直鏈淀粉晶種對淀粉回生的影響機制

朱碧驊，麻榮榮，田耀旗*

1(江南大學 食品科學與技術國家重點實驗室，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

糊化淀粉在冷卻和貯藏中，直鏈淀粉和支鏈淀粉通過氫鍵重新排列成有序微晶的過程，稱為淀粉回生(老化)，其實質是淀粉分子鏈在氫鍵等分子間作用力的驅動下從無序到有序的排列[1-2]。淀粉老化是導致市場上面包、蛋糕、米糕等米面制品風味劣變，口感變差，貨架期縮短的主要原因[3]。目前對于回生的研究多集中于外源調控方面，缺乏回生不同階段間關系的解析[4-5]。直鏈淀粉主導的短期回生和支鏈淀粉主導的長期回生階段之間的關系問題，是米面制品抗回生技術調控的共性理論基礎。研究認為短期回生為長期回生提供了“啟動子”，但是由于回生體系復雜及研究手段局限，該理論尚未得到系統闡述。聚合物結晶的經典動力學模型指出，結晶包括成核、生長和形成完美晶體3個過程。在淀粉的重結晶體系中，回生的本質也是成核和晶體生長的過程。因此，晶核是淀粉回生研究的切入點與重要因子，是回生共性理論突破的關鍵。

基于此，本文在大米淀粉回生過程中，添加短期回生階段形成的晶種，簡化回生研究體系，誘導淀粉長期回生。通過FTIR和13C CP/MAS NMR來探究其對淀粉長期回生的影響，以期揭示淀粉短期回生與長期回生階段之間的關聯性，豐富淀粉回生共性理論。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

大米淀粉，江西金農發展有限公司；正丁醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；異戊醇(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；濃H2SO4(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司；KBr(分析純)，國藥集團化學試劑有限公司。

1.2 儀器與設備

Nano Brook Omni型多角度粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀，美國布魯克海文儀器公司；IS10傅里葉紅外光譜儀，美國Nicolet公司；AVIII 400 MHZ WB光譜儀，德國Bruker公司。

1.3 實驗方法

1.3.1 直鏈淀粉晶種的制備及粒度測定

參考程科等[6]的方法并加以優化，從大米淀粉(直鏈淀粉含量為12.2%)中提取直鏈淀粉。用去離子水配制200 g/L的淀粉乳，攪拌均勻后置于沸水浴中預糊化30 min，然后于121 ℃的高壓滅菌鍋中繼續糊化20 min。糊化完成后立即取出，分別在-80、-18、4和25 ℃環境中以不同的平均降溫速率(依次為6.71、3.00、1.78和0.75 ℃ /min)冷卻，降溫至25 ℃之后，轉移至25 ℃下保溫回生，冷卻和保溫回生過程持續12 h，制備獲得的樣品依次命名為RA-80、RA-18、RA4和RA25。上述4種樣品回生完成后干燥，研磨后過篩，用3.16 mol/L濃H2SO4配制固形物含量為10%的晶種酸解液，在45 ℃下攪拌水解7 d，離心洗滌至中性，將產物配成30 g/L的懸濁液保存得到直鏈淀粉晶種，依次命名為ACS-80、ACS-18、ACS4和ACS25。

將30 g/L直鏈淀粉晶種懸濁液稀釋至1 g/L，超聲10 min以破除顆粒團聚。超聲完成后，立即轉到電位儀的樣品池中，進行粒度測定。

1.3.2 無定形淀粉、回生淀粉的制備

將原淀粉配成100 g/L的淀粉乳，在沸水浴中加熱糊化30 min，然后立即轉移至60 ℃烘箱中烘干，研磨，過篩，得到無定形淀粉(AS)。

配制100 g/L的淀粉乳，置于沸水浴中糊化30 min，然后冷卻至60 ℃時，按7%的晶種添加量加入直鏈淀粉晶種并攪拌均勻。未添加晶種的原淀粉體系為空白對照組(kb)。所有的樣品貯藏在4 ℃下回生21 d后取出，烘箱烘干，研磨，過篩，置于密封袋中備用。空白對照組樣品命名為kb-21，添加ACS-80, ACS-18, ACS4和ACS25的回生淀粉依次命名為ACS-80-21, ACS-18-21, ACS4-21和ACS25-21。

1.3.3 直鏈淀粉干預下的回生淀粉的短程有序度及雙螺旋含量測定

采用FTIR測定回生淀粉的短程有序度。在紅外燈照射環境下，將回生淀粉樣品和預先磨細的溴化鉀以1∶20(質量比)混合，用瑪瑙研缽研磨至合適粒度后，壓成厚薄適中的壓片。實驗參數如下：掃描波長為4 000～ 400 cm-1，分辨率為4 cm-1，掃描次數為16，純KBr壓片為空白背景。使用OMNIC軟件對紅外光譜進行去卷積處理。

利用13C CP/MAS NMR測定回生淀粉中雙螺旋含量。實驗參數如下所示：儀器工作頻率為100.62 MHz，配有4 mm的雙共振探頭，以六甲基苯作校準液，樣品采集時間為0.016 s，接觸時間1.6 ms，掃描次數1 600次。延遲時間2 s，轉速6 kHz。使用Excel、Origin和Peakfit軟件對數據進行分析。

2 結果與分析

2.1 直鏈淀粉晶種粒度分析

動態光散射(dynamiclight scattering,DLS)法根據激光照射溶液體系中做布朗運動的顆粒產生的動態散射光來獲取粒徑信息。當激光照射懸浮液時，其中的顆粒會使激光發生散射，顆粒受周圍分子的碰撞而發生布朗運動[7]。根據多普勒效應，散射光頻率受入射光頻率影響，以其為中心隨機波動，從而影響散射光強。一般來說，顆粒粒徑小，布朗運動速度快，散射光頻率變化快，散射光強波動也快；反之，則慢。進行相關函數運算可得粒徑信息。

由DLS法得到的直鏈淀粉晶種的粒度結果如表1所示，ACS-80、ACS-18、ACS4及ACS25的平均粒度分別為438.61、303.78、246.42及279.43 nm，粒徑均為納米級。大米淀粉在已知谷物里顆粒最小，粒徑為4～9 μm，形狀為不規則多邊形。在加熱糊化過程中，淀粉分子鏈吸熱膨脹，變成無規則團狀。在回生前加入的納米級的直鏈淀粉晶種，可以順利進入其內部，與淀粉分子鏈充分接觸，起到誘導作用。

表1 直鏈淀粉晶種的粒度參數Table 1 The particle size parameters of amylose crystal seeds

注：ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25：依次為在前期降溫環境溫度-80、-18、4、25 ℃下冷卻后經處理制備得的直鏈淀粉晶種。同一行中具有不同小寫字母之間存在顯著差異(P<0.05)

2.2 直鏈淀粉晶種干預下的回生淀粉短程有序度分析

淀粉回生過程中形成的雙螺旋結構構成回生淀粉的短程有序結構。本實驗通過FTIR研究回生淀粉的短程有序結構。由圖1-a可以看出，加入晶種后回生淀粉特征吸收峰沒有發生變化，說明在原淀粉中加入直鏈淀粉晶種不會改變回生淀粉的官能團。

a-紅外光譜圖；b-去卷積圖；kb-21-未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21-依次為添加ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉，下同圖1 直鏈淀粉晶種干預下的回生淀粉的傅里葉紅外光譜圖及去卷積圖Fig.1 The Fourier transform infrared spectroscopy and deconvolution graph of retrograded starch under the intervention of amylose crystal seeds

對回生淀粉的紅外光譜圖進行去卷積處理，得到結果如圖1-b所示。1 047和1 022 cm-1分別代表淀粉的結晶區和無定形區，995 cm-1處的吸收峰則對應羥基的彎曲振動[8-9]。淀粉研究中常用1 047和1 022 cm-1的吸光度之比(1 047 cm-1/1 022 cm-1)及1 022 cm-1和995 cm-1的吸光度之比(1 022 cm-1/995 cm-1)表征淀粉的短程有序度。樣品紅外光譜去卷積之后的比值結果如表2所示。直鏈淀粉晶種干預下回生淀粉1 047/1 022 cm-1升高，1 022/995 cm-1降低。表明在回生過程中，直鏈淀粉晶種的添加提高了回生淀粉的短程有序度，促進了淀粉的長期回生。此外，ACS4干預下的回生淀粉的短程有序度最高，促進長期回生效果最顯著。原因可能是降溫速率快時，分子鏈遷移受阻礙，影響直鏈淀粉有序重排進而影響晶種的結晶效果。但在單一貯藏溫度環境中，B-型淀粉的重結晶過程受到成核的強烈限制，在最適合成核溫度附近大米淀粉重結晶程度最高[10]，而其最適成核溫度為4℃，所以ACS4的結晶效果最好，其后依次為ACS25、ACS-18和ACS-80。結晶效果好的晶種在干預淀粉回生時可以起到更好的誘導作用，促進淀粉長期回生。

表2 直鏈淀粉晶種干預下的回生淀粉的短程有序參數Table 2 The short-range ordered parameters of retrogradedstarch under the intervention of amylose crystal seeds

注：kb-21: 未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21：依次為加入ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉;同一列中具有不同小寫字母之間表示存在顯著差異(P<0.05)

2.3 直鏈淀粉晶種干預下的回生淀粉雙螺旋含量分析

相較于X射線衍射所得的具有較大范圍(結晶度)的結構信息，固態13C-核磁共振技術(13C-NMR)是對淀粉分子序列短距離范圍的探測，檢測范圍較窄。各種淀粉的核磁共振光譜圖相似，按化學位移分主要分為C1、C4、C2,C3,C5和C6四個區域。B-型淀粉雙螺旋結構中具有兩個葡萄糖殘基，在C1區域中為雙重峰，如圖2所示。由于C1～C5信號的相對強度對施加的交叉極化接觸時間的持續時間不敏感，因此可以通過計算結晶區的峰面積與回生淀粉的峰面積之比得出樣品中結晶結構的相對含量。

C4-PPA法中淀粉的核磁圖譜分成由雙螺旋結構組成的結晶區和無定形區兩部分，而忽略了其中單螺旋結構的存在，具有局限性。因此在本實驗中，運用差減法去除由于C1共振而在有序環境中產生的重疊的非晶信號，將回生淀粉的核磁共振光譜圖分解為無定形亞譜和結晶亞譜。由于C4區的峰較獨立，與其他峰不重疊，故差減法中常選擇其附近的點作為校準參考點[11]。分別選取82，83，84和85 ppm為參考點，差減法得到的結晶亞譜如圖3所示。以85 ppm為參考點得到的結晶亞譜在一定區域中峰值強度比其他3個參考點得到的結晶亞譜強度高，所以選定85 ppm為參考點處理回生淀粉的核磁圖譜。

AS-無定形淀粉；kb-21-未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21-依次為添加ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉圖2 回生淀粉樣品及無定形淀粉的原始13C CP/MAS圖譜Fig.2 Original 13C CP/MAS mapping of retrograded starch samples and amorphous starch

a-添加ACS-80的回生21d淀粉；b-添加ACS-18的回生21d淀粉；c-添加ACS4的回生21d淀粉；d-添加ACS25的回生21d淀粉；e-未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉圖3 分別以82、83、84和85 ppm為參考點用差減法得到的回生淀粉的結晶區亞譜Fig.3 The crystalline sub-spectra of retrograded starch was obtained by using spectral subtraction using 82，83，84 and 85 ppm as reference point, respectively

C1區域(94～ 105 ppm)中沒有來自其他碳位的重疊信號，鏈構象和糖苷扭轉角之間關系更直觀，所以選擇C1區來計算淀粉樣品中的雙螺旋含量。C1區中結晶亞譜又分為單螺旋和雙螺旋兩部分，其中103 ppm處的峰為V-型結晶構象峰，通過峰面積之比來求出單螺旋和雙螺旋相對比例。參考TAN等[11]的方法計算雙螺旋含量，結果見表3。由表3可以看出，與空白對照組相比，實驗組的雙螺旋含量有所提高，表明直鏈淀粉晶種的干預可以促進回生淀粉雙螺旋的形成。其原因是酸解法制備直鏈淀粉晶種過程中去除大部分無定形區，從而暴露出更多的結晶區，在加至原淀粉中干預回生的過程中，可以與原淀粉中支鏈淀粉外支鏈間快速重排，從而形成更多的雙螺旋結構。其中添加ACS4的回生淀粉雙螺旋含量最高，其次是添加ACS25和ACS-18，最低的則為添加ACS-80的回生淀粉。這也說明ACS4結晶效果更好，其與支鏈淀粉外支鏈間重排阻力小，促進雙螺旋形成效果更好。

表3 13C CP/MAS-NMR中各樣品C1峰面積及雙螺旋含量Table 3 The C1 peak area and double-helix content of samples in 13C CP/MAS-NMR

注：#kb-21未添加直鏈淀粉晶種的回生21d淀粉；ACS-80-21、ACS-18-21、ACS4-21、ACS25-21依次為加入ACS-80、ACS-18、ACS4、ACS25的回生21d淀粉

3 結論

通過酸解法制備的直鏈淀粉晶種，粒徑在200～450 nm。直鏈淀粉晶種導致大米淀粉長期回生過程中，回生淀粉的短程有序度提高、雙螺旋含量增加，表明短期回生中形成的晶核對長期回生起促進作用。此外，淀粉短期回生階段降溫速率也會對回生晶核的形成及完善產生影響，進而影響長期回生的程度。這種晶體協同增長現象，豐富了淀粉回生共性理論。