山羊睪丸支持細胞分離培養及其氧化應激效果研究

王菊花 劉丹丹 劉 琦 王佳明 董 靜 周 杰 薛秀恒

(1.安徽農業大學 動物科技學院，合肥 230036； 2.安徽農業大學 茶與食品科技學院，合肥 230036)

睪丸支持細胞(Sertoli cells，SC)不僅為生精細胞的成長提供不可缺少的營養因子和激素[1]，也是血睪屏障的重要組成部分，進而為精子的發育和成熟提供免疫豁免的功能微環境[2]。SC被廣泛應用于組織工程、器官移植及促進共移植細胞生長等臨床方面的研究[3-5]，在用于這些研究時，需對SC進行體外培養增殖。而體外細胞培養是一個靜態過程，各種化學反應常會產生大量的活性氧(ROS)[6]。在培養液中ROS的過量聚集會導致細胞受到氧化應激的影響，從而造成DNA鏈斷裂、蛋白質損傷及細胞死亡[7]。因此，體外培養SC時，也會面臨同樣的問題。

ROS是由一系列氧氣來源的不同結構的小分子自由基組成，其中一些羥自由基非常不穩定，而其中過氧化氫(H2O2)性質相對穩定，容易獲得，且能夠自由擴散[8]，已有研究利用H2O2對多種細胞建立了氧化應激模型，并對其進行抗氧化相關研究[9,10]，H2O2已成為國內外研究氧化應激的重要誘導劑[11]。但目前國內外關于SC在體外培養時的氧化應激狀態及其抗氧化性能的研究報道很少。因此，為了探究體外培養SC時的氧化應激效果，本研究擬首先體外分離純化和培養山羊睪丸支持細胞(GSCs)，并對其進行鑒定，再用不同濃度H2O2處理GSCs，使細胞處于不同的氧化應激狀態，研究GSC氧化應激模型建立的優化條件，以期為體外長期培養GSCs并維持其穩定增殖奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗動物

山羊睪丸組織取自健康狀況良好且繁殖性能正常的2 只40 日齡雄性波爾山羊，山羊飼養于安徽博大羊場。

1.2 試劑

DMEM高糖液體培養基、胎牛血清(FBS)購自Hyclone公司；0.25% 胰酶-EDTA、DPBS溶液購自Gibco公司；DMSO、MTT購自Biosharp公司；H2O2、青霉素、鏈霉素、20 mmol/L Tris-HCl溶液購自Sigma公司；秋水仙素購自北京索萊寶科技有限公司；兔抗-GATA4抗體、山羊抗兔IgG-R購自購自Santa Cruz (USA)。

支持細胞培養液：DMEM培養液+10% FBS+1% 雙抗(100 IU/mL青霉素+100 mg/mL鏈霉素)+0.1%β-巰基乙醇。

1%的油紅O染液：油紅0.1 g，60% 異丙醇 100 mL，將溶液加熱至60 ℃，持續5 min并攪拌，趁熱過濾，待冷卻后再過濾一次，保存于4 ℃冰箱待用。

1.3 GSC的分離培養

參考于磊等[12]的方法并稍作調整，術部用75%酒精消毒后切開山羊陰囊，摘除睪丸置于預溫的含5%雙抗的DPBS溶液中，運回試驗室后，用含5%雙抗DPBS溶液沖洗5遍，去除白膜后暴露生精小管，將生精小管剪成約1 mm3大小的碎塊，加入0.25% 胰蛋白酶37 ℃消化15 min，用支持細胞培養液終止消化，800 r/min離心3 min去除間質細胞及胰蛋白酶，再加入37 ℃預熱的2 mg/mL膠原酶Ⅳ和25 μg/mL的 DNaseⅠ于37 ℃水浴中震蕩消化30 min，用支持細胞培養液終止消化，200目網過濾，1 200 r/min離心3 min，棄上清，加入支持細胞培養液調整細胞濃度為5×106個/L后于培養皿中，置37 ℃、5%的CO2飽和濕度的培養箱中培養24 h后，吸去培養液中懸浮的死細胞和生殖細胞，再加入20 mmol/L Tris-HCl處理2.5 min，吸去殘余的生殖細胞，加入培養液繼續培養，每隔一天全量更換培養液，顯微鏡觀察其生長狀態[13]。

1.4 GSC活性檢測(MTT法)

將純化后GSCs調整細胞密度為1.0×105個/mL，接種于96孔板中，用MTT法檢測培養第1～8天共8組細胞活性，每組6個重復，各組細胞每24 h半量換液，以確定GSCs活性最強的時間點。

在氧化應激試驗中，取GSCs活性最強的時間點的細胞，制成細胞懸液，以同樣濃度接種于96孔板中，試驗分為6組，分別加入不同濃度的H2O2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)，0 μmol/L組不加H2O2，用等量的支持細胞培養液代替，每組6個 重復，邊緣孔用無菌DPBS填充。將接種好的96孔板放入CO2培養箱中培養，培養至細胞達 80%～90% 融合度時，用MTT法檢測GSCs活性。

1.5 GSC流式細胞鑒定

將GSCs培養至第5天達到 80%～90% 融合時，用0.25% 胰酶消化后，支持細胞培養液阻止消化，1 200 r/min 室溫離心3 min 后棄上清后，加入4% 的多聚甲醛(PFA)固定15 min。冷DPBS沖洗細胞2遍，每次5 min；用0.1% Triton-X 100 DPBS通透細胞膜30 min，用冷的DPBS沖洗2次，每次5 min ，再用1% BSA的DPBS 阻斷特異性抗原30 min；處理后的細胞加入一抗兔抗羊-GATA4抗體(1∶200)，在4 ℃孵育過夜后，用DPBS沖洗2次，每次5 min，避光滴加1% BSA的DPBS稀釋的二抗羊抗兔IgG-R(1∶200)，室溫下避光孵育1 h。用DPBS沖洗2次，每次5 min，將細胞密度調至1× 106個/mL，將懸液轉移至流式上樣管中，每個樣品3個重復，同時以IgG熒光標記處理的細胞為陰性對照，4 ℃避光保存，48 h 內上機檢測。

1.6 GSC油紅O染色鑒定

取生長至第5天的GSCs，用0.25% 的胰蛋白酶消化后制成1×105個/mL的細胞懸液，種植于24孔 培養皿中，置37 ℃、5% CO2培養箱中培養。當細胞生長至 70% 融合時，用DPBS沖洗細胞3次， 每次5 min，加入4% PFA固定1 min，油紅O染色液染色10 min，蒸餾水沖洗3次，每次1 min，流水沖洗，顯微鏡下觀察。

1.7 GSC氧化應激水平的測定

將生長至第5天的GSCs，分為6組，每組6個重復，分別加入不同濃度的H2O2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)后，置于培養箱處理4 h后，分別采用試劑盒檢測脂質過氧化產物丙二醛的含量和超氧化物歧化酶的活性，實驗步驟按照說明書進行。

1.8 不同濃度H2O2處理后GSC的DNA倍體檢測

將生長至第5天的GSCs，分別加入不同濃度的H2O2(0、50、100、200、500、1 000 μmol/L)置于CO2培養箱中處理4 h 后，0.25% 胰酶消化細胞成單細胞懸液，收集GSCs至離心管中，調整細胞總數在5×105～1×106之間，1 000 r/min離心5 min，棄上清后加入1 mL DPBS將細胞吹打均勻后，轉移至流式上樣管中，離心后棄上清。按照細胞周期分析試劑盒步驟處理細胞，通過流式細胞儀記錄488 nm激發波長處的紅色熒光，軟件Modfit分析計算出G0/G1，每個樣本重復3次。DNA指數(DI)=(樣本G0/G1期細胞峰的平均熒光道數)/(對照組G0/G1期細胞峰的平均熒光道數)；異倍體判定標準：DI> 1.1或DI<0.9表明出現明顯的異倍體峰[14]。

1.9 統計分析

數據分別采用SPSS17.0軟件的One-way ANOVA方法進行均值差異顯著性分析，用“平均數±標準差”表示。若P值小于0.05，則表示差異水平顯著。

2 試驗結果

2.1 山羊支持細胞的形態學觀察

GSCs原代培養24 h后，細胞貼壁，用Tris-HC1處理之后，細胞形狀呈多角狀且仍存在小而圓的生精細胞(圖1(a))。培養48 h后，大部分生精細胞隨著培養液的更換被去除，且睪丸支持細胞有多個突起，細胞形態不規則(圖1(b))。培養96 h 后，以單層細胞形態逐漸鋪滿平皿，細胞相互交織在一起，生長狀態良好(圖1(c))。

(a) 培養24 h；(b) 培養48 h； (c) 培養96 h。(a) 24 h after culture; (b) 48 h after culture; (c) 96 h after culture.圖1 山羊睪丸支持細胞的原代培養 (標尺= 100 μm)Fig.1 Primary culture of GSCs (Scale bar=100 μm)

2.2 MTT法檢測培養GSC的活性

MTT法檢測支持細胞活性的結果如圖2所示，在培養1～5 d時，山羊支持細胞隨著培養時間的延長而活性增強，至第5天時細胞活性最強；至6～8 d 時，細胞活性隨培養時間延長而活性逐漸下降。所以，培養至第5天時，GSCs可用于后面試驗中的各項檢測。

2.3 GSC流式細胞鑒定

將培養至第5天，GSC通過特異性抗GATA4標記后，通過流式細胞分析見圖3，GATA4陽性細胞可達88.27±3.29%。支持細胞純度較高，達到后續試驗的要求。

圖2 不同培養時間山羊睪丸支持細胞的活性Fig.2 GSC activity in different times of culture

M1，陰性細胞百分比；M2，陽性細胞百分比。M1,percentage of negative cells; M2, percentage of positive cells.圖3 山羊睪丸支持細胞流式細胞鑒定Fig.3 GSCs assay by flow cytometry

2.4 GSC的油紅O染色鑒定

油紅O染色后，在顯微鏡下觀察到多數細胞內均含有紅色的脂滴，懸浮狀聚集或存在于睪丸支持細胞胞質的兩極或散布于核的四周(圖4)，由此表明培養的細胞多數為支持細胞，可以用于后續試驗研究。

2.5 培養液中添加不同濃度的H2O2對GSC細胞存活率及MDA含量和SOD活性的影響

將支持細胞培養至第5天時，用不同濃度的H2O2處理細胞4 h，用MTT法檢測細胞的存活率如圖5(a) 所示，分別為99.19±0.35%、98.43±0.88%、 94.89±3.61%、67.5±6.18%、27.12±2.90% 和24.04±5.13%。當H2O2濃度分別為200、500、1 000 μmol/L時，細胞存活率明顯降低，與對照組相比差異均顯著(P<0.05)， 且在H2O2濃度為200 μmol/L時，細胞存活率開始出現最明顯的降低；添加50 μmol/L和100 μmol/L H2O2后，細胞活度與對照組相比均沒有顯著性差異(P>0.05)。不同濃度的H2O2處理GSCs 4 h后，檢測各組GSC的MDA含量如圖5(b) 所示，當細胞分別用100、200、500、1 000 μmol/L H2O2濃度處理時，MDA含量分別與對照組相比，均具有顯著性差異(P<0.05)；50 μmol/L H2O2處理時，MDA含量與對照組沒有顯著性差異(P>0.05)。SOD活性檢測結果如圖5(c) 所示，培養液中添加100、200、500、1 000 μmol/L的H2O2作用4 h后，SOD活性均與對照組有顯著性差異(P<0.05)， 且在添加100 μmol/L 的H2O2后，開始對細胞造成損傷，隨著添加的H2O2濃度增加，對細胞的損傷程度也增加。

(a) 放大20×; (b) 放大 40×。(a) 20× magnification; (b) 40× magnification.圖4 山羊睪丸支持細胞油紅O染色Fig.4 GSCs assay by Oil Red O staining

* 表示與對照組相比較差異顯著(P < 0.05)。* indicates significant differences compared with the control (P < 0.05).圖5 不同濃度H2O2對GSC存活率、MDA含量和SOD活性的影響Fig.5 Effect of various concentrations of H2O2 on the viability, content of MDA and SOD activity of GSCs

2.6 不同濃度的H2O2對GSC DNA倍體的影響

不同濃度的H2O2處理GSCs 4 h后，采用流式細胞儀檢測GSC的細胞周期，結果表明： 當培養液中添加50 μmol/L H2O2時，細胞DI為1.08±0.01，介于0.9與1.1之間，未出現異倍體；當H2O2濃度分別為100、200、500、1 000 μmol/L時，細胞DI分別為1.15±0.02、1.20±0.03、1.26±0.03、1.32± 0.01，均>1.1，細胞均有異倍體產生。說明培養液中添加100 μmol/L的H2O2作用4 h后，開始對細胞倍體產生了影響，之后隨著添加的H2O2濃度增加，對細胞倍體變化的影響程度也增加(表1)。

表1 不同濃度H2O2處理后的GSC的DNA指數Table 1 DNA index of GSC treated with H2O2 at different concentrations

3 討 論

3.1 GSCs分離純化

睪丸支持細胞的分離純化培養效果會影響到后續試驗和臨床應用效果，所以已有的研究一般采用不同方法對支持細胞進行分離、純化和培養。邱志群等[13]選用未成年大鼠，利用胰蛋白酶和膠原酶2步酶消化法，結合低速離心分離支持細胞，培養48 h 后，用低滲處理培養細胞去除生殖細胞，處理后的支持細胞純度達95%；也有研究者采用1步消化法分離支持細胞進行培養后，再用Tris-HCl處理細胞，分離純化的大鼠支持細胞純度達到90% 以上[15]；用聯酶消化新生牛睪丸再低速離心后去除睪丸間質細胞，然后通過差異貼壁將生殖細胞和支持細胞分開，得到的支持細胞純度約為90%[12]。王帥等[16]分離培養和鑒定了新生和田羊睪丸支持細胞，也取得好的效果。在本研究中選用未成年山羊睪丸作為分離支持細胞的供體材料，是由于這時期動物處于性成熟前，生精細胞處于相對靜止期，而支持細胞在卵泡刺激素的作用下已基本發育成熟，與成年動物睪丸組織相比較，結構更為簡單，有利于支持細胞的分離與培養增殖[13,17]。為了純化支持細胞，利用支持細胞的體積大，易下沉的特點，先用酶初步消化睪丸組織塊，分離間質細胞后，采用低速離心去除懸浮間質細胞，再用第2步酶消化生精小管成細胞懸液，懸液中多數為支持細胞和生精細胞，將混合細胞培養后，再通過低滲處理而消除生精細胞，可提高支持細胞純度[13]，所以本研究參考已有研究結果，采用2步酶消化后，再利用Tris-HCl低滲處理進一步去除生殖細胞，達到純化GSCs目的。通過流式細胞分析發現純化率達到88.27%，純度較高，該方法可用于后續研究。

3.2 GSCs鑒定

油紅O染色具有簡單快速易分辨的優點，可以定性鑒定支持細胞。在本研究中睪丸支持細胞經油紅O 染色后，胞質中散在有大小不一的脂質紅褐色顆粒。通過此方法鑒定含有紅褐色空泡結構的細胞均為睪丸支持細胞。這與前面研究結果一致[13,18]。為了進一步鑒定支持細胞純度，本研究通過流式細胞定量分析鑒定支持細胞數量。GATA-4屬于轉錄因子家族，是睪丸支持細胞的特異表達標志物，但在生精細胞上不表達[19]。已有研究發現，公豬、綿羊、出生后小鼠和初情期前公牛睪丸的支持細胞均有GATA-4表達，因此，可通過GATA-4免疫檢測來鑒定支持細胞[20]。本研究以GATA-4作為山羊睪丸支持細胞標記物，檢測到支持細胞純度達到88.27%，由此推斷支持細胞中仍混有間質細胞或管周細胞等。

3.3 GSCs氧化應激模型建立

細胞在氧化應激狀態下，SOD的活性降低，導致脂質過氧化物裂解，從而使MDA的含量增加，MDA可損傷細胞內的蛋白質結構，誘導細胞發生凋亡[21]。本研究中，隨著培養液中H2O2濃度的增加，GSCs的存活率和SOD活性逐漸降低、MDA含量逐漸增加、染色體損傷和異倍體逐漸明顯，表明GSCs的氧化應激損傷程度增加。當H2O2的濃度為100 μmol/L時，GSCs的存活率>70%。當使用較高濃度的H2O2(500、1 000 μmol/L)處理細胞后，測得的GSCs的存活率均低于50%，大量GSCs死亡。而在200 μmol/L H2O2濃度處理GSCs后，細胞內SOD活性顯著降低，MDA含量顯著增加，并出現了明顯的異倍體，說明細胞發生了一定程度的氧化損傷，同時，GSC的存活率為68%。常小潔等[9]利用250 μmol/L H2O2成功構建了人胎盤滋養細胞的氧化應激模型；也有研究利用100 μmol/L H2O2處理心肌細胞，成功構建了的氧化應激模型[22]；Erdei等[10]利用150 μmol/L H2O2成功構建了干細胞的氧化應激模型。這些模型中，H2O2的濃度差異可能和試驗條件、培養基成分有關，也與不同類型細胞對H2O2敏感度不同等有關。本研究中得出，200 μmol/L H2O2濃度是后期建立GSCs氧化應激模型的最適H2O2濃度。

4 結 論

本試驗通過2步酶消化法分離GSCs，并對其進行純化和培養；進而利用不同濃度的H2O2處理GSCs后，研究H2O2對GSCs產生的氧化應激效果，200 μmol/L H2O2濃度處理GSCs可以達到較好的應激效果，為后期建立GSCs氧化應激模型提供理論依據。