雙柱在線凈化系統快速檢測動植物油脂中的苯并(a)芘

梁劍鋒，李亞，梁燕妮，卓梅芳，楊韶平

(梧州學院 化學工程與資源再利用學院，廣西 梧州， 543002)

苯并(a)芘，是一種常見高活性間接致癌物，被國際衛生組織列為Ⅰ類致癌物質[1-4]。近兩年食品安全抽檢結果顯示，我們日常食用的油脂如花生油、芝麻油、棉籽油、菜籽油、葵花籽油等都存在苯并芘超標現象。據相關研究報道[5-10]，食用油脂受到苯并(a)芘污染主要有以下3個途徑：(1)油料、成品在生產過程中接觸食品加工機械潤滑油；(2)油料在干燥環節接觸瀝青；(3)油料在存儲過程中發生了霉變而產生苯并(a)芘，隨后在加工過程中帶入食用油脂產品。因此，研究食用油脂中苯并(a)芘快速檢測方法，對了解并控制其對食用油脂污染及保障公眾食品安全具有十分重要的意義。

目前，食品中苯并(a)芘的檢測方法主要有高效液相色譜法、氣相色譜-質譜聯用法、液相色譜-質譜聯用法、免疫學法、薄層色譜法、熒光分光光度法等[11-15]。采用國標方法GB 5009.27—2016對食用油脂進行前處理并檢測其苯并(a)芘含量時，由于實驗過程需要苯并(a)芘分子印跡柱凈化﹑氮吹儀濃縮等手工操作步驟，而且由于使用二氯甲烷高毒害性有機試劑作為溶劑，導致操作分析時間過長且消耗大量有毒有害有機溶劑[16]。近年來，在線凈化與超高速液相色譜儀聯用技術已在食品安全檢測分析中得到應用[17-20]，該技術具有凈化與檢測一體化、自動化程度高等優點。本研究建立在線凈化與超高速液相色譜儀聯用并應用于食用油脂中苯并(a)芘檢測，其原理為通過2個不同色譜柱聯用，分別完成對食用油脂的凈化與檢測工作，整個試驗無需使用高毒性有機試劑與價格昂貴的固相小柱，樣品提取過程方便快捷，具有經濟、高效、對環境友好、自動化程度高等優點。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

市場上售賣的豬油、土榨花生油、茶籽油、大豆油、調和油；正己烷、二氯甲烷、乙腈、異丙醇(色譜級)，德國CNW公司； 苯并(a)芘專用 SPE 印跡柱(500 mg，6 mL)，博納艾杰爾科技有限公司；濃度苯并(a)芘標準溶液(20±0.038)μg/mL)：農業部環境保護科研監測所。

1.2 儀器

XS105du 電子天平，瑞士梅特勒公司； ST16R離心機，美國熱電公司；J2正壓固相萃取，北京普利泰科儀器有限公司；1290 Infinity液相色譜儀(包括2個高壓二元泵、一個六通閥)，美國安捷倫科技有限公司；Kromasil 反C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，瑞典阿克蘇諾貝爾公司；ChromSpher Pi色譜柱(80 mm×3.0 mm,5 μm)，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 雙柱在線凈化檢測原理

雙柱在線凈化檢測系統實現了樣品在線凈化與檢測的自動一體化，其運行步驟：第1步中的，樣品由自動進樣器進樣后，進入第1根色譜柱進行初步的分離與富集，將樣品中大部分非目標物質、雜質分離，然后將樣品(500 μL)中的目標物苯并(a)芘分析物在色譜柱上進行富集，其間分離出來的雜質組分不進入檢測器，而是經閥門直接進入廢液池；第2步,進樣一段時間后，系統中六通閥進行切換，將第1根色譜柱流出的組分進入第2根色譜柱進行分離、檢測，同時由于系統流動相的變化，在第1根色譜柱上富集的苯并(a)芘進行洗脫進入第2根色譜柱分析，并在第2根色譜柱進一的分離后進入熒光檢測器檢測含量。

1.4 試驗方法

1.4.1 標準曲線繪制

用正己烷-異丙醇(體積比1∶1)將(20±0.038)μg/mL苯并(a)芘標準溶液稀釋至50 ng/mL的苯并(a)芘標準溶液中間液，然后再用正己烷-異丙醇(體積比1∶1)逐級稀釋濃度為1.0、2.5、5.0、7.5、10.0、20 ng/mL的標準工作液，現配現用。

1.4.2 樣品前處理方法

稱取均勻樣品2.50 g置于15 mL離心管中，加入正己烷-異丙醇溶液(體積比1∶1)并至5.00 mL，搖勻，用渦旋器混合1.0 min，然后放入設置條件為4 000 r/min、4 ℃冷凍離心機離心4 min，取出后吸取溶液的上清液，用0.22 μm有機相微孔濾膜過濾，濾液待測。

1.4.3 色譜條件

系統中第1根色譜柱(Kromasil 反C18柱)色譜條件：流動相，乙腈-水(體積比80∶20)，流速：1.0 mL/min，柱溫40 ℃；第2根色譜柱(ChromSpher Pi)色譜條件：流動相，異丙醇-乙腈(體積比65∶35)，流速：1.2 mL/min。柱溫40 ℃；檢測器：FLD(熒光)檢測器；發射波長：406 nm；激發波長：384 nm。進樣量500 μL(500 μL定量環)。

2 結果與分析

2.1 系統中六通閥切換時間考察

第1根色譜柱采用Kromasil反C18(4.6 mm×150 mm，5 μm)柱，其負責分離樣品中的雜質和富集苯并(a)芘。通過流動相比例變化將第1根色譜柱富集的樣品中的苯并(a)芘洗脫至第2根色譜柱進行分離、檢測，第2根色譜柱采用苯并芘分析專用色譜柱安捷倫ChromSpher Pi柱。當第1根色譜柱以乙腈-水(體積比80∶20)為流動相時，樣品與苯并(a)芘標準物質所得色譜圖見圖1。

圖1 第1根色譜柱系統中樣品與苯并(a)芘標準溶液色譜圖Fig.1 Standard solution chromatogram of sample and benzo(a) pyrene in the first column system

由圖1可見，樣品中非目標物質在3 min內流出第1根色譜柱，樣品中目標分析物苯并(a)芘流出的時間約為3.3 min后，在第1根色譜柱中待分析物與基體雜質基本能夠分離。因此在線凈化系統中六通閥切換到第2根色譜柱時間確定為3.5 min。如切換系統早于3.5 min，則導致進入第2根色譜柱的非目標物較多，從而引起檢測結果偏高；而如果將閥門切換時間確定在3.5 min之后，樣品中目標物苯并(a)芘流入廢液池，導致方法的回收率降低、結果偏低。

2.2 方法學考察

2.2.1 線性范圍的測定

以標準溶液濃度為橫坐標(X)、標準物質熒光峰面積為縱坐標(Y)繪制標準曲線，進而得到線性回歸方程及線性相關系數和范圍。該試驗方法的苯并(a)芘在1.0～20.0 ng/mL(濃度范圍與國標方法一致)時樣品濃度與響應值之間呈線性關系，其線性回歸方程為Y=1.872 8X-0.038 5，相關系數r2為0.999 6，具有良好線性關系。

2.2.2 檢出限的測定

準確稱取樣品2.50 g，加入0.10 mL的1.3配制的質量濃度為50 ng/mL的苯并(a)芘標準溶液中間液。按照1.4的前處理方法處理樣品，即為其檢出限，信噪比S/N=4.5。

檢出限為各化合物的3倍信噪比即(S/N=3)即被定為最低檢出限(LOD)，測得數據顯示，檢出限苯并(a)芘信噪比S/N>3，可以確定方法的檢出限在0.08 μg/kg，優于國家標準中0.1 μg/kg要求。

2.2.3 樣品的測定

從市場上購買5份動植物油脂樣品，分別采用雙柱在線凈化檢測系統和國標GB 5009.27—2016進行測定，每份樣品重復測定6次，2種方法檢測結果分別見表1。

表1 實際樣品檢測結果(n=6)Table 1 Test results of actual samples

從以上5份實際樣品檢測結果中，考察在線凈化系統與國標方法2種方法在分析結果、標準偏差、變異系數等，本文雙柱在線凈化檢測系統在檢測結果、標準偏差、變異系數與國標方法測定方法相近。

2.2.4 方法回收率與精密度

對市場上購買的常見5種動植物油脂中添加苯并(a)芘標準溶液，分別進行1、5、10 μg/kg三個水平添加，每個添加水平測定6次，分別采用雙柱在線凈化檢測系統與國標GB 5009.27—2016方法測定并計算回收率和精密度，試驗結果見表2、表3。

表2 本文試驗方法的回收率、精密度測定結果(n=6)Table 2 The results of recovery and precision measurementof the test method in this paper

從以上測定結果可以看出，雙柱在線凈化系統方法回收率均在82.0%～91.6%，相對標準偏差(RSD)為1.89%～4.29%，與國標方法的回收率、相對標準偏差接近，雙柱在線凈化系統試驗結果符合GB/T 27404—2008《實驗室質量控制規范 食品理化檢測》中回收率和精密度的要求，滿足含量在μg/kg級別的動植物油脂檢測要求[21]，表明該方法適用于動植物油脂中苯并(a)芘的檢測。

表3 國標GB 5009.27—2016方法的回收率、精密度測定結果(n=6)Table 3 The results of recovery and precision of GB 5009.27—2016 method

3 結論

本試驗采用雙柱在線凈化分析系統，實現分析樣品高度自動化，樣品加入正己烷、異丙醇溶劑提取、過濾后可直接進樣分析，系統首先利用第1根色譜柱對樣品進行凈化與苯并(a)芘目標物質富集，經過3.5 min后利用六通閥將組分切換到系統中的第2根色譜柱，目標物進一步得到分離與檢測，整個試驗實現了凈化與檢測一體化，自動化程度高，無需使用有毒有機溶劑，對操作者與環境友好。雙柱在線凈化分析系統在精密度、回收率等指標與國家標準方法GB 5009.27—2016接近，檢出限優于國家標準，本系統可應用于常見動植物油脂如豬油、土榨花生油、茶籽油、大豆油、調和油等易受苯并(a)芘污染的樣品快速檢測。