ε-聚賴氨酸對鮮榨血橙汁貯藏品質的影響

王換男，卿琳華，童群義

(江南大學 食品學院，江蘇 無錫，214122)

柑橘類水果是世界第一大水果，并且是位于小麥、玉米之后的第三大貿易農產品[1]。其中有近2/5的柑橘用于加工成汁。血橙為柑橘屬橙種，我國主要種植的血橙品種為來自意大利的塔羅科。其個頭大，果肉細膩多汁，口感酸甜適中，無核，營養價值非常高[2]。近年來，由于我國經濟增速放緩，果汁行業產品創新性低，加之其以低濃度果汁為主的不合理產品結構導致消費者消費欲望降低。隨著人均GDP的不斷上升，人們的生活態度也發生著翻天覆地的變化，更注重高膳食纖維、高蛋白的健康營養飲食習慣。高濃度果汁在果汁飲料零售量中僅占5%左右，鮮榨血橙汁是一種可以很好地保留血橙本身的營養物質和酸甜可口味蕾體驗的高濃度果汁，但其貯藏期短仍是限制其銷量和規模化市場推廣的主要原因。在4 ℃冷藏條件下，采用向鮮榨血橙汁中添加ε-聚賴氨酸的方式減少巴氏殺菌、瞬時殺菌、超聲微波殺菌對營養成分的損耗，從而提高對鮮榨血橙汁營養成分的保留并延長其貨架期。

ε-聚賴氨酸(ε-poly-L-lysine)以下簡寫為(ε-PL)是從鏈霉菌屬的代謝分泌產物中得到的天然食品添加劑[3]。其具有廣譜抑菌性[4]、廣泛的pH使用范圍、耐高溫、溶水性強、協同增效性強、安全性高[5]等優勢。2014年ε-聚賴氨酸被正式列入中國食品添加劑名錄，在《食品添加劑使用標準》中明確規定可應用于焙烤食品、熟肉制品、果蔬汁類制品[6]，且規定限量均為0.2 g/L(以下均寫為200 μg/mL)。

本文以鮮榨血橙汁為研究對象，探究在貯藏期內鮮榨血橙汁理化指標、感官指標、微生物指標的變化以及ε-聚賴氨酸對鮮榨血橙汁中優勢腐敗菌群的抑菌效果。以ε-聚賴氨酸的防腐保鮮功能為基礎，為日后鮮榨果汁的規?；A藏提供一些理論研究。以ε-聚賴氨酸在人體內可以被分解為賴氨酸的保健功能為依據，為改善當前國內果汁產品結構提供一種新思路。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

血橙，湖北宜昌；ε-聚賴氨酸(99.5%)，河南鄭州拜納佛生物工程股份有限公司；0.1 mol/L NaOH標準溶液，上海麥克林生化科技有限公司；YPD固體培養基、LB液體培養基，國藥集團化學試劑有限公司；釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，酸土脂環酸芽孢桿菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)，大腸桿菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)，源自于實驗室保藏菌種。

BAM培養基：CaCl20.25 g，MgSO40.50 g，(NH4)2SO40.20 g，酵母粉 2.00 g，葡萄糖 5.00 g，KH2PO43.00 g，蒸餾水1 000 mL，pH 4.0。

1.2 儀器與設備

原汁榨汁機，德國貝爾斯頓；實驗室pH計，梅特勒-托利多國際貿易(上海)有限公司；阿貝折光儀，上海精密科學儀器有限公司；高精度分光測色儀，美國Hunterlab公司；氣相色譜質譜聯用儀，日本島津公司；Agilent 1100高效液相色譜儀，美國安捷倫科技有限公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備

鮮榨血橙汁實驗室制備工藝流程：

1.3.2 微生物指標測定

1.3.2.1 不同ε-聚賴氨酸添加量對鮮榨血橙汁的抑菌效果

實驗室自制鮮榨血橙汁與家庭自制鮮榨血橙汁潔凈程度相當，為提高鮮榨血橙汁的衛生質量，向鮮榨血橙汁中加入25、50、100、200、400 μg/mL的ε-聚賴氨酸，以不加ε-聚賴氨酸的鮮榨血橙汁為對照組。按照《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 菌落總數測定》(GB 4789.2—2016)[7]中給出的方法進行測定。

1.3.2.2 ε-聚賴氨酸對鮮榨血橙汁中優勢腐敗菌的最小抑菌濃度及生長曲線的影響

參照賈振宇等[8]的試驗方法，將酸土脂環酸芽孢桿菌、釀酒酵母分別在45、30 ℃下培養至生長對數期的菌懸液經4 000 r/min，離心10 min，并棄掉上清液。用生理鹽水重復洗滌2次，最后用生理鹽水重懸菌體，使重懸菌液濃度在106CFU/mL左右。采用二倍梯度稀釋法配制一系列濃度梯度的ε-聚賴氨酸溶液，并參照SU等[9]的實驗方法進行MIC測定。并結合1.3.2.1中抑菌效果來確定鮮榨血橙汁中ε-聚賴氨酸的最適添加量。

按照上述前處理步驟處理菌懸液，選取1/2×MIC、MIC、2×MIC、4×MIC的ε-聚賴氨酸溶液，與培養基及菌懸液混合。24 h內，每隔2 h取樣1次，用酶標儀測定OD600下的吸光度，并繪制生長曲線。

1.3.2.3 鮮榨血橙汁在貯藏期內酵母菌、霉菌及菌落總數的變化

參照1.3.2.1中菌落總數測定方法以及《食品安全國家標準 食品微生物學檢驗 霉菌和酵母計數》(GB 4789.15—2016)[10]，在平板計數瓊脂培養基以及馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基上涂布、計數。

1.3.3 鮮榨血橙汁在貯藏期內色值及呈味物質測定

參照張夢月[11]及郭莉等[2]的試驗方法并稍加改動測定鮮榨血橙汁的色差值(ΔE)和呈味物質。吸取20 mL樣品加入比色池，用高精度分光測色儀進行色差值測定。取2 mL樣品，2 g NaCl，4 mL蒸餾水于固相微萃取專用樣品中，采用頂空-固相微萃取-氣質聯用技術(HS-SPME-GC-MS)進行呈味物質測定。

1.3.4 理化指標測定

1.3.4.1 鮮榨血橙汁在貯藏期內可滴定酸、pH、可溶性固形物的測定

參照《柑桔鮮果檢驗方法》(GB/T8210—2011)[12]和張夢月[11]的試驗方法，測定鮮榨血橙汁的可滴定酸(titratable acid，TA)、pH、可溶性固形物(soluble solid,SS)。

1.3.4.2 鮮榨血橙汁在貯藏期內可溶性糖的測定

參照李申[13]的試驗方法，吸取3 mL樣品加入7 mL 95%乙醇進行4 000 r/min，10 min離心后，取上清液，0.22 μm水系微孔濾膜處理后，采用高效液相色譜法測定0 d、15 d蔗糖、葡萄糖、果糖的含量變化。

1.3.4.3 鮮榨血橙汁在貯藏期內游離氨基酸的測定

參照李申[13]的試驗方法，取1 mL樣品用10 g/100mL三氯乙酸對樣品進行等體積稀釋，經雙層濾紙過濾，在通過15 000 r/min，30 min離心，取上清液，經過0.22 μm水膜在過濾，最后裝400 μL上清液于液相專用樣品瓶，采用高效液相色譜法測定0、5、10、15 d游離氨基酸的含量變化。

1.3.5 數據統計與分析

每次試驗重復3次,且每組有3次平行實驗，用Excel初步記錄與統計數據。利用Origin 2019與SPSS 23數據處理軟件進行作圖及單因素方差分析進行顯著性差異分析(P<0.05)。

2 結果與分析

2.1 微生物指標結果分析

2.1.1 不同ε-聚賴氨酸添加量對鮮榨血橙汁的抑菌效果

據不完全統計，我國每年被其他國家扣留不準入境的果蔬制品主要原因是微生物污染。鮮榨果汁微生物污染多發生于在原料處理階段、加工制作階段。有研究表明,因為加工制作環境不同導致市售鮮榨橙汁菌落總數、霉菌及酵母菌計數是家庭自制鮮榨橙汁的幾十倍到幾百倍[14]。鮮榨血橙汁飲料只有微生物指標符合相關標準，才能有效避免由于微生物所引起的食源性中毒。由圖1可知：在6 d貯藏期內，當ε-聚賴氨酸添加量為200 μg/mL及400 μg/mL的鮮榨血橙汁菌落總數符合《食品安全國家標準 飲料》(GB 7101—2015)[15]所給出≤ 104CFU/mL的微生物限量。根據《食品添加劑使用標準》[6]中給出ε-聚賴氨酸的200 μg/mL的添加限量及實驗結果，建議本實驗中ε-聚賴氨酸的最適添加量為200 μg/mL。

圖1 不同ε-聚賴氨酸添加量的鮮榨血橙汁在冷藏過程中的菌落總數Fig.1 The total number of colonies in freshly squeezed blood orange juice with different ε-PL addition during cold storage

2.1.2 ε-聚賴氨酸對鮮榨血橙汁中優勢腐敗菌的最小抑菌濃度及生長曲線的影響

橙汁中常出現的微生物主要有嗜酸耐熱菌(酸土脂環酸芽孢桿菌)[16]、酵母菌(釀酒酵母)[17]等。如表1所示,ε-聚賴氨酸對釀酒酵母、酸土脂環酸芽孢桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌都有良好的抑制作用。ε-聚賴氨酸對4株實驗菌的MIC分別為200、128、128、8 μg/mL。由于酸土脂環酸芽孢桿菌、釀酒酵母是鮮榨血橙汁中的主要優勢腐敗微生物，所以本文選擇酸土脂環酸芽孢桿菌、釀酒酵母進行后續實驗。由圖2可知,ε-聚賴氨酸使酸土脂環酸芽孢桿菌、釀酒酵母的生長速率減小，表現為生長對數期菌懸液吸光度值增長速度減緩。高濃度的ε-聚賴氨酸可以完全抑制酸土脂環酸芽孢桿菌、釀酒酵母24 h內的生長。根據不同ε-聚賴氨酸添加量對鮮榨血橙汁抑菌效果及對優勢腐敗菌的最小抑菌濃度結果，可以認為ε-聚賴氨酸最適添加量為200 μg/mL。

表1 ε-聚賴氨酸對鮮榨血橙汁中優勢腐敗菌的最小抑菌濃度 單位：μg/mL

2.1.3 鮮榨血橙汁在貯藏期間酵母菌、霉菌及菌落總數變化

鮮榨血橙汁是一種具有原料血橙的典型感官特征的水果原汁，由于其pH值一般在2.4～4.2，大部分微生物在這種條件下無法生長，因此酸性橙汁具有天然防腐之效。但隨著貯藏期的延長，耐高酸的微生物仍會滋生。其中，酸土脂環酸芽孢桿菌會使橙汁出現異味、變酸和渾濁等不良感官體驗；酵母菌可以在高酸、高糖的條件下發酵橙汁使其出現產氣漲瓶等現象；部分霉菌則需要在有氧條件下生長，橙汁長霉主要表現為包裝容器瓶口發黑發霉。如圖3所示,在15 d內，對照組的菌落總數、霉菌數在第6天、第9天時分別達到2×104CFU/mL、80 CFU/mL；雖酵母菌數≤20 CFU/mL，但此時對照組已經不符合國家所給出的衛生標準；而實驗組的菌落總數≤ 104CFU/mL、酵母菌及霉菌≤ 20 CFU/mL[15]。第18天時，實驗組的菌落總數、酵母菌均未超過規定微生物限量；但霉菌數已經超過微生物限量。而對照組的菌落總數急劇增加主要原因是明串珠菌及乳酸菌發酵糖類所引起，使鮮榨血橙汁出現黏稠變質的現象[18]。綜上所述：本實驗以15 d為最佳貯藏期，后續實驗均在15 d內測定鮮榨血橙汁相關指標。

a-釀酒酵母；b-酸土脂環酸芽孢桿菌圖2 釀酒酵母、 酸土脂環酸芽孢桿菌在含有不同ε-聚賴氨酸添加量YPD、BAM中的生長曲線Fig.2 Growth curves of Saccharomyces cerevisiae、Alicyclobacillus acidoterrestris cultured in YPD、BAM with various addition amount of ε-PL

a-霉菌；b-酵母菌；c-菌落總數圖3 鮮榨血橙汁在貯藏期內酵母菌、霉菌、菌落總數檢測結果Fig.3 The total number of freshly squeezed blood orange juice yeast, mold and colonies during storage

2.2 理化及感官指標結果分析

2.2.1 鮮榨血橙汁在貯藏期內理化指標及色值變化

pH、可滴定酸、可溶性固形物、色差值是鮮榨血橙汁最基本的理化及感官指標。貯藏期內上述指標檢測結果如表2所示。在貯藏期內，對照組和實驗組的鮮榨血橙汁pH和可滴定酸含量均無顯著性差異(P>0.05)。這說明ε-聚賴氨酸并不會導致鮮榨血橙汁pH、可滴定酸的變化。對照組的可溶性固形物含量在貯藏期內呈現下降趨勢，而實驗組的鮮榨血橙汁基本維持在正常塔羅科血橙汁的10%～12%的可溶性固形物。由于添加ε-聚賴氨酸的血橙汁，出現了不同程度的微小顆粒。原因在于ε-聚賴氨酸為陽離子聚合物能和帶負電的果膠、蛋白質結合，破壞整體的穩定結構，導致顆粒形成[19-21]，而細小顆粒引起的渾濁使折光率升高，使得可溶性固形物含量的測定值隨著升高[22]，而這也是實驗組的可溶性固形物含量測定值相對穩定的原因。此外，色差值為最直觀的評定方法之一，表中ΔE為色差值(其中對照組為蒸餾水)，對照組的色差值在15 d時已經發生肉眼可見的明顯變化(P<0.05)，但實驗組的色差值則無明顯變化(P>0.05)，說明ε-聚賴氨酸對鮮榨血橙汁的色澤保護有一定作用[23]。

表2 鮮榨血橙汁貯藏期內pH、可滴定酸、可溶性固形物、色值的變化Table 2 Changes in pH, TA, SS and ΔE of freshly squeezed blood orange juice during storage

注：不同小寫字母表示顯著

2.2.2 鮮榨血橙汁在貯藏期內呈味物質的結果分析

用HS-SPME-GC-MS法分析得到鮮榨血橙汁呈味物質的總離子流色譜圖，呈味物質組分及相對含量見圖4和表3。塔羅科血橙汁主要呈香物質是檸檬烯、脂類與烯烴類。對照組和實驗組的鮮榨血橙汁均有檢出丁酸乙酯、己酸甲酯、己酸乙酯、己酸戊酯、香樟醇、5-十一烯等水果香氣物質[24-25]。表3中40種呈味物質中檸檬烯相對含量最高，并遠遠高于其他呈味組分，可見將血橙榨成汁后，檸檬烯仍為主要的呈味成分。酮類和萘類對鮮榨血橙汁的呈味物質有一定影響，其中環戊酮和萘分別呈薄荷香氣、香樟木氣味。在添加200 μg/mL ε-聚賴氨酸后，鮮榨血橙汁中的主要呈味物質種類和含量并無明顯變化，但在一定程度上減少了環戊酮的相對含量，說明添加ε-聚賴氨酸不會造成鮮榨血橙汁風味的異常變化并可以很好地保留鮮榨血橙汁的風味。

a-原液0 d；b-ε-聚賴氨酸0 d；c-原液15 d；d-ε-聚賴氨酸15 d圖4 鮮榨血橙汁呈味物質總離子流色譜圖Fig.4 Chromatogram of total ion chromatogram of freshly squeezed blood orange juice

2.2.3 鮮榨血橙汁在貯藏期內可溶性糖的結果分析

鮮榨血橙汁中含有豐富的葡萄糖、果糖和蔗糖。由圖5可知，對照組在貯藏15 d時，蔗糖、葡萄糖、果糖的損失率分別為58.69%、56.60%、55.14%。鮮榨血橙汁含有的大量營養成分會加快微生物的生長，正如圖3所示菌落總數達到2×104CFU/mL，霉菌計數達到50 CFU/mL以上，微生物的大量滋生導致可溶性糖迅速降解[26]。而實驗組在貯藏15 d時，蔗糖、葡萄糖、果糖的損失率分別為18.73%、3.05%、1.28%，相較于對照組可溶性糖的損失量明顯減少，說明添加ε-聚賴氨酸可以很好地降低可溶性糖的損失。這可能是因為鮮榨血橙汁中的陰離子型果膠和陽離子型ε-聚賴氨酸形成靜電復合物進而改變體系的聚集穩定性、溶解度等[27]。實驗結果表明，ε-聚賴氨酸與果膠靜電復合物不僅能夠保持ε-聚賴氨酸的抑菌活性[28-29]，而且能很好地抑制鮮榨血橙汁中的微生物生長，減少可溶性糖類的損失。利用葡萄糖等單糖作為碳源的微生物數量遠高于利用蔗糖作為碳源的微生物，ε-聚賴氨酸的廣譜抑菌性使得大部分微生物無法正常生長，表現為葡萄糖，果糖的損失量無顯著差異(P>0.05)。

表3 鮮榨血橙汁40種呈味物質Table 3 Freshly squeezed blood orange juice 40 kinds of taste substances

注：上表采用峰面積歸一化法計算統計得出

圖5 貯藏期內鮮榨血橙汁可溶性糖含量變化Fig.5 Soluble sugar content of freshly squeezed blood orange juice during storage注：同一顏色下不同小寫字母表示具有顯著性差異(P<0.05)

2.2.4 鮮榨血橙汁在貯藏期內游離氨基酸的結果分析

人體內氨基酸的穩定和適量的攝入是健康的基礎，任何一種氨基酸供應缺乏，都會影響機體的免疫系統和生理功能的運作及發揮，使機體變成更易遭受疾病的侵襲的亞健康狀態。游離氨基酸可以被人體吸收利用，鮮榨果汁可以作為一種供給氨基酸的高氨基酸食品。對鮮榨血橙汁中游離氨基酸總量測定如圖6所示，在0 d時，對照組和實驗組的鮮榨血橙汁中游離氨基酸的含量均保持在300 mg/100 mL的正常范圍。但隨著貯藏時間的延長，對照組和實驗組的鮮榨血橙汁在貯藏15 d時損失率分別達到30.15%、26.63%。相較于對照組，實驗組的鮮榨血橙汁損失量相對較低。微生物生長受到ε-聚賴氨酸抑制是減少游離氨基酸損失的主要原因[30]。鮮榨血橙汁中游離氨基酸的種類及含量在圖7中均有體現。其中，以脯氨酸為代表的中性氨基酸、天冬氨酸為代表的酸性氨基酸及以精氨酸為代表的堿性氨基酸在15 d貯藏期內呈現下降趨勢。賴氨酸作為第一限制性氨基酸，在15 d貯藏期內對照組與實驗組的鮮榨血橙汁賴氨酸的含量基本維持10 mg/100 mL左右，呈現基本不變的趨勢。但實驗組的鮮榨血橙汁中含有ε-聚賴氨酸，而ε-聚賴氨酸只有在被人體攝入后可以分解為賴氨酸，更多地提供人攝入ε-聚賴氨酸的渠道。

圖6 鮮榨血橙汁在貯藏期內游離氨基酸總含量Fig.6 Total free amino acid content of freshly squeezed blood orange juice during storage

a-對照組與試驗組貯藏0 d；b-對照組與實驗組貯藏5 d；c-對照組與試驗組貯藏10 d；d-對照組與試驗組貯藏15 d圖7 鮮榨血橙汁在貯藏期內17種游離氨基酸含量Fig.7 17 free amino acids content of freshly squeezed blood orange juice during storage

3 結論

本文主要研究了4 ℃貯藏條件下，添加200 μg/mL ε-聚賴氨酸的鮮榨血橙汁的貯藏期以及貯藏期內色澤、風味物質、pH、可滴定酸、可溶性固形物、游離氨基酸、可溶性糖的變化。與未添加ε-聚賴氨酸相比，添加200 μg/mL ε-聚賴氨酸的鮮榨血橙汁具有更長的貯藏期及相對穩定的貯藏品質，主要原因是ε-聚賴氨酸通過抑制鮮榨血橙汁冷藏過程中的微生物生長，進而降低由于微生物導致的可溶性糖發酵、游離氨基酸降解等品質劣化[31]。ε-聚賴氨酸作為一種具有廣譜抑菌性的天然微生物防腐劑被允許使用在果蔬汁制品中，且其對鮮榨血橙汁貯藏品質的穩定有著重要作用，表明ε-聚賴氨酸在鮮榨果汁中具有良好的應用前景。