海藻及其混偽品中17種氨基酸的含量測定

張曉萍 張文 戚鵬飛 朱仁愿 李潔 張彩霞 邱國玉

摘 要 目的：建立海藻及其混偽品中17種氨基酸的含量測定方法并進行聚類分析，為海藻藥材的質量控制提供依據。方法：取18批樣品（S1～S6為真品、S7～S18為混偽品），經酸水解后，采用氨基酸全自動分析儀測定氨基酸含量。色譜柱為LCAK06/Na型磺酸基強酸性陽離子交換樹脂分離柱，流動相為緩沖液-再生液系統（梯度洗脫），流速為洗脫泵0.45 mL/min、衍生泵0.25 mL/min，檢測波長為440 nm（脯氨酸）、570 nm（其余氨基酸），進樣量為50 μL。采用PASW Statistics 18.0軟件，以“平方Euclidean距離”為度量標準使用組間聯接的聚類方法對 18批樣品進行聚類分析。結果：17種氨基酸均分離良好，空白無干擾;其質量濃度與峰面積的線性關系良好（r均大于0.998），線性范圍上下限分別為48.06 μg/L（胱氨酸）、1.501 μg/L（甘氨酸）;精密度、重復性、穩定性試驗RSD均小于2%;平均加樣回收率為90.60%～101.56%（RSD為0.88%～2.15%，n=6）。海藻及其混偽品樣品中均檢出17種氨基酸，其中谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸、丙氨酸、甘氨酸、纈氨酸的含量相對較高。聚類分析結果顯示，18批樣品可以聚為4類，S1～S6為一類，S7～S9為一類，S10～S12 、S16～S18為一類，S13～S15為一類，與海藻真品與其混偽品的鑒定結果相一致。結論：該方法操作簡便、快速、準確度高、重復性好，可用于海藻及其混偽品的氨基酸定量分析及真偽區分。

關鍵詞 海藻;混偽品;陽離子交換色譜法;柱后衍生;氨基酸

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for content determination of 17 kinds of amino acids in Sargassum and its adulterants， and to carry out cluster analysis， so as to provide reference for quality control of Sargassum. METHODS： Totally of 18 batches of sample （S1-S6 as certified product， S7-S18 as adulterants） were collected. After acid hydrolysis， amino acids contents were detected by using automatic amino acid analyzer. The separation was performed on LCAK06/Na sulfonic acid cation exchange resin column with mobile phase consisted of buffer-regeneration system （gradient elution） at the flow rate of 0.45 mL/min （elution pump） and 0.25 mL/min （derivative pump）. The detection wavelengths were set at 440 nm （proline） and 570 nm （other amino acids）， and the sample size volume was 50 μL. PASW Statistics 18.0 software was used， and cluster analysis was conducted by using group connection method of cluster analysis with “square Euclidean distance” as the measurement standard. RESULTS： 17 kinds of amino acids were well separated without interference from blank sample. The linear relationship between mass concentration and peak area was good （all r were over 0.998）， and the upper and lower limits of the linear range were 48.06 μg/L （cystine） and 1.501 μg/L （glycine）， respectively; RSDs of precision， reproducibility and stability tests were lower than 2%. The average recoveries were between 90.60%-101.56%（RSDs were 0.88%-2.15%，n=6）. 17 kinds of amino acids were detected in Sargassum and its adulterants， among which the contents of glutamic acid， aspartic acid， leucine， alanine， glycine and valine were relatively high. Results of cluster analysis showed that 18 batches of sample were clustered into 4 categories， i.e. S1-S6 into one category; S7-S9 into one category; S10-S12， S16-S18 into one category; S13-S15 into one category; which was consistent with the identification result of Sargassum and its adulterants. CONCLUSIONS： The method is simple， rapid， accurate and reproducible， and can be used for the quantitative analysis and identification of amino acids in Sargassum and adulterants.

KEYWORDS? ?Sargassum; Adulterants; Cation exchange chromatography; Post-column derivatization; Amino acids

海藻為海產藻類植物的總稱。中藥海藻（以下簡稱“海藻”）始載于《神農本草經》，列為中品，具有軟堅散結、消痰、利水之功效，多用于癭瘤、瘰疬、睪丸腫痛、痰飲水腫等癥[1]。2015年版《中國藥典》（一部）收載的海藻為馬尾藻科植物海蒿子[Sargassum pallidum（Turn.）C.Ag.]或羊棲菜[S. fusiforme（Harv.）Setch.]的干燥藻體，前者習稱“大葉海藻”，后者習稱“小葉海藻”[2]。但是目前市場上除藥典收載的品種外，尚有銅藻[S. horneri（Turn.）C. Ag.]、亨氏馬尾藻[S. henslowianum C. Ag.]、瓦氏馬尾藻[S. vachellianum Grev.]和海黍子[S. kjellmanianum Yendo.]等其他藻類植物冒充海藻大量流通，不僅干擾了藥材市場的正常運行，還會影響用藥的安全有效性[3-6]。

海藻富含多種功效性成分，如多糖、無機元素、氨基酸、脂肪酸、蛋白質、維生素、甾體等[7-11]，具有抗腫瘤、抗凝血、抗氧化、增強免疫等藥理作用[12]。2015年版《中國藥典》中海藻含量測定項下收載了以巖藻糖為對照品、用紫外分光光度法測定海藻中海藻多糖含量的方法[2]。研究表明，海藻中粗蛋白含量為8.00%[11]。考慮到氨基酸作為組成蛋白質的基本單位，且有文獻研究表明，甘氨酸、精氨酸等與心血管系統健康密切相關[13-14]，海藻中的氨基酸與其生物活性也具有一定相關性[15]，因此擬將該類成分含量作為海藻藥材的質量評價指標之一。此外，國內目前有關于海藻中海藻多糖提取及含量測定的研究[9]，以及藻類產品中植物激素[16]、微量元素[17]、脂肪酸[18]、外源性有害物質重金屬[19]、農藥殘留量[20]等的研究，但尚未見從中藥材真偽鑒別角度對海藻及其混偽品中所含氨基酸類成分進行分析的研究報道。基于此，本試驗采用陽離子交換色譜柱結合柱后衍生法，對海藻及混偽品中的17種氨基酸含量進行測定，并采用聚類分析方法對樣品進行統計分類，以期為海藻藥材的質量控制及深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

S-433D型氨基酸全自動分析儀（包括S5200型全自動進樣器、S4300型氨基酸反應模塊、S7130型溶劑存放單元、S2100型梯度泵等）、LCAK06/Na型磺酸基強酸性陽離子交換樹脂分離柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）均購自德國Sykam公司;ME204/02型萬分之一天平、S220-K型酸度計[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司];DHG-9070A型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）;N-WVAP112型氮吹儀（美國Organomation公司）;Milli-Q IQ7000型超純水系統[密理博（中國）有限公司]。

1.2 藥品與試劑

氨基酸混合標準溶液（H型）：含有天冬氨酸（Asp）、蘇氨酸（Thr）、絲氨酸（Ser）、谷氨酸（Glu）、丙氨酸（Ala）、甘氨酸（Gly）、胱氨酸（Cys）、纈氨酸（Val）、蛋氨酸（Met）、異亮氨酸（Ile）、亮氨酸（Leu）、酪氨酸（Tyr）、苯丙氨酸（Phe）、組氨酸（His）、賴氨酸（Lys）、精氨酸（Arg）、脯氨酸（Pro）等17種氨基酸混合對照品（德國Sykam公司，批號：09070113，每種氨基酸濃度均為2.5 μmol/mL）;甲醇為色譜純，茚三酮、檸檬酸、檸檬酸三鈉、硼酸、乙醇、濃鹽酸、氫氧化鈉及其他試劑均為優級純，水為超純水。

1.3 藥材

海藻及其混偽品樣品來源于蘭州市食品藥品檢驗所日常監督檢驗、2017年甘肅省中藥飲片專項抽驗評價性檢驗以及項目組產地調研收集的樣品，經蘭州市食品藥品檢驗所張彩霞副主任中藥師鑒定，分別為馬尾藻屬植物海蒿子、羊棲菜、銅藻、亨氏馬尾藻、瓦氏馬尾藻、海黍子[21]的干燥藻體。樣品信息詳見表1。

2 方法與結果

2.1 溶液的制備

2.1.1 試液 （1）緩沖液A：分別稱取檸檬酸三鈉11.8 g、檸檬酸6 g，置于1 L量瓶中，加適量水溶解，再加甲醇65 mL和濃鹽酸6 mL，加水定容，搖勻，用濃鹽酸調節pH至3.45，經0.45 μm濾膜濾過，即得。（2）緩沖液B：分別稱取檸檬酸三鈉19.6 g、氫氧化鈉3.1 g、硼酸5.0 g，置于1 L量瓶中，加適量水溶解并定容，搖勻，用濃鹽酸調節pH至10.85，經0.45 μm濾膜濾過，即得。（3）再生液C：分別稱取氫氧化鈉20.0 g、乙二胺四乙酸0.2 g，置于1 L量瓶中，加適量水溶解并定容，搖勻，經0.45 μm濾膜濾過，即得。（4）樣品稀釋液：稱取檸檬酸三鈉11.8 g，置于1 L量瓶中，加入濃鹽酸10.4 mL，用水溶解并稀釋至1 L，搖勻，用濃鹽酸調節pH 至2.20，經0.45 μm 濾膜濾過，即得。（5）鉀鈉緩沖液：量取水500 mL，加入醋酸鉀196.0 g、三水乙酸鈉272.0 g后，緩緩攪拌使溶解，再加入乙酸200 mL，用水定容至1 L，經0.45 μm 濾膜過濾，即得。（6）茚三酮溶液：量取甲醇600 mL，加入茚三酮20 g、苯酚2 g，不斷攪拌至茚三酮完全溶解，經0.45 μm 有機濾膜濾過，然后向濾液中加入鉀鈉緩沖液400 mL，并轉移至棕色試劑瓶中，從底部吹入氮氣約3～5 min，即得。

2.1.2 混合對照品溶液 精密吸取氨基酸標準溶液0.4 mL至10 mL量瓶中，加樣品稀釋液稀釋并定容，作為混合對照品溶液（單個氨基酸濃度均為100 μmol/L）。

2.1.3 供試品溶液 稱取樣品粉末（過三號篩）約0.5 g，精密稱定，置于20 mL水解管中（切勿沾壁），精密加入6 mol/L鹽酸10 mL，真空脫氣，在充氮氣狀態下封口，置于110 ℃電熱鼓風干燥箱中水解20 h;取出，搖勻，放冷至室溫;打開水解管，精密移取1 mL水解液置于25 mL燒杯中，80 ℃水浴蒸干，殘渣以15 mL樣品稀釋液溶解完全，經0.45 μm濾膜濾過，即得。

2.2 色譜條件

采用氨基酸全自動分析儀進行測定[22]。色譜柱為LCAK06/Na型磺酸基強酸性陽離子交換樹脂分離柱;流動相分別為緩沖液A、緩沖液B、再生液C，梯度洗脫（程序見表2），流速為0.45 mL/min;衍生液為茚三酮溶液，流速為0.25 mL/min;檢測波長為440 nm（Pro）和570 nm（其余16種氨基酸）;進樣量為50 μL。

2.3 方法學考察

2.3.1 系統適用性試驗 分別精密吸取“2.1”項下混合對照品溶液、供試品溶液（編號：S7）適量，并以樣品稀釋液為空白，按“2.2”項下色譜條件進樣測定。結果顯示，混合對照品溶液和供試品溶液中17種氨基酸均分離良好，空白無干擾，色譜圖見圖1。

2.3.2 線性關系考察 精密吸取氨基酸標準溶液5份，分別加樣品稀釋液配制成單個氨基酸濃度均為20、40、80、120、200 μmol/L的系列對照溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標、氨基酸質量濃度（x，單位換算為μg/L）為橫坐標，進行線性回歸，得標準曲線方程，詳見表3。結果表明，17種氨基酸在各自質量濃度范圍內線性關系均良好（r>0.998）。

2.3.3 精密度試驗 取“2.1.2”項下混合對照品溶液，按“2.2”項下色譜條件連續進樣6次，記錄峰面積。結果，17種氨基酸峰面積的RSD為0.08%～1.52%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復性試驗 精密稱取同一樣品（編號：S7）5份，每份0.5 g，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標法計算含量。結果，17種氨基酸含量的RSD為0.50%～1.98%（n=5），表明本方法重復性良好。

2.3.5 穩定性試驗 取“2.1.3”項下同一供試品溶液（編號：S7），分別于室溫下放置0、2、4、6、8、10、12、16、20、24 h時按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，17種氨基酸峰面積的RSD為0.80%～1.51%（n=10），表明供試品溶液在室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.3.6 加樣回收率試驗 精密稱取已測得含量的樣品（編號：S7）6份，每份0.5 g，精密加入“2.1.2”項下混合對照品溶液1 mL，按照“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積并計算加樣回收率，詳見表4。結果表明，該方法準確度良好。

2.4 樣品含量測定

取18批樣品（S1～S18），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，按“2.2”項下色譜條件進樣測定，以外標法計算含量。各樣品平行測定3次，取平均值，結果見表5。

表4 加樣回收率試驗結果（n=6）

Tab 4 Results of recovery tests （n=6）

[編號 ? ? ?氨基酸 加樣回收率范圍，% 平均加樣回收率，% RSD，% 1 Asp 97.41～101.82 99.25 1.90 2 Thr 95.76～101.62 98.75 2.15 3 Ser 97.52～103.40 99.74 2.11 4 Glu 98.39～102.51 100.03 1.44 5 Gly 98.54～101.82 100.38 1.38 6 Ala 97.44～100.58 99.44 1.30 7 Cys 88.44～92.88 90.60 1.92 8 Val 93.41～99.18 95.81 2.08 9 Met 93.52～98.38 95.97 1.63 10 Ile 96.80～99.24 97.96 1.03 11 Leu 99.58～102.98 101.56 1.45 12 Tyr 93.52～96.23 95.11 1.07 13 Phe 95.81～98.18 97.11 0.88 14 His 92.92～96.43 95.09 1.66 15 Lys 92.48～98.05 96.36 2.14 16 Arg 96.71～99.20 97.93 1.06 17 Pro 96.24～98.90 97.63 0.93 ]

2.5 聚類分析

采用Excel 2007軟件匯總含量測定原始數據。結果顯示，海藻真品及其混偽品中均含有所測出17種氨基酸，且各氨基酸成分含量與總氨基酸含量的變化趨勢保持一致，其中Glu、Asp、Leu、Ala、Gly、Val含量相對較高，且包括2種人體必需氨基酸。采用PASW Statistics 18.0軟件，根據17種氨基酸含量使用組間聯接的聚類方法對18批樣品進行聚類分析，以“平方Euclidean距離”為度量標準，繪制海藻及其混偽品中氨基酸含量的樹狀圖，見圖2。

由圖2可知，18批樣品可聚為4類，S1～S6一類，S7～S9聚為一類，S10～S12、S16～S18聚為一類，S13～S15聚為一類，與種源鑒定結果相符，表明本方法可將海藻與其混偽品區別。

3 討論

3.1 氨基酸分析檢測方法的選擇

由于大多數氨基酸本身不具有紫外吸收和熒光發射的特性，所以通常需要將其衍生化后再采用儀器測定，常用方法主要為高效液相色譜法[23]、氣相色譜法[24]、分光光度法[25]、近紅外法 [26]、高效陰離子交換色譜積分脈沖安培檢測法[27]、氨基酸分析儀測定法等[22]，各有優缺點。例如，氣相色譜法是將氨基酸衍生為易氣化的物質進行分析，雖然方法靈敏度高、分析時間短，但衍生試劑種類少、衍生操作復雜;近紅外法雖然樣品前處理簡便，但檢測靈敏度低、定量準確度差。氨基酸分析儀測定法作為液相色譜分析法中重要的一類，專為氨基酸分析而設計，它是一種柱后衍生法，先采用陽離子交換樹脂分離氨基酸混合物，再以柱后茚三酮衍生法進行樣品檢測。該方法前處理過程簡單、操作簡便、檢測穩定性和重復性好。為此，本試驗采用氨基酸分析儀檢測海藻及其混偽品中氨基酸含量。

3.2 取樣量、水解時間及溫度的考察

參考文獻報道的藻類植物氨基酸含量[28-29]，本課題組對樣品取樣量、水解及溫度進行了考察：分別稱取不同量（0.1、0.2、0.5、1.0 g）的樣品，依法水解反應后制備供試品溶液，以各氨基酸成分的峰形及響應值為指標，選取最佳取樣量;同時，考察不同水解時間和溫度對氨基酸測定的影響。結果表明，當取樣量為0.5 g時，各色譜峰峰形及響應良好;不同的水解溫度和時間對水解程度有重要的影響，其中110 ℃加熱20 h可以完全水解氨基酸，最終確定了“2.1.3”項下樣品處理條件。

3.3 測定結果和聚類分析的意義

由圖2可知，18批樣品可分為4類，與樣品的種質鑒定結果具有一致性：海藻真品海蒿子、羊棲菜為一類;其混偽品銅藻為一類，亨氏馬尾藻、海黍子為一類，瓦氏馬尾藻為一類。海藻為常用的中藥材，市場流通混偽品較多。由于海藻為海生植物，不便于觀察其生長特性，且隨著生長期的延長其葉的性狀特征變異較大（從初生葉的披針形葉到次生葉的絲狀葉、多形葉在同一植株上同時存在），干燥的藥材或飲片多皺縮、卷曲或破碎，這些都給海藻的鑒定帶來了困難，使混偽品泛濫有了可乘之機，大量涌入市場。通過對海藻及其4種混偽品中氨基酸成分的含量測定，確定了海藻中含有的氨基酸種類及含量差異;同時，聚類分析結果證明，藥典收載的藥用來源的馬尾藻屬植物海蒿子、羊棲菜聚為一類，而銅藻、亨氏馬尾藻、瓦氏馬尾藻、海黍子的氨基酸含量與真品差異較大，都不能作為海藻代用品使用。

綜上所述，本試驗通過對中藥海蒿子、羊棲菜及其馬尾藻科混偽品銅藻、亨氏馬尾藻、瓦氏馬尾藻、海黍子中氨基酸成分進行定量測定和真偽區分，為全面反映其氨基酸組成及含量提供了數據支持，同時為海藻的全面深入研究提供了實驗基礎。

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（收稿日期：2019-07-25 修回日期：2019-12-25）

（編輯：段思怡）