分子病理技術在臨床診療中的應用進展

黃云美 梁菊華 許桂丹

【關鍵詞】 分子病理診斷; 精準醫學;個體化醫療

中圖分類號：R446.8 文獻標志碼：A DOI：10.3969/j.issn.1003-1383.2020.02.013

精準醫療是在科技浪潮的推進下提出的，它通過基因組測序、生物信息、大數據科學等多學科交叉應用，為患者提供更加準確和精細的個體化醫療服務[1]。精準醫療對病理學提出新的挑戰，更是注入了生機，以形態學為基礎的傳統病理診斷技術遠遠不能滿足精準醫學的臨床需求，傳統的病理學技術與分子生物學、信息遺傳學以及蛋白質組學等多學科相互交叉相互滲透形成了分子病理學，可以為臨床提供精準的醫學信息和證據。因而，分子病理診斷是在傳統組織病理學的基礎上結合分子生物學及分子遺傳學的研究成果，并采用相關的分子生物學技術逐漸發展完善起來的交叉學科，該學科主要運用分子和遺傳學方法對腫瘤進行分子病理診斷和分類，設計和驗證能夠反映預測疾病發生、治療敏感性、病情發展等方面的生物標志物，為臨床醫生提供有價值的患者個體化資料，從而做到有針對性的個體化綜合治療。分子病理學使其由傳統形態病理診斷延伸到分子水平上的診斷和臨床治療的全過程，病理學從此邁向更綜合更全面的病理學時代。在個體化醫療時代的驅動下，會有越來越多的分子病理技術被發現并逐步應用于臨床[2～4]。

1 分子病理技術的發展概況

從整體上看，我國的分子病理診斷發展進程與國外基本呈同步趨勢，20世紀80年代的原位核酸分子雜交是我國最早的分子病理診斷技術，國內病理學實驗室首先用32P標記HBV-DNA作為探針，通過雜交反應測定肝炎和肝癌組織中HBV-DNA含量。而地高辛和生物素等非放射性標記技術應運而生，原位雜交技術得到迅速發展并應用于HBV、人乳頭瘤病毒、結核菌、流行性出血熱等檢測中[5]。隨后，越來越多的相關基因被發現，熒光標記原位雜交技術（FISH）、多種標記探針的原位雜交、原位雜交與免疫組化結合技術、Southern雜交等分子病理診斷技術應運而生，我國的分子病理診斷技術得到迅速發展。近幾年，是分子病理診斷蓬勃發展的時期，FISH檢測乳腺癌HER2基因擴增、突變擴增系統（amplification refractory mutation system，ARMS）法檢測肺癌EGFR基因突變、p53基因和K-ras基因的突變等靶向治療與診斷的分子病理技術迅速問世，越來越多的醫院都開展分子病理診斷技術[6～7]。目前，我們醫院也開展了HER-2、TERLALK、TOP2A、1P19Q和ROS1等十幾種FISH基因檢測，同時還開展甲狀腺癌、結直腸癌和肺癌等腫瘤的相關基因檢測，為臨床精準治療和靶向用藥提供了大量準確的依據。

2 分子病理技術的應用進展

2.1 在感染性疾病中的應用

對感染標本直接進行病原微生物DNA或RNA的提取，通過高通量測序后進行生物信息比對和大數據科學分析，獲得致病微生物的詳細種屬信息，為各種感染提供快速精準且全面深入的診斷報告，促進臨床抗生素的合理應用[8]。分子病理技術測定感染源，比培養、血清學和組織學檢測具有更高的靈敏度、特異性以及準確性。目前已應用在感染性疾病診斷及療效判斷的分子病理技術，包括采用原位雜交檢測EB病毒編碼的小RNA，PCR和反向點雜交法檢測乳頭狀瘤病毒DNA，熒光定量PCR技術檢測各型肝炎病毒DNA和RNA、人類單純皰疹病毒DNA、結核桿菌DNA、肺SARS病毒RNA等，這些檢測取得了很好的效果[9～10]。但是，由于分子病理在感染性疾病上的診斷和治療相對延后，目前缺乏深入的基因功能研究，分子病理學迫切需要進一步研究和應用。

2.2 在遺傳性疾病上的應用

分子病理在遺傳性疾病中的應用越來越廣泛。應用原位雜交對染色體和DNA水平進行病理診斷檢測，可以進行組織定位。臨床病理醫生可以通過對患者的染色體、基因檢測進行遺傳病篩查與診斷，預測家族遺傳病的發生。近些年，分子病理學在輔助生殖領域上得到廣泛應用，胚胎植入前進行遺傳學診斷與篩查，準確判斷胚胎染色體是否異常，從而選擇健康的胚胎移植，其主要流程有：①取3～5個發育第3天的卵裂球單細胞或發育第5天的囊胚滋養層細胞進行DNA提取與單細胞擴增;②對質檢達到標準的擴增產物進行文庫制備后再進行高通量測序;③生物信息學對結果進行分析和判讀，判斷胚胎是否正常，為胚胎移植提供參考[11]。目前，國內應用在遺傳性疾病中的分子病理檢測技術主要有高通量測序儀、熒光定量PCR技術、染色體核型分析、免疫組織化學技術、熒光原位雜交技術等，可以輔助進行胚胎植入前和產前遺傳性疾病的篩查，神經系統、遺傳性耳聾基因、生殖系統等診斷與篩查[12～13]。分子病理在遺傳性疾病的應用上取得了巨大的進步，有新的致病基因和遺傳病不斷被發現，逐步應用于產前診斷，甚至應用于基因治療，但是很多醫院條件和發展狀況限制，導致先進的分子病理技術只停留在實驗室水平，沒有能很好地運用于臨床。

2.3 在腫瘤診斷與精準治療中的應用

腫瘤分子病理診斷的其中一個重要方面是惡性腫瘤的靶向基因檢測。目前，靶向基因檢測技術主要有3類：熒光原位雜交方法、實時熒光定量PCR方法和測序法。其中ARMS實時熒光定量PCR，又稱等位基因特異性PCR，采用突變擴增阻滯系統，與雙環探針和特異引物兩種技術結合，從而對含有突變基因的DNA樣品進行檢測。石蠟包埋組織標本提取的DNA大部分被片段化，導致檢測結果缺乏準確性，ARMS法在設計上能夠最大限度地縮短目標產物的長度，從而解決了這一難點。為了避免擴增產物的污染，易于在臨床樣品檢測開展，運用實時PCR平臺與ARMS結合，實現擴增時閉管操作，無需產物的后處理，操作簡單。靶向基因檢測在腫瘤病理診斷中發揮著舉足輕重的作用，因為其具有定位準確、特異性強、敏感性高及形態與功能結合等特點。分子標志物在腫瘤病理診斷中的應用主要有以下幾點：（1）提高病理診斷的準確性;（2）有助于確定腫瘤分期及判斷患者預后;（3）有助于發現微小轉移灶;（4）有助于指導腫瘤患者的治療;（5）有助于遺傳性腫瘤易感家族的輔助診斷;（6）有助于腫瘤相關致病性微生物的發現。腫瘤的診斷與治療是分子病理在臨床應用上最為廣泛的領域，分子病理技術可以檢測基因表達和基因突變，從而評價個體患腫瘤風險，篩選出易感人群，實現腫瘤的早期預防、早期診斷、判斷預后及指導治療，還可對疑難腫瘤進行診斷和分類、個體化診治和預后評估等[14]。目前已知的腫瘤易感基因有視網膜母細胞瘤的Rb1基因突變、Wilms瘤的WT-1基因突變、宮頸癌的hTERC基因突變、家族性腺瘤性息肉（FAP）的APC基因突變、乳腺癌和卵巢癌的BRCA1基因突變、消化道腫瘤的ras基因突變、結直腸癌的KRAS基因突變、非小細胞肺癌的EGFR基因突變等，這些易感基因檢測適合家族中有腫瘤病例的人群[15～16]。我國是一個肝癌大國，目前原發性肝癌發病率和病死率分列我國癌癥的第4位和第3位。應用于治療原發性肝癌的分子靶向藥物索拉非尼，靶點主要為 PDGFR、RAF、KIT和VEGFR，常用于遠處轉移的或治療不能手術切除的肝細胞癌。應用分子病理技術對肝癌進行分子診斷與分型以及肝癌異質性分析，深入揭示肝癌的病因與發病機制，通過分子或基因選擇對靶向治療進行有針對性地殺死惡性腫瘤細胞，具有“高效低毒”的特點，幾乎不影響正常細胞，從而實現個體化治療[17]。肺癌是全球范圍內發病率和死亡率較高的惡性腫瘤之一，隨著分子醫學的進展，我們對肺癌的理解深入到基因層面，特別是肺腺癌，治療方案可以精細到針對基因：EGFR突變肺癌、ALK陽性肺癌、ROS1陽性肺癌、BRAF陽性肺癌等。其中EGFR檢測主要有高通量測序、ddPCR、ARMS等技術，高通量測序的原理是將待測基因打斷成300 bp的DNA片段，通過核酸雜交技術，然后再利用PCR技術進行擴增，通過測序檢測后實現高通量檢測。ddPCR主要包括熒光信號分析和PCR擴增兩部分，可通過分子信標直接檢測出樣品中所含等位基因的數量及比值。ARMS是依據不同的已知突變來設計出對應的引物，進而檢測出有突變基因。根據分子病理診斷技術檢測出某種基因的表達，了解腫瘤是否存在該基因的分子異常，以選擇和確定合適的分子靶向治療，腫瘤基因檢測在一定程度上對臨床診療方案的選擇具有極其重要的決定性以及指導作用，醫生依據每個肺癌患者腫瘤的個體特征進行個體化治療[18～23]。準確的病理診斷是正確靶向治療的前提，基于分子病理的腫瘤多基因檢測的臨床應用，可以輔助醫生靶向用藥并判斷療效。隨著分子靶向藥物的不斷研發和應用，腫瘤的分子靶向治療成為腫瘤治療領域中的研究熱點。在臨床分子病理的諸多技術的腫瘤應用中，高通量將成為首要趨勢，自動化程度也會越來越高[14，24]。然而，分子病理目前仍然處于快速發展的階段，還有很多關鍵的分子機制尚未明確，導致其運用有一定的局限性。如何與常規病理相結合，發揮最大化的診療價值，是目前臨床醫生、病理醫生急需解決的問題。

3 問題與展望

綜上所述，隨著精準醫療的發展日新月異，從分子水平上認識各種疾病病變的性質以及生物學特性，從基因水平上多角度、多方面揭示疾病的發生、發展和轉歸的高特異性和敏感性的分子病理診斷是臨床發展趨勢。分子病理可以實現分子分型，更好地探索疾病的危險因素，提升腫瘤的早期預防、精準診斷、靶向治療、預后判斷以及研究等方面的水平，真正達到個體化治療。分子病理檢測使傳統病理診斷得到有益的發展和補充，兩者互相結合、互相補充可以更精確、更深入和更全面地揭示疾病的本質特征。因此，病理學要不斷吸收生命科學中的技術創新和新發現，努力實現個體化醫療時代的精準病理學要求。分子病理可憑借自身高靈敏度和特異性強的優勢不斷提高診療效果，指導多種疾病的個體化治療，不斷推動精準醫學的發展進程[25～27]。

參 考 文 獻

[1]劉智賢，劉漢忠.精準醫學時代下臨床病理發展趨勢[J].科技經濟導刊，2018，26（13）：127.

[2]張波.病理學在精準醫療時代的發展[J].精準醫學雜志，2018，33（2）：98-101.

[3]張志麗.分子病理學的發展現狀[J].基層醫學論壇，2018，22（16）：2291-2292.

[4]謝豐培，石宇，李連宏，等.中國精準醫學發展需要大力加速病理學科建設[J].臨床與實驗病理學雜志，2018，34（1）：4-6.

[5]王伯，陳子馨，吳璥.我國病理技術四十年來的進展[J].中華病理學雜志，1995，24（4）：258-260.

[6]李寅.分子病理診斷的現狀與思考[J].世界最新醫學信息文摘，2018，18（65）：39，41.

[7]譚娜，鄭洪，黃佳佳，等.腫瘤的分子病理診斷及臨床意義研究進展[J].臨床檢驗雜志（電子版），2018，7（2）：365.

[8]Lefterova MI，Suarez CJ，Banaei N，et al.Next-Generation Sequencing for Infectious Disease Diagnosis and Management：A Report of the Association for Molecular Pathology[J].J Mol Diagn，2015，17（6）：623-634.

[9]Payne DA，Baluchova K，Russomando G，et al.Toward harmonization of clinical molecular diagnostic reports：findings of an international survey[J].Clin Chem Lab Med，2018，57（1）：78-88.

[10] Hofman P，Lucas S，Jouvion G，et al.Pathology of infectious diseases：what does the future hold？[J].Virchows Arch，2017，470（5）：483-492.

[11] Meduri G，Bachelot A，Cocca MP，et al.Molecular pathology of the FSH receptor：new insights into FSH physiology[J].Mol Cell Endocrinol，2008，282（1-2）：130-142.

[12] Song Y，Huang S，Zhou X，et al.Non-invasive prenatal testing for fetal aneuploidies in the first trimester of pregnancy[J].Ultrasound Obstet Gynecol，2015，45（1）：55-60.

[13] Dey N，Williams C，Leyland-Jones B，et al.Mutation matters in precision medicine：A future to believe in[J].Cancer Treat Rev，2017，55：136-149.

[14] Schildgen V，Schildgen O.The lonely driver or the orchestra of mutations？ How next generation sequencing datasets contradict the concept of single driver checkpoint mutations in solid tumours-NSCLC as a scholarly example[J].Semin Cancer Biol，2019，58：22-28.

[15] Huntsman DG，Ladanyi M.The molecular pathology of cancer：from pan-genomics to post-genomics[J].J Pathol，2018，244（5）：509-511.

[16] Dietel M.Molecular Pathology：A Requirement for Precision Medicine in Cancer[J].Oncol Res Treat，2016，39（12）：804-810.

[17] Sergi CM.Hepatocellular Carcinoma，Fibrolamellar Variant：Diagnostic Pathologic Criteria and Molecular Pathology Update.A Primer[J].Diagnostics （Basel），2015，6（1）.pii：E3.

[18] 葉佳丹，余克富，朱斌，等.腫瘤靶向藥物的分類與研究進展[J].藥學進展，2018，42（5）：351-358.

[19] 丁宜，黃嘯原，田偉.骨腫瘤的分子病理診斷[J].診斷病理學雜志，2018，25（5）：321-324.

[20] Mairinger T.Histology，cytology and molecular diagnostics of lung cancer[J].Pathologe，2019，40（6）：649-661.

[21] Scheie D，Kufaishi HHA，Broholm H，et al.Biomarkers in tumors of the central nervous system-a review[J].APMIS，2019，127（5）：265-287.

[22] Dietel M，Johrens K，Laffert MV，et al.A 2015 update on predictive molecular pathology and its role in targeted cancer therapy：a review focussing on clinical relevance[J].Cancer Gene Ther，2015，22（9）：417-430.

[23] Hench J，Jermann PM，Bratic Hench I，et al.[Current methods in molecular pathology] [J].Ther Umsch，2019，76（4）：173-178.

[24] Deans ZC，Costa JL，Cree I，et al.Integration of next-generation sequencing in clinical diagnostic molecular pathology laboratories for analysis of solid tumours;an expert opinion on behalf of IQN Path ASBL[J].Virchows Arch，2017，470（1）：5-20.

[25] 張波.精準醫療時代的病理學發展[J].協和醫學雜志，2017，8（2-3）：117-121.

[26] 羅莉.精準醫學與臨床病理學的發展[J].武警醫學，2016，27（2）：109-112.

[27] 董賀，孫青.分子病理學技術在腫瘤診治中的應用[J].分子診斷與治療雜志，2015，7（2）：73-77，82.

[28] Dietel M.Molecular Pathology：A Requirement for Precision Medicine in Cancer[J].Oncol Res Treat，2016，39（12）：804-810.

（收稿日期：2019-10-21 修回日期：2019-12-06）

（編輯：潘明志）