，RSD均小于2.5%（n=6）。

2.3.6 灌流實驗過程中4種千金子素的穩定性考察 根據前期預試驗結果，選取脂肪油用量為0.2 g/L的自組裝膠束溶液，共5份，分別于37 ℃保溫0、1、2、3、4 h時，經0.22 μm微孔濾膜濾過后，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.3.3”項下色譜條件進樣測定并按標準曲線法計算4種千金子素的含量，考察在37 ℃腸灌流過程中自組裝膠束及其中成分的穩定性。結果，自組裝膠束的性狀穩定，未見絮凝或沉淀等現象;4種千金子素在不同時間點間的含量RSD均小于2.5%（n=5），見表1。這表明，自組裝膠束及其中的4種千金子素成分在37 ℃條件下進行腸灌流4 h過程中穩定性良好。

2.3.7 樣品含量測定 “2.2”項下灌流實驗結束后，分別取不同組別含藥腸灌流液的灌流液和流出液，按“2.3.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.3.3”項下色譜條件進樣分析，以標準曲線法計算含量。

2.4 數據處理

根據“2.3”項下測定結果，按下列公式計算4種千金子素的Ka值（min-1）和Peff值（cm/min）：Ka=（1-coutVout/cinVin）·Qin/V;Peff=-Qin·ln（coutVout/cinVin）/A。式中，cin和cout分別為該腸段灌流液和流出液中待測成分的質量濃度（mg/L）;Vin和Vout分別為該腸段灌流液的灌流液和流出液體積（mL，均以液體質量表示）;Qin為灌流速度（mL/min）;V為該灌流腸段的體積（cm3），V=πR2L[R為該腸段半徑（cm），L為該腸段的長度（cm）];A為該灌流腸段的表面積（cm2），A=2πRL。其中，灌流液的流入與流出體積按重量法[15]進行校正，即假設進出口的灌流液密度一樣，則灌流液和流出液的質量可分別表示灌流液和流出液的體積。此外，按以下公式計算4種千金子素各個時間點的吸收量（Q）：Q=cinVin-coutVout;將各個時間點某腸段的吸收量累加，即為千金子素的累積吸收量。

采用SPSS 17.0軟件進行統計處理，實驗數據以x±s表示，各組間數據比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA）。P<0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 不同千金子脂肪油用量對4種千金子素在大鼠各腸段中吸收情況的影響

120 min的在體灌流過程中，4種千金子素在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸處吸收的Ka值和Peff值測定結果見表2。由表2可見，不同千金子脂肪油用量的自組裝膠束均能使4種千金子素在各腸段的Ka值和Peff值呈現不同程度的升高。當千金子脂肪油用量為0.4 g/L時，4種千金子素在各腸段均呈現最大吸收，且與不含脂肪油組（0 g/L，下同）比較，其Peff值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;與不含脂肪油組比較，除千金子素L1在十二指腸段以及千金子素L2、L3在空腸段中的Ka值差異無統計學意義（P>0.05）之外，不同千金子脂肪油用量組中4種千金子素在各腸段的Ka值均顯著升高（P<0.05或P<0.01）。按不同脂肪油用量組各腸段的Ka、Peff值排序：當千金子脂肪油用量為0.2 g/L時，千金子素L1、L2、L3的Ka、Peff值在空腸處均為最高，千金子素L8的Ka、Peff值在回腸處均為最高，4種千金子素的Ka、Peff值在結腸處均為最低（除千金子素L2的Peff值在回腸處最低外）;當千金子脂肪油用量為0.4 g/L時，千金子素L1、L2的Ka、Peff值在空腸處均為最高，千金子素L3、L8的Ka、Peff值在回腸處均為最高，4種千金子素的Ka、Peff值在結腸處均為最低（除千金子素L1、L2的Peff值在十二指腸處為最低外）;當千金子脂肪油用量為1 g/L時，千金子素L1、L2、L3的Ka、Peff值在空腸處均為最高，千金子素L8的Ka、Peff值在回腸處均為最高，4種千金子素的Ka、Peff值在結腸處均為最低;當千金子脂肪油用量為4 g/L時，4種千金子素的Ka、Peff值在空腸處均為最高（除千金子素L8的Ka值在回腸處最高外），在結腸處均為最低（除千金子素L2的Peff值在回腸處為最低外）。4種千金子素在各腸段的吸收效果總體上呈現空腸最好、結腸最差的趨勢。

3.2 不同千金子脂肪油用量對4種千金子素在大鼠回腸段累積吸收量的影響

由表2可見，不同千金子脂肪油用量組中4種千金子素在空腸段吸收均最好;但與不含脂肪油組比較，其余脂肪油用量組中4種千金子素在空腸處的Ka值差異大部分無統計學意義（P>0.05），難以比較不同脂肪油用量條件下的吸收差異。因此，選擇吸收較好的回腸段[與不含脂肪油組比較，其他脂肪油用量組的Ka值和Peff值差異均有統計學意義（P<0.01）]進行累積吸收量計算。結果顯示，與不含脂肪油組比較，千金子脂肪油用量為0.2～4 g/L時，4種千金子素在大鼠回腸處的累積吸收量均顯著升高（P<0.05或P<0.01），且以0.4 g/L脂肪油用量組為最高，詳見表3。

4 討論

千金子素L1、L2、L3、L8均為千金二萜烷型二萜醇酯類化合物，含有多個酯鍵，極性較小，采用ACD/ChemSketch 10.0軟件計算千4種千金子素的疏水常數分別為5.55±0.53、8.61±0.45、7.25±0.42、5.56±0.43，進一步證實了這4種千金子二萜醇酯類化合物的極性非常小[12]。由此可見，這4種千金子素屬于低溶解度、高滲透性的化合物，故溶解度是其在體吸收速度的關鍵因素。例如千金子素L3腸吸收很差，大鼠口服給藥后，超過50%的原型藥物隨糞便排出體外[16]。有研究證實，脂肪酸能夠參與并促進膠束的形成而提高藥物的溶解度，從而增加藥物的體內吸收，例如硬脂酸、棕櫚酸、油酸能促進淫羊藿活性黃酮自組裝膠束的形成[17]，油酸及其單甘油酸酯與膽酸鹽、磷脂組成的混合膠束系統能顯著提高姜黃素的溶解度[18]，長鏈多不飽和脂肪酸負載的納米膠束體系可促進多烯紫杉醇的腸吸收[19]等。本課題組前期研究證實，人體胃腸道中存在的膽酸鹽可與千金子脂肪油在胃腸蠕動的剪切作用下形成膠束或乳滴，從而增加4種千金子素的溶解度[12]。這在一定程度上可以解釋千金子脂肪油與千金子素同用增大毒性致小鼠死亡的現象。

本研究考察了不同千金子脂肪油用量的自組裝膠束中4種千金子素在大鼠十二指腸、空腸、回腸、結腸等4個腸段中的Ka、Peff值及其在吸收較好腸段中的累積吸收量。結果顯示，當千金子脂肪油用量為0.4 g/L時，4種千金子素的腸吸收效果最好，與不含脂肪油組比較，大多數結果差異均有統計學意義，表明0.4 g/L的脂肪油對4種千金子素的增溶效果最明顯。當千金子脂肪油用量為0.2、1 g/L時，對4種千金子素亦有較好的促進吸收作用，與不含脂肪油組比較其大多數結果差異也有統計學意義;但當脂肪油用量為4 g/L時，4種千金子素的Ka值和Peff值雖較之于不含脂肪油組稍有升高，但大部分結果差異均無統計學意義。根據前期研究結果，筆者分析其原因可能是過量的千金子脂肪油與脫氧膽酸鈉的結合率下降，導致剩余的千金子脂肪油在水溶液中析出，進而導致膠束中千金子素析出、含量下降[12]。結合前期研究和本研究結果可知，千金子脂肪油對4種千金子素的的增溶作用越明顯，后者的腸吸收效果越好（即Ka值和Peff值越高）。由此可見，在本試驗劑量范圍內，4種千金子素腸吸收速率相關常數與其在膠束中的濃度呈正相關趨勢，即其腸吸收行為具有濃度依賴趨勢，故推測4種千金子素的腸吸收過程主要為被動轉運。這與文獻報道的千金子素L3的腸吸收以被動轉運為主[20]的結論一致。在脫氧膽酸鈉和千金子脂肪油形成的膠束中，4種千金子素在大鼠空腸段吸收效果最好，在結腸段吸收效果最差，這與文獻報道的千金子素L3主要吸收部位為結腸[21]不一致，推測與兩項研究中腸灌流實驗的千金子素供試品溶液的溶劑組成不同有關。另對回腸累計吸收量測定后結果顯示，與不含脂肪油組比較，當脂肪油用量為0.2～4 g/L時，4種千金子素的累計吸收量均顯著升高，且以4 g/L用量組最高，這與Ka、Peff趨勢相似。

綜上所述，不同用量的千金子脂肪油與脫氧膽酸鹽組成的膠束能不同程度地增加千金子素L1、L2、L3、L8在大鼠各腸段的吸收量，且空腸為上述千金子素的主要吸收腸段。這可能是千金子脂肪油的存在會增加千金子毒性的原因之一。但關于千金子去油制霜的具體減毒機制還有待后續進一步研究。

參考文獻

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