不同微生物液態發酵對蠶豆蛋白營養價值及功能特性的影響

劉慧菊，韓麗娟,2*，喬楊波，王樹林，焦迎春，葉英

1(青海大學 農牧學院，青海 西寧, 810016)2(青海大學,省部共建三江源生態與高原農牧業國家重點實驗室，青海 西寧, 810016)

蠶豆(ViciaFabaL.)，又名胡豆，羅漢豆等，一年生草本植物。我國作為最大的蠶豆種植國，在甘肅、青海、云南等地均有分布，青海省主要分布于門源縣、湟中縣、大通縣、共和縣、互助縣等灌溉農業區[1]。蠶豆作為青海傳統農作物，由于青海陽光日照時間長，晝夜溫差大，生產的蠶豆以粒大蟲少、顆粒飽滿[2]。蠶豆中存在多種生物活性物質，具有提高人體免疫力、抗癌、降血壓、抗氧化等作用[3-5]，因此蠶豆具有較高的營養價值及保健功能[6-7]。

蠶豆蛋白作為一種植物蛋白，其含量可達25%～30%[8]，僅次于大豆，是良好的蛋白質營養源，可預防腦溢血、糖尿病以及動脈粥樣化等疾病[9]。在埃及和摩洛哥人們將蠶豆作為蛋白質的重要來源，伊朗人們將其作為物美價廉的兒童高蛋白食品[10]。而對于大分子植物蛋白而言，提高其營養價值及吸收率最佳的方法是發酵，研究表明，發酵豆制品的抗氧化活性明顯高于非發酵制品[11]。發酵法利用微生物分泌的蛋白酶水解蛋白質，能夠優化每一種植物源的質構和營養成分組成，促進健康發酵植物基發展，植物蛋白的營養價值及生物活性明顯提升。

發酵植物蛋白及發酵植物基也是目前獲得新型食品源的重要手段[12-14]。但是植物微生物發酵法存在某些不足之處，如微生物發酵及代謝過程復雜，目前微生物自身的復合酶系的作用機理尚未完全揭示，產物難以控制，另外，發酵體系中的原輔料成分較多，造成產物的分離純化較為困難等問題，未來可考慮研發精確發酵控制技術，精簡發酵過程，從而實現高效、精確制備。本試驗目的在于考察幾種微生物對蠶豆籽液態發酵后的營養成分及功能特性變化，以期為后續精準化發酵制備活性多肽及精準制備高營養蠶豆粉奠定基礎研究數據。本研究采用植物乳桿菌，枯草芽孢桿菌，黑曲霉對青海當地蠶豆果實進行液態發酵，對發酵前后脫脂蠶豆粉中理化性質指標及功能特性予以比較，同時就脫脂蠶豆粉發酵液對體外自由基清除能力予以探討，挑選出最適宜蠶豆粉液態發酵的菌種，以期提高青海農牧產品高值化利用及其綜合利用。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

蠶豆，產自青海西寧；福林酚試劑，北京索萊寶科技有限公司；1.1-二苯基-2-苦基肼/DPPH，南京奧多福尼生物科技有限公司；ABTS，北京酷爾化學科技有限公司；瓊脂、葡萄糖、馬鈴薯、雙縮脲試劑、考馬斯亮藍G-250、標準牛血清白蛋白、酪氨酸標準品、三氯乙酸、氯仿，天津市河東區紅巖試劑廠；MRS肉湯，北京澳博星生物科技有限責任公司；營養肉湯，青島高科技工業園海博生物技術有限公司；黑曲霉、枯草芽孢桿菌，中國工業微生物菌種保藏中心；植物乳桿菌，中國農業微生物菌種保藏中心。

1.1.2 儀器與設備

HH-4S型數顯恒溫水浴鍋，江蘇省金壇市友聯儀器研究所；KC-130型小型粉碎機，北京開創同和科技發展有限公司；UV-2600型紫外可見分光光度計，島津企業管理有限公司；101-3AB型烘箱，北京中興偉業儀器有限公司；H/T16MM型臺式高速離心機，湖南赫西儀器裝備有限公司；YM-75型立式壓力蒸汽滅菌鍋，上海三申醫療機械有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 脫脂蠶豆粉的制備

準確稱取干蠶豆粉100 g于500 mL的錐形瓶中，加入300 mL石油醚，在40℃條件下水浴3 h，過濾后重復2次，在室溫下晾至石油醚揮發完，即得脫脂蠶豆粉。

1.2.2 菌種活化與擴大培養及發酵菌液制備

1.2.2.1 菌種活化

將枯草芽孢桿菌、黑曲霉菌和植物乳桿菌參考張鵬飛[12]的方法進行活化。

1.2.2.2 發酵菌液制備

將擴大培養的1 mL菌液接種于相應液體培養基中，在相應最適條件下，按照測得的菌種生長對數期時間培養，制成發酵菌液。

1.2.3 液態發酵脫脂蠶豆粉

稱取脫脂蠶豆粉20 g于錐形瓶中，加65℃左右的滅菌蒸餾水100 mL，攪拌均勻，采用紫外燈照射30 min后，加入6 mL已培養好的發酵菌液，按表1所示條件進行48 h發酵后取樣，存于冰箱。

表1 脫脂蠶豆粉液態發酵條件Table 1 Liquid fermentation conditions of defatted broad bean powder

1.2.4 液態發酵前后營養價值相關指標測定

1.2.4.1 可溶性蛋白含量測定

采用考馬斯亮藍法測定可溶性蛋白質的含量[15]。

1.2.4.2 粗蛋白和酸溶蛋白測定

參照GB/T 6432—2018用凱氏定氮法測定粗蛋白含量；參照GB/T 22492—2008測定酸溶蛋白質含量。

1.2.4.3 多肽含量測定

參考陳學紅等[16]的方法并稍作修改，測定發酵液中多肽含量。

1.2.4.4 發酵前后脫脂蠶豆粉中氨基酸含量測定

氨基酸含量用氨基酸自動分析儀測定，按國標GB/T 5009.124—2003進行測定。

1.2.4.5 蛋白酶活性的測定

采用福林酚法測定發酵液中蛋白酶活[17]。

1.2.5 發酵前后蠶豆蛋白抗氧化活性比較

1.2.5.1 ABTS自由基清除率的測定

將發酵液中可溶性蛋白的濃度配置成：10.5、21、42、84、168 μg/mL，利用ABTS法[18]測定發酵液中蛋白清除ABTS自由基的能力(公式(1))。

(1)

式中：Ac為乙醇代替樣品溶液測定的吸光值；As為樣品加ABTS后測定的吸光值。

1.2.5.2 DPPH自由基清除率的測定

參考王畢妮等[19]的方法，并略作修改，將發酵液中可溶性蛋白的質量濃度配置成：10.5、21、42、84、168 μg/mL，取DPPH溶液2 mL加入不同蛋白濃度的發酵液各4 mL，放置1 h后測定517 nm處的吸光度值。測定發酵液中蛋白清除DPPH自由基的能力(公式(2))。

(2)

式中：Ac為DPPH溶液測定的吸光值；As為樣品加DPPH后測定的吸光值。

1.2.6 液態發酵前后功能特性相關指標測定

1.2.6.1 蛋白粉起泡性與泡沫穩定性的測定

參考李雪琴等[20]的方法測定蛋白粉起泡性及泡沫穩定性。

1.2.6.2 蛋白粉吸水性和吸油性的測定

參考李靜娟等[21]的方法測定蛋白粉吸水性及吸油性。

1.2.6.3 蛋白粉持水性和持油性的測定

參考李述剛[22]的方法測定蛋白粉持水性和持油性。

1.2.7 試驗數據分析

2 結果與分析

2.1 最佳接種時間確定

本試驗采用比濁法，分別測定了黑曲霉，枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌種子液中的菌體濃度，繪制生長曲線。由圖1可知，枯草芽孢桿菌(圖1-A)，黑曲霉(圖1-B)，植物乳桿菌(圖1-C)的對數期分別為2～8 h，8～16 h，10～16 h，所以種子液接入蠶豆粉中的最佳培養時間為8、16和16 h，此時為各菌種發酵液最佳接種時間。

2.2 不同菌種液態發酵對蠶豆蛋白營養價值的影響

2.2.1 不同微生物發酵前后多肽含量變化結果與分析

不同微生物發酵前后多肽含量變化試驗結果如圖2所示。未發酵脫脂蠶豆粉中含有一定含量的多肽。在油脂天然提取產物中，含有一定量的蛋白質，推測前期對蠶豆粉進行脫脂處理，在一定溫度下采用石油醚進行脫脂操作可能使蠶豆粉中與油脂所結合部分蛋白質發生降解及分離，所以，在脫脂蠶豆粉中含有一定量的多肽成分。其次，由圖2可知，經微生物發酵后蠶豆粉多肽含量均有一定量的增加；并且不同菌種發酵后多肽含量有所不同，其中植物乳桿菌最為明顯(P<0.05)，多肽得率達到1.46%，與未處理的蠶豆粉相比，其增幅高達71.65%(P<0.01)，效果極其明顯。因此，通過微生物的液態發酵可提高蠶豆蛋白發酵液的多肽得率，促進蛋白的消化吸收，提高其營養價值。

A-枯草芽孢桿菌;B-黑曲霉;C-植物乳桿菌圖1 生長曲線(X±SD, n=3)Fig.1 The growth curve

圖2 不同微生物發酵前后的肽含量變化Fig.2 The change of peptide content before and after fermentation by differert microoganisms

經過48 h的發酵后，枯草芽孢桿菌和植物乳桿菌作為細菌會處于延滯期或者衰亡期，產生并積累大量的次級代謝產物，如淀粉酶，蛋白酶，纖維素酶、脂肪酶、果膠酶等[23]，這些次級產物將進一步將蠶豆蛋白進行分解為小分子的蠶豆多肽和游離的氨基酸，從而導致氨基酸和多肽積累，但黑曲霉作為霉菌生長緩慢，可能還未到達其積累次級代謝產物的最佳時間，因而試驗結果顯示，經植物乳桿菌發酵后發酵液中多肽得率顯著提高(P<0.05)，增幅達到了71.65%，并且高于枯草芽孢桿菌和黑曲霉。

2.2.2 不同微生物發酵前后粗蛋白與酸溶蛋白變化結果與分析

從表2可知，經過3種不同菌種發酵后，脫脂蠶豆粉中粗蛋白含量均顯著下降(P<0.05)，并且植物乳桿菌發酵后的蠶豆粉中粗蛋白含量明顯低于黑曲霉和枯草芽孢桿菌(P<0.05)；酸溶蛋白含量均顯著提高(P<0.01)，其中以黑曲霉的變化最為顯著，酸溶蛋白增加65.06%。

表2 不同微生物發酵前后粗蛋白與酸溶蛋白變化結果與分析 單位：%(相對百分含量)

注：同行數據中小寫字母不同表示差異顯著(*P<0.05)

在本試驗的發酵過程中，菌種在生長和繁殖過程中需要利用脫脂蠶豆粉中的所含的營養物質作為自身生長的營養來源，發酵后脫脂蠶豆粉中的粗蛋白含量減少，但由于菌種的自身差異導致各菌種的生長代謝能力、對脫脂蠶豆粉的適應和利用能力不同，經過不同菌種發酵后發酵產物中粗蛋白也存在差異，如植物乳桿菌相對于枯草芽孢桿菌和黑曲霉，其粗蛋白含量下降幅度較大，且下降幅度明顯大于枯草芽孢桿菌和黑曲霉(P<0.05)，其原因可能是植物乳桿菌的生長繁殖能力較強，降解大分子蛋白質的速度較快，并且經過48 h的發酵后，在發酵后期產生了一定的反饋抑制，從而導致植物乳桿菌的粗蛋白顯著少于黑曲霉。

本試驗結果顯示經3種不同微生物液態發酵后，脫脂蠶豆粉中酸溶蛋白黑曲霉顯著高于枯草芽孢桿菌(P<0.05)，枯草芽孢桿菌高于植物乳桿菌(P<0.05)。此結果與發酵液中多肽得率結果并不一致。可能是不同的微生物在生長繁殖過程中產生的蛋白酶種類不同，蠶豆蛋白被剪切的位置以及剪切的程度不同，使得不同微生物發酵后，生成的游離氨基酸種類不同，而氨基酸會因為R基的不同，水溶性也不同。

2.2.3 不同微生物發酵前后蠶豆粉中必需氨基酸評價

脫脂蠶豆粉經3種不同菌種48 h發酵后，其必需氨基酸測定結果如表3所示。脫脂蠶豆粉共檢出17種氨基酸，其中除色氨酸缺失外，包含人體所需的其他7種必需氨基酸，氨基酸總量(total amino acid，TAA)達到30.27%，必需氨基酸含量(esenital amino acid，EAA)高達9.69%，占氨基酸總含量的34.01%。脫脂蠶豆粉中谷氨酸(Glu)的含量顯著高于其他氨基酸，達到了5.99%。此外，經過枯草芽孢桿菌、黑曲霉及植物乳桿菌3種不同的微生物發酵后，各種氨基酸的含量均發生了顯著性變化(P<0.01)，與未發酵的脫脂蠶豆粉相比，經植物乳桿菌發酵后，精氨酸(Arg)、脯氨酸(Pro)、胱氨酸(Cys)、異亮氨酸(Ile)的含量的變化最大，其中胱氨酸(Cys)和異亮氨酸(Ile)的含量是未經發酵的脫脂蠶豆粉中相應氨基酸的 2.6倍(P<0.01)和 2.5倍(P<0.01)，精氨酸(Arg)和脯氨酸(Pro)的含量分別提高了80%(P<0.01)和90%(P<0.01)；經黑曲霉發酵后，胱氨酸(Cys)含量是未經發酵的脫脂蠶豆粉的6.4倍。分析經不同微生物液態發酵后氨基酸組成發生較大差異的原因，可能是不同的微生物在生長繁殖過程中產生的蛋白酶種類不同，蠶豆蛋白被剪切的位置以及剪切的程度不同，使得不同的微生物發酵后，生成的游離氨基酸種類不同[24-25]。

現代營養學者研究認為[26]，氨基酸不足和過剩都會影響蛋白質的營養價值。依據WHO/FAO提出的氨基酸平衡理論，計算得出樣品中EAA含量和(amino acid acroe,AAS)，結果如表4所示。與WHO/FAO推薦的人體必需氨基酸相比，除色氨酸之外，其余必需氨基酸含量相互較為平衡，尤其經不同微生物發酵后，各類氨基酸的EAA和AAS值都不同程度得到提升，并且更加符合必需氨基酸模式。此外，脫脂蠶豆粉中含有大多數谷類蛋白質中所缺乏的限制性氨基酸—賴氨酸，尤其經黑曲霉發酵后，其賴氨酸AAS評分高達114.68，較未處理組呈現顯著性差異(P<0.05)。因此通過微生物發酵后可以有效提高蛋白質的吸收利用率和應用價值。

表3 不同微生物發酵前后必需氨基酸含量結果 單位：%

注：與未處理比較，*表示P<0.05，**表示P<0.01

表4 發酵前后必需氨基酸組成與WHO/FAO建議值的對比Table 4 Comparison of essential amino acid composition before and after fermentation with recommendedvalues of WHO/FAO

2.2.4 不同微生物發酵后蛋白酶活力變化

由于不同微生物在發酵過程中產生的酶不盡相同，不同微生物發酵后蛋白酶活力變化結果見表5。從表5中可知，在相同條件下，3種微生物對脫脂蠶豆粉進行液態發酵，都能產生一定量的蛋白酶，且具有良好的降解蠶豆蛋白質的作用，酶活力大小依次為：枯草芽孢桿菌<黑曲霉<植物乳桿菌。說明在相同的條件下發酵，相等的時間內植物乳桿菌將分解更多的脫脂蠶豆粉。

表5 不同微生物發酵后蛋白酶活力測定Table 5 Protease activity by fermentation of different

2.3 不同微生物發酵前后蠶豆蛋白抗氧化活性結果與分析

對于蛋白質生物大分子而言，許多具有抗氧化性氨基酸和疏水性氨基酸被包埋與內部，無法起到抗氧化的作用，但是通過微生物的發酵可將其中的氨基酸暴露出來，從而起到抗氧化的作用。所以本次試驗用ABTS自由基、DPPH自由基清除率來評價不同微生物發酵后發酵液的體外抗氧化活性。

2.3.1 ABTS自由基清除率的評價

比較3種微生物發酵后制得蠶豆肽對ABTS自由基清除率的差異，如圖3所示，試驗結果表明，經3種微生物發酵后的發酵液對ABTS自由基的清除率均有提高，且不同菌種對ABTS清除率的影響不同(P<0.05)，在蛋白質量濃度高于41.9 ug/mL時，對于ABTS的抑制率都顯著提升。經黑曲霉液態發酵后的發酵液對于ABTS自由基的抑制率與枯草芽孢桿菌相近，抑制率分別可達87.89%與87.65%，且都明顯高于未發酵的蠶豆粉水溶液(P<0.05)。

圖3 不同微生物發酵液對ABTS清除率對比圖Fig.3 Comparison of the removal rate of ABTS by differentmicrooganisms

2.3.2 DPPH自由基清除率的評價

比較3種微生物發酵后制得蠶豆肽對DPPH自由基清除率的差異(圖4)，蠶豆多肽對DPPH自由基亦有較強的清除作用。經3種微生物發酵后的發酵液對于DPPH的清除率均不同程度提高。但不同微生物對DPPH清除率的影響不同，其中黑曲霉發酵液的清除能力明顯低于枯草芽孢桿菌(P<0.01)和植物乳桿菌(P<0.05)；在蛋白質量濃度高于41.9 μg/mL時，植物乳桿菌發酵液的清除率最高，達到85.46%。

圖4 不同微生物發酵液對DPPH清除率對比圖Fig.4 Comparison of the removal rate of DPPH by differentmicrooganisms

2.4 不同菌種液態發酵對蠶豆蛋白功能特性的影響

2.4.1 蛋白粉起泡性與泡沫穩定性的測定結果

蠶豆粉起泡性與泡沫穩定性試驗結果如圖5所示。經不同微生物發酵后蛋白粉的起泡性都呈現增長的趨勢，起泡性大小表現為：黑曲霉>枯草芽孢桿菌>植物乳桿菌，經黑曲霉發酵后蠶豆粉的起泡性顯著增強，并且泡沫穩定性也較強于其他菌種樣品。

圖5 蠶豆蛋白起泡性與泡沫穩定性Fig.5 The foamability and stability of broad bean protein

2.4.2 蛋白粉吸水性和吸油性的測定結果

如圖6所示，樣品經發酵后吸水性有較小幅度的增長，顯著性檢驗中，其吸水性之間無顯著性差異。但蠶豆蛋白質吸油性檢驗中，不同微生物發酵后吸油性存在顯著的差異(P<0.05)。發酵后樣品吸油性均有增長，植物乳桿菌發酵后吸油性最好。

圖6 蠶豆蛋白吸水性與吸油性Fig.6 The water and oil absorbing capacity ofbroad bean protein

2.4.3 蛋白粉持水性和持油性的測定結果

如圖7所示，樣品經發酵后持水性有較小幅度的增長，但顯著性檢驗中，其持水性之間無顯著性差異。蠶豆蛋白質持油性檢驗中，不同微生物發酵后持油性存在顯著性差異(P<0.05)。發酵后樣品持油性均有增長，植物乳桿菌發酵后持油性最好，說明所選植物乳桿菌發酵有助于提高蠶豆蛋白的持油性。

圖7 蠶豆蛋白粉持水性與持油性Fig.7 The water and oil holding capacity of broadbean protein

3 結論

本文通過植物乳桿菌，枯草芽孢桿菌以及黑曲霉對脫脂蠶豆粉進行液態發酵，研究表明經不同微生物液態發酵后，蠶豆粉多肽得率、蛋白酶活力、酸溶蛋白、氨基酸含量均呈現不同程度提高，作用效果依次為黑曲霉>枯草芽孢桿菌>植物乳桿菌，且經發酵后，蠶豆粉對于ABTS自由基、DPPH自由基清除顯著增強。此外，經微生物液態發酵后蠶豆粉的功能特性也得到了一定程度提升，其中尤以植物乳桿菌發酵后蠶豆粉吸水性、吸油性、持水性和持油性的提升最為明顯，因此，通過微生物液態發酵可以顯著提高蠶豆粉的營養價值及功能特性，具有很好的開發前景。