蒿甲醚自微乳化給藥系統對小鼠人腦膠質瘤皮下移植瘤的抑瘤作用研究

張亞紅 王麗娟 林鳳云 蘭作平 甘淋玲

摘 要 目的：研究蒿甲醚（ARM）自微乳化給藥系統（SMEDDS）對人腦膠質瘤皮下移植瘤模型小鼠的抑瘤效果。方法：以人腦膠質細胞瘤細胞株SHG44接種，并以組織塊移植傳代，建立裸小鼠皮下移植瘤模型。分別于接種后的第5、10、15、20、25天時測量小鼠腫瘤組織體積，繪制腫瘤生長曲線，確定腫瘤快速增殖初期。取裸小鼠30只，同法建立皮下移植瘤模型，并于腫瘤快速增殖初期時分為對照組（生理鹽水）、ARM混懸液組[60 mg/（kg·d）]和ARM-SMEDDS低、中、高劑量組[10、20、30 mg/（kg·d）]并灌胃給予生理鹽水或相應藥液，每日1次，連續給藥30 d。記錄小鼠體質量變化及一般情況，測定腫瘤組織體積變化并計算相對腫瘤增殖率。結果：皮下移植腫瘤塊組織后第10天左右即進入腫瘤快速增殖初期。給藥期間各組小鼠一般情況正常，未見明顯異常反應。自給藥第10天起，ARM-SMEDDS各劑量組小鼠的腫瘤組織體積均較對照組顯著縮小（P<0.05）;自給藥第15天起，ARM-SMEDDS各劑量組小鼠的腫瘤組織體積均較ARM混懸液組顯著縮小（P<0.05）。末次給藥后，ARM-SMEDDS各劑量組小鼠的相對腫瘤增殖率均較ARM混懸液組均顯著降低（P<0.05）。結論：ARM-SMEDDS具有明顯的抑制人腦膠質瘤增長的效果，抑瘤效果優于劑量更高的ARM混懸液劑型。

關鍵詞 蒿甲醚;自微乳化給藥系統;人腦膠質瘤細胞;皮下移植瘤;小鼠;抑瘤作用

Study on Anti-tumor Effects of Artemether Self-microemulsifying Drug Delivery System on Subcutaneous Transplantation of Human Glioma in Mice

ZHANG Yahong，WANG Lijuan，LIN Fengyun，LAN Zuoping，GAN Linling（School of Pharmacy， Chongqing Medical and Pharmaceutical College & Chongqing Engineering Research Center of Pharmaceutical Sciences， Chongqing 401331， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the anti-tumor effect of artemether （ARM） self-microemulsifying drug delivery system （SMEDDS） on human glioma subcutaneously transplanted model mice. METHODS： Human glioma cell line SHG44 was inoculated and passed on to establish subcutaneous transplanted tumor model of nude mice. At the 5th， 10th， 15th， 20th and 25th day after inoculation， the tumor tissue volume was measured and the growth curve was drawn to confirm the initial stage of rapid tumor proliferation. Thirty nude mice was collected to establish subeutaneously transplanted tumor nude model， and then divided into control group （normal saline）， ARM suspension group [60 mg/（kg·d）]， ARM-SMEDDS low-dose， medium-dose and high-dose groups [10， 20， 30 mg/（kg·d）] at the initial stage of rapid tumor proliferation. They were given normal saline and relevant solution intragastrically once a day， for consecutive 30 d. The weight change and general sibuation of mice were recorded. The change of tumor volume was determined and relative tumor proliferation rate was calculated. RESULTS： The subcutaneously transplanted tumor tissue entered the initial stage of rapid tumor proliferation from the 10th day after transplantation. The general situation was normal， and there was no obvious abnormal reaction in mice of each group during treatment.? Since 10th day of administration， tumor tissue volume of mice in ARM-SMEDDS groups were shortened significantly than control group （P<0.05）. At 15th day of administration， tumor volume of mice in ARM-SMEDDS groups were shortened significantly than ARM suspension group （P<0.05）. After last administration， relative tumor proliferation rates of mice in ARM-SMEDDS groups were decreased significantly， compared with ARM suspension group （P<0.05）. CONCLUSIONS： ARM-SMEDDS show significant inhibitory effect on the proliferation of human glioma， and are better than suspension with higher dosage.

KEYWORDS? ?Artemether;Self-microemulsifying drug delivery system;Human glioma cells;Subcutaneous transplanted tumor; Mice; Anti-tumor effect

腦膠質瘤是中樞神經系統最常見的顱內惡性腫瘤，每10萬人中約有10～20人患病，其發病率約占惡性腫瘤的1%～3%;在所有膠質細胞瘤患者中，膠質母細胞瘤患者1年生存率約為30%，但5年生存率不足5%[1]。目前，手術、放射和藥物治療等仍是腦膠質瘤最主要的治療方法，但由于神經膠質瘤的特殊性、耐藥性及血腦屏障等因素，傳統的化療藥物如卡莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀等的治療效果均不理想[1-2]，而新型化療藥物如福莫司汀、替莫唑胺等價格較貴、副作用較大，所以進一步尋找新的安全性更好、價格更易于被患者接受的化療藥物迫在眉睫[1，3]。

青蒿素是一種含有過氧基團的倍半萜內酯類化合物，是臨床上常用抗瘧藥物，主要從我國菊科艾屬植物黃花蒿（Artemisia annual L.）中提取而來。青蒿素及其衍生物因具有高效、低毒、強抗瘧性等特點，被世界衛生組織批準為治療腦型瘧疾和惡性瘧疾的首選藥物[4]。既往研究指出，青蒿素類化合物對腦膠質瘤細胞有較強的抑制、殺傷作用，呈現明顯的劑量關系，而且對正常細胞的損傷很小[5-6]。蒿甲醚（Artemether，ARM）是青蒿素的一個重要衍生物，是通過青蒿素加氫還原生成雙氫青蒿素后再醚化形成的化合物，目前被作為抗瘧疾藥物而廣泛應用于臨床;研究發現，ARM具有抗腫瘤的效果，并可以通過血腦屏障進入中樞神經系統[7-8]。但ARM水溶性差、體內代謝快，其在生物體內生物利用度較低，在大鼠的口服生物利用度僅約20%[9-10]。因此，本課題組前期自主研制出了ARM的自微乳化系統（Self-microemulsifying drug delivery system，SMEDDS），其口服生物利用度為ARM混懸液的16～18倍，可有效提高ARM的體內生物利用度，并延長其作用時間[11-12]。本研究在此基礎上建立皮下人腦膠質瘤裸小鼠模型，旨在對ARM-SMEDDS的抑瘤效果進行評價。

1 材料

1.1 儀器

Quattro Premier XE MircoMass-2695型液壓聯用儀（美國Waters公司）;ST-BE1100型混旋儀（臺灣斯特儀器設備有限公司）;移液器（北京長風儀器儀表公司）;CPA225D型電子天平（德國 Sartorius公司）;NDK200-1型氮吹儀（上海泉島科貿有限公司）;TGL-12型臺式離心機（常州市凱航儀器有限公司）;AIRTECH SW-CJ-1FD型超凈工作臺、NAPCO6500型CO2細胞培養箱（意大利Jouan公司）;游標卡尺（天津桂量量具刃具有限公司）。

1.2 藥品與試劑

ARM對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號：100271-201003，純度：99.8%）;ARM原料藥（重慶華立武陵山制藥有限公司，批號：20110504，純度：≥98%）;Lauroglycol 90、Gelucire 44/14（法國 Gattefosse 公司）;Cremophor RH 40（德國 BASF公司）;DMEM培養基（美國Gibco公司）;小牛血清（上海士鋒生物科技有限公司）;胰蛋白酶（上海古朵生物科技有限公司）;0.9%氯化鈉注射液（四川科倫藥業股份有限公司，作生理鹽水用）;pH 7.2磷酸鹽緩沖液（PBS，美國Thermo Fisher Scienrific公司）;其余試劑均為國產分析純，水為去離子水。

1.3 細胞

人腦膠質細胞瘤細胞株SHG44購自上海艾研生物科技有限公司，已傳至第52代。

1.4 動物

SPF級Balb/c系裸小鼠，6～8周齡，雌雄兼用，體質量為20～25 g，購自廣東省醫學實驗動物中心，生產許可證號：SCXK（粵）2013-0002。動物在室內溫度 20～26 ℃、濕度 40%～70%條件下飼養，自由飲食（飼料由廣東省醫學實驗動物中心提供）。

2 方法

2.1 ARM-SMEDDS的制備

按本課題組自主研制方法制備ARM-SMEDDS[11]：以 Lauroglycol 90為油相、Cremophor RH 40 為乳化劑、Gelucire 44/14為助乳化劑，按質量比為4 ∶ 4 ∶ 2制備而得。經HPLC法[11]測得ARM的載藥量為 80 mg/g。

2.2 小鼠皮下移植瘤模型的制備

取人腦膠質細胞瘤細胞株SHG44，經0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS洗滌，計數，以無血清的DMEM培養基配制成4×106個/mL的單細胞懸液。取上述細胞懸液0.5 mL，接種于裸小鼠右腋皮下，待腫瘤形成后以組織塊移植傳代。按照文獻方法[13-14]，選擇傳代后2周左右且腫瘤生長良好的荷瘤裸小鼠處死，取出腫瘤組織并剪碎，采用穿刺針將大小為2 mm3的腫瘤組織植入裸小鼠右腋部，以建立裸小鼠皮下移植瘤模型。

2.3 皮下移植瘤模型小鼠腫瘤生長曲線的繪制

取按“2.2”項下方法建立皮下移植瘤模型的小鼠12只，按照SPF級標準飼養于NASA1000級生物凈化室內，分別于接種后的第5、10、15、20、25天時測量小鼠體質量及其皮下腫瘤組織的最短徑（a）和最長徑（b），按公式計算腫瘤組織體積（V=a2×b/2）。以接種天數為橫坐標、腫瘤組織體積為縱坐標繪制腫瘤生長曲線，以腫瘤生長曲線斜率出現明顯增大的時間段作為腫瘤快速增殖初期。

2.4 ARM-SMEDDS對皮下移植瘤模型小鼠的抑瘤效果考察

根據“2.3”項下建立的腫瘤生長曲線，取小鼠30只，按“2.2”項下方法建立皮下移植瘤模型，并于腫瘤快速增殖初期時進行分組試驗。參考已有文獻的給藥劑量[15]，本試驗將皮下移植瘤模型小鼠分為對照組（生理鹽水）、ARM混懸液組[60 mg/（kg·d），生理鹽水配制，劑量以主藥計]和ARM-SMEDDS低、中、高劑量組[10、20、30 mg/（kg·d），劑量以主藥計]，每組6只。各組小鼠分別灌胃生理鹽水或ARM相應劑型藥液，灌胃體積約為0.2 mL（按照小鼠體質量微調），每日1次，連續給藥30 d。分別在給藥前（即進入腫瘤快速增殖初期時）和末次給藥結束后測定小鼠體質量，觀察和記錄其一般情況以及是否出現相關異常反應;自開始給藥起，每5天測定小鼠的皮下腫瘤組織體積，以給藥時間為橫坐標、腫瘤組織體積為縱坐標繪制腫瘤組織體積變化曲線，并計算相對腫瘤增殖率：相對腫瘤增殖率（%）=末次給藥后給藥組小鼠的腫瘤組織體積/末次給藥后對照組小鼠的腫瘤組織體積×100%。

2.5 統計學方法

采用 SPSS 21.0軟件對數據進行參數計算及統計分析。計量資料以x±s表示，各組小鼠治療前后的體質量、皮下腫瘤體積的自身對照比較采用配對t檢驗，組間比較采用單因素方差分析。P<0.05表示差異有統計學意義。

3 結果

3.1 皮下移植瘤模型小鼠腫瘤生長曲線

皮下移植瘤模型小鼠體質量及腫瘤生長曲線見圖1。由圖1可見，皮下移植瘤模型小鼠的腫瘤組織體積呈指數級增大，而體質量增長速度較平緩。腫瘤組織接種于裸小鼠后，5 d內腫瘤組織體積增長較緩，在5 d后增長速度加快，并于第10天左右進入腫瘤快速增殖初期，此時荷瘤小鼠的平均腫瘤組織體積為68.69 mm3（n=12），平均體質量為23.38 g（n=12）。因此，后續試驗以接種腫瘤組織后第10天的皮下移植瘤模型小鼠進行藥物抑瘤效果考察。

3.2 ARM-SMEDDS對皮下移植瘤模型小鼠的抑瘤效果

3.2.1 小鼠的體質量變化及一般情況 與給藥前比較，各組小鼠末次給藥后體質量均顯著升高（P<0.05）;各組小鼠的體質量在相同時間點組間比較的差異均無統計學意義（P>0.05）。各組小鼠給藥期間一般情況正常，均未見明顯的體質量降低等異常反應。各組小鼠不同時間點的體質量變化見表1。

3.2.2 小鼠腫瘤組織體積變化和相對腫瘤增殖率 各組小鼠腫瘤組織體積基本呈指數級生長;給藥第5天時，各組小鼠腫瘤組織體積組間比較的差異無統計學意義（P>0.05）;自給藥第10天起，ARM-SMEDDS各劑量組小鼠的腫瘤組織體積較對照組顯著縮小（P<0.05）;自給藥第15天起，ARM-SMEDDS各劑量組小鼠的腫瘤組織體積較ARM混懸液組顯著縮小（P<0.05）。各組小鼠的腫瘤組織體積變化曲線見圖2。

末次給藥后，ARM-SMEDDS各劑量組小鼠的相對腫瘤增殖率均較ARM混懸液組顯著降低（P<0.05），詳見表2。

4 討論

腦膠質瘤呈浸潤性生長的患者在手術后必須進行系統化療，由于大多數化療藥物難以透過血腦屏障且毒副作用較強，加之腫瘤細胞容易產生耐藥性，因此目前腦膠質腫瘤患者的治療效果較差。可見，進一步尋求毒副作用較小、能夠通過血腦屏障的化療藥物非常重要。已有研究證實，青蒿素及其衍生物（如ARM）可抑制并殺傷腦膠質瘤細胞，且對正常細胞損傷很小[5-8]，但是由于ARM口服生物利用度較低、體內代謝快、有效血藥濃度維持時間短[9-10]，因此研究高效、安全的ARM新型給藥制劑對于其臨床應用具有重要意義。近年來，ARM新型給藥系統的研究已經得到了國內外學者的廣泛關注[16]。

SMEDDS是由藥物、油相、非離子表面活性劑和助乳化劑組成的均一澄明的混合液體，口服后在胃腸道的輕微蠕動下，能自發形成粒徑小于100 nm的水包油（O/W）型微乳，可作為遞藥載體提高水難溶性藥物的口服生物利用度、改善藥物的穩定性和口感等，進而提高藥物的治療效果和患者的用藥依從性[17]。在制劑過程中，選用長鏈脂肪酸作為表面活性劑，可促進藥物的淋巴吸收，從而避免胃腸道的吸收屏障以及肝臟的首關效應[17-18]。

課題組前期對ARM-SMEDDS在大鼠體內的生物利用度進行研究時，根據已有文獻設置ARM混懸液和ARM-SMEDDS的給藥劑量分別為120、20 mg/kg（以主藥計）[12]。由于本研究采用小鼠作為對象，考慮到不同動物間劑量轉換情況及其安全性，故將小鼠的ARM混懸液和ARM-SMEDDS的每日給藥劑量分別設置為60 mg/kg和10～30 mg/kg。本研究結果顯示，ARM- SMEDDS以10～30 mg/（kg·d）給藥后的抑瘤效果均明顯優于以60 mg/（kg·d）給藥的ARM混懸液，這與課題組前期研究結果，即ARM-SMEDDS經胃腸道給藥后在大鼠體內生物利用度顯著高于ARM混懸液是一致的。

綜上所述，本課題組所設計和制備的ARM- SMEDDS具有明顯的抑制人腦膠質瘤組織增長的效果，并優于劑量更高的混懸液劑型。本課題組后續將進一步針對該新劑型的透血腦屏障分布特征和治療腦膠質瘤的效果進行研究，為ARM新型給藥系統的進一步開發和應用提供依據。

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（收稿日期：2019-04-15 修回日期：2019-12-02）

（編輯：段思怡）