野生五葉草莓的組織培養繁殖技術研究

王軍利，千小綿，吳紫安，羊 波，李 偉，王 新

(1.咸陽職業技術學院，陜西 西咸新區 712046；2.陜西省農業宣傳信息中心，陜西 西安 710003；3.紫陽縣蒿坪鎮農業綜合服務站，陜西 紫陽 725300；4.漢中市漢臺區農產品質量安全監測檢驗中心，陜西 漢中 723000；5.安康市漢濱區石梯鎮農綜站，陜西 安康 725000)

薔薇科草莓屬的植物在全世界約有50種，其中全球廣為栽培的草莓，是由八倍體鳳梨草莓(Fragariaananassa)培育而成的栽培種，其他倍性的草莓則多呈野生或半野生狀態分布于全球各地[1～2]。常見的野生草莓約有20種，中國自然分布約11種，秦巴山地為中國野生草莓的主要集生地之一，大約有7種，分別是二倍體(2x)的森林草莓(F.vescaL.)、黃毛草莓(F.nilgrrensisSchlecht.)、五葉草莓(F.pentaphyllaLonzink.)和纖細草莓(F.mubicolaLindl.)，以及四倍體(4x)的東方草莓(F.orientalisLozinsk.)、傘房草莓(F.corymbosaLozinsk.)和西南草莓(F.moupinensis(Franch)Card.)[2～6]。為了開發、利用野生草莓資源，我國各地大量的科研人員進行很多努力，對我國野生草莓資源的分布進行調查和鑒定[1～5]、對野生草莓進行引種馴化[6]、利用野生資源進行常規育種[7～8]、用組織培養的方法對部分野生草莓進行培養與快繁[9、10]等，但對于秦巴山地野生草莓資源的組培研究，所見資料甚少。為了開發利用秦巴山地的野生草莓資源，筆者在前人工作的基礎上，研究了秦巴山地野生五葉草莓的組織培養快繁技術，為五葉草莓的離體再生提供了實驗技術，為其離體染色體加倍提供了前期的實驗材料，也為秦巴山地其他野生草莓的組培快繁提供了參考路徑。

1 材料與方法

1.1 材料

供試的五葉草莓源自陜西省秦巴山區。項目組將其采挖回來后，栽培在咸陽職業技術學院儀祉農林學院實訓基地的專門苗圃。野生五葉草莓植株長勢強，匍匐莖和葉柄被直立絨毛，花序梗和小花梗亦密被直立絨毛，小葉5，極稀3，葉片質地較厚，正面無毛，背面被疏絨毛，宿萼反折，果實白色，圓形或橢圓形，種子多枚，陷于果面下。根據這些特征，項目組運用《中國植物志》[11]《秦嶺植物志》[12]《中國果樹分類學》[13]及其他相關檢索、鑒定資料(雷家軍，2004)[14]，對其進行了鑒定。

1.2 方法

1.2.1 五葉草莓無菌苗的獲得 在秦巴山地草莓屬野生植物資源苗圃地，選無病蟲害的五葉草莓健壯苗，用剪刀剪取2 cm左右的匍匐莖頂端，放置在大燒杯中，置于水龍頭下流水沖洗4～6 h，再在超凈工作臺上用無菌鑷子將其夾出，放入盛有75%酒精的燒杯中消毒35 s，然后再用2%的NaClO消毒10～15 min，用無菌水沖洗4～6次，再用無菌濾紙吸干表面的水分，在墊有無菌濾紙的培養皿中用滅菌后放涼的解剖刀切取長約0.5～1.0 cm的莖尖(帶有一個葉原基)作為外植體，接種在Ph=5.8～6.0的MS+0.5 mg·L-16-BA+30 g·L-1蔗糖+7 g·L-1瓊脂粉的固體培養基上，每個培養瓶接種3個外植體。接種后，將培養瓶放置在培養室中培養，期間注意觀察污染情況，及時將未被污染的外植體轉接到新的培養基上。培養條件：光照時長為15 h/d，光強為1 500～2 000 Lux，溫度為25(±2)℃。消毒過程中，由于五葉草莓通體被有絨毛，為使消毒徹底，每一步都不斷振搖或攪拌。

1.2.2 不同濃度的6-BA對五葉草莓離體增殖的影響 基本培養基為MS培養基，添加蔗糖30 g·L-1，瓊脂粉7 g·L-1，pH5.8～6.0，NAA濃度為0.1 mg·L-1。6-BA設置4個濃度處理：0.2 mg·L-1、0.3 mg·L-1、0.4 mg·L-1、0.5 mg·L-1、0.6 mg·L-1。選取生長均勻，高度3～5 cm，具有4片葉子的五葉草莓無根試管苗接種到該培養基上。每個培養瓶接種4個無根試管苗，每個處理接種15瓶。接種30 d后，統計外植體增殖倍數。

1.2.3 基本培養基和生長素種類對五葉草莓生根的影響 基本培養基和生長素的選擇設4種配比方式：MS+0.2 mg·L-1IBA、MS+0.2 mg·L-1NAA、1/2 MS+0.2 mg·L-1IBA以及1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA。無根草莓試管苗的選取：選取在MS+0.4 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA培養基上生長健壯的無根草莓苗，高度5 cm左右，具有5片葉子。每種培養基接種10瓶，每瓶接種3株無根試管苗。接種30 d后，觀察根系生長情況，并統計生根數。

2 結果與分析

2.1 五葉草莓無菌苗的獲得

五葉草莓無菌苗的獲得過程中，接種3 d后開始褐化，褐化比率近乎90%，最終褐化致死率達67.1%。褐化程度不嚴重、未致死的消毒莖尖，在接種21 d時，不經愈傷組織階段開始萌發新芽，并最終形成叢生芽，獲得五葉草莓無菌苗。

2.2 不同濃度的6-BA對五葉草莓離體增殖的影響

將由莖尖培養后選取的相同規格的五葉草莓無菌苗，接種在6-BA不同濃度處理的5種增殖培養基上，30 d后觀察增殖苗生長情況，并統計增殖數量，計算出增殖倍數。結果見表1。

由表1可見，當6-BA的濃度為0.2 mg·L-1時，五葉草莓長勢健壯，但增殖倍數較低；當6-BA的濃度增加到0.3 mg·L-1時，增殖倍數增加，增殖苗生長健壯，葉色濃綠；當6-BA的濃度增加到0.4 mg·L-1時，增殖倍數繼續增加，外殖體增殖苗長勢良好。但當6-BA濃度增加到0.5 mg·L-1時，增殖倍數越過峰值開始下降，且增殖苗長勢變弱，偶有黃化現象；而6-BA濃度增加到0.6mg·L-1時，增殖倍數下降幅度很大，大多未見增殖，苗低矮、畸形，黃化程度比較嚴重。由此可見，當基本培養基為MS，NAA濃度為0.1 mg·L-1時，五葉草莓離體增殖的最佳6-BA添加濃度為0.4 mg·L-1。

2.3 基本培養基和生長素種類對五葉草莓生根的影響

選取生長健壯的同規格的五葉草莓無根試管苗接種在4種不同的生根培養基上，30 d后，觀察其誘導生根情況，結果見表2。

表1 不同濃度6-BA對五葉草莓無菌苗增殖的影響

表2 基本培養基及生長素對五葉草莓生根的影響

在實驗過程進行時可以觀察到，無論哪種生長調節劑，1/2 MS培養基上的無根試管苗生根都早于MS培養基。由表2可見：當生長調節物為IBA時，無論1/2 MS培養基還是MS培養基，接種30 d后，五葉草莓的無根試管苗的生根率都達到100%，高于NAA的誘導率，但NAA為添加的生長調節劑時，誘導生成的根普遍粗壯，長度也普遍大于以IBA為誘導調節劑。株平均誘導根數以1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA培養基為最大，每株達6.9根，且長度超過1.0 cm的根在總根數中占比超過41.1%。雖然IBA作為生根調節劑的生根率更高，但NAA作為添加的生根調節劑時，誘導的根更粗壯、更長、單株生根數更多，植株在練苗后更容易成活而長成健壯幼苗；另外，隨著誘導時間的延長，超過37 d時，NAA為調節劑的誘導生根率也達到100%。故此，誘導五葉草莓無根試管苗生根的合適培養基為1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA。

3 討論與結論

秦巴山區有豐富的野生草莓資源。較之于栽培草莓，野生草莓在抗病蟲害、抗逆性、可溶性有機物含量、果實顏色豐富度以及果實香味物質種類等方面，有較大的優勢[1～6]。為了利用這些自然資源，有必要對其進行搜集、整理、研究。野生五葉草莓長勢強，生命力旺盛，葉片厚，濃綠，果實顏色為栽培草莓中少見的白色，果肉細膩綿軟，香味濃郁，是優質的雜交育種資源，也是通過倍性增加、細胞融合甚至轉基因方法進行育種的優質基因源[1～6、14]，對其進行組織培養研究，建立莖尖培養組培快繁技術，為其離體再生、染色體加倍及細胞融合等工作奠定了基礎，對于其野生資源的開發、利用，具有重要意義。

在外殖體的獲得時，發現剝取的莖尖越小，褐化死亡率越高；越大，越有利于外植體成活，這與王會[10]對紅石美草莓及王燕[9]對黃毛草莓的研究結論一致，可見在草莓組織培養外殖體的切取過程中，組織越幼嫩、切口相對越大，外植體越容易褐化。在6-BA對五葉草莓離體增殖的研究中，發現在一定范圍內，隨著6-BA濃度在培養基中含量的增加，草莓離體增殖倍數增大，但超過一定的峰值后，反而下降，這與王燕[9]對黃毛草莓的研究結論一致。在基本培養基和生長素對五葉草莓生根的影響實驗中，IBA作為生長調節物時，30 d試管苗生根率達100%，無論哪種生長調節劑，1/2 MS培養基上的無根試管苗生根都早于MS培養基，這些都和王燕[9]對黃毛草莓的研究結論一致，但在NAA作為調節物生成的根粗壯、結實，這與王燕[9]對黃毛草莓的研究結論不一致。可見，同為草莓屬植物，在實驗條件基本一致時，不同的種，實驗結論會有不同。所以不同植物材料進行組織培養時，具體植物的合適培養基和添加劑，要通過實驗取得。

實驗中得到以下結論：利用野生五葉草莓匍匐莖莖尖在MS+0.5 mg·L-16-BA培養基上獲得無菌苗，適合五葉草莓快繁的培養基為MS+0.4 mg·L-16-BA+0.1 mg·L-1NAA，增值倍數為8.150；適合其誘導生根的培養基為1/2 MS+0.2 mg·L-1NAA，單株誘導根數最大，誘導根粗，長度長，有利于形成壯苗。